專利名稱：一種腎綜合征出血熱雙價疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到一種新的漢坦病毒(Hantavirus)，以及由該病毒制備的腎綜合征出血熱的雙價疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法。
背景技術：
腎綜合征出血熱(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由漢坦病毒(Hantaviruses)引起的經(jīng)嚙齒類動物傳播的自然疫源性疾病，具有地區(qū)性、爆發(fā)性、周期性、易變性的流行特點。我國HFRS疫區(qū)已從80年代600多個縣市擴大到現(xiàn)在1300多個縣市，疫區(qū)類型亦發(fā)生改變；在國外，新型疫區(qū)也在不斷擴大和演變。人通過氣溶膠吸入、傷口、消化道等途徑感染病毒而發(fā)病。該病死亡率高，危害性大。我國是漢坦病毒感染影響最嚴重的國家，在過去十年中每年報道的HFRS病例達到25，000至60，000例，占世界發(fā)病人 數(shù)的90%以上。疫苗預防是目前唯一有效控制HFRS的手段。1978年韓國李鎬汪首先分離到HFRS病毒后，我國自1981 1982年先后從黑線姬鼠和褐家鼠體內分離到HFRS病毒，各地亦從不同動物和人體分離到許多病毒株。對HFRS疫區(qū)病毒型別進行鑒定，80年代前為漢灘型(HTN型)疫區(qū)，之后又出現(xiàn)漢城型(SE0型)且兩型并存，2003年又報道有普馬拉型(PUU型)出現(xiàn)。病毒的成功分離為疫苗的開發(fā)奠定了基本條件，我國已批準生產(chǎn)的滅活疫苗包括地鼠腎細胞疫苗(II型，SEOV, L99株)、沙鼠腎細胞疫苗(I型，HTNV, ZlO株)、純化鼠腦細胞疫苗(I型，HTNV, LRl株)三種單價疫苗和雙價(I、II型)沙鼠腎細胞疫苗相繼初步研制成功。這4種疫苗的三期臨床觀察，在防治和控制HFRS上起到了重要的作用。然而，疫苗所用病毒來自早期分離獲得，以I型HFRS疫苗毒種ZlO和LRl為例，分別分離自1982年浙江省HFRS疫區(qū)病人血清和1983年捕獲于陜西省疫區(qū)黑線姬鼠肺組織，是否作為疫苗株病毒合適，并未證明，病毒的遺傳背景亦不清楚，也并非針對近年來HFRS流行的優(yōu)勢疫苗株。漢坦病毒屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)三個單股負鏈的RNA組成，分別編碼RNA多聚酶，兩個包膜蛋白(Gl和G2)和核蛋白(N)，其中以M基因所承受的來自HV感染宿主的免疫壓力最大，變異最顯著。在不同型的漢坦病毒中，其S片段3' NCR區(qū)核苷酸序列除手柄狀部分外，其余部分差異亦較大。漢坦病毒極易發(fā)生變異，存在不同型別及亞型之間。若變異引發(fā)病毒毒力即致病性的改變，則現(xiàn)有疫苗可能失去保護性效果，導致新疫區(qū)的不斷出現(xiàn)和擴大，并出現(xiàn)HFRS的爆發(fā)流行。此外，以上這些疫苗株生物特性的分子學基礎研究，如基因組測定、分析和與國內毒株親緣關系的比較等，都是在疫苗臨床使用后才進行。可以說明這些疫苗株的代表性不強，因此，要控制HFRS流行就必須對HFRS流行與演變的規(guī)律及本質有足夠的認識，同時必須明確流行高峰期的優(yōu)勢流行病毒株的本質，才能制備出更具有針對性、預防效果更好的疫苗。本發(fā)明在獲得湖北地區(qū)1985 2000年HFRS患者體內漢坦病毒的M基因特征的基礎上，擬用RT-PCR、核苷酸測序等技術進一步分析長江中下游地區(qū)1985 2009年間鼠源、螨源及人源漢坦病毒的S、M片段高變區(qū)基因變異頻率與變異位點，從而明確流行高峰期的優(yōu)勢流行病毒株的特征。在此基礎上，分離得到流行高峰期的優(yōu)勢流行病毒株并大規(guī)模培養(yǎng)，最終獲得這一地區(qū)具有代表性腎綜合征出血熱疫苗毒株。然后對病毒進行滅活、超濾和濃縮，經(jīng)層析純化，鑒定獲得滅活疫苗，并進行疫苗原液、疫苗的效力和其他常規(guī)項目的檢測以及疫苗免疫原性、安全性和保護性的評價，完成疫苗生產(chǎn)的臨床前研究。本發(fā)明可為制訂HFRS的防治方案，控制該病的流行和漢坦病毒疫苗的研制策略提供新的理論依據(jù)
發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種新型漢坦病毒，以及由該病毒制備滅活疫苗，用于腎綜合征出血熱的防治。本發(fā)明的另一目的在于提供一種包括上述漢坦病毒的雙價疫苗。本發(fā)明的再一個目的在于提供上述疫苗的制備方法。本發(fā)明人通過采集自長江中下游地區(qū)1985 2009年鼠源、螨源、人源的漢坦病毒標本，對其S、M基因進行核苷酸序列分析，獲得漢坦病毒基因變異情況，進一步篩選得到優(yōu)勢病毒疫苗株HV004，該病毒已于2011年12月7日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱〇6皿0，地址武漢市武昌珞珈山郵編430072)保藏，分類命名為漢坦病毒屬(Hantavirus)漢灘型,保藏號為CCTCC No. V201139。進而本發(fā)明提供一種由上述病毒制得的腎綜合征出血熱疫苗。該疫苗可以是由上述病毒滅活制得，此外還可以加入佐劑，例如鋁佐劑，以增強免疫效果。此外，上述病毒還可以與其他病毒制成雙價或多價疫苗，例如，將上述病毒HV004與漢坦病毒Hubei- I株制備成雙價疫苗。本發(fā)明疫苗可以按照常規(guī)方法制備獲得，例如，將所述病毒在宿主細胞或組織中增值，收獲病毒液后，經(jīng)滅活純化處理，即得。以單價疫苗為例，將上述病毒在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，收獲發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，經(jīng)滅活純化處理，即得。具體地，將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白(終濃度為lmg/ml)，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH) 3膠體佐劑，漢坦病毒按抗原量為I :128稀釋，總蛋白含量不超過40呢/劑。雙價疫苗的制備和單價疫苗類似，在獲得病毒液時，將兩者混合，再繼續(xù)處理即可。具體地，將上述兩種病毒分別在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，分別將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白(終濃度為lmg/ml )，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH)3膠體佐劑，漢坦病毒按抗原量為I :128稀釋，總蛋白含量不超過401^/劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(I)本發(fā)明通過對長江中下游地區(qū)1985 2009年鼠源、螨源、人源的漢坦病毒標本的S、M基因進行核苷酸序列分析，在此基礎上，得到了這一地基因特征。本發(fā)明中所確立的漢坦病毒疫苗株是在已有毒株序列的基礎上得到的毒株，具有代表性。(2)本發(fā)明通過對病毒基因的分析，確立了長江中下游地區(qū)漢坦病毒優(yōu)勢流行株，使疫苗株病毒的選擇較傳統(tǒng)疫苗株更有針對性。
(3)本發(fā)明中對優(yōu)勢流行株進行分離培養(yǎng)，在乳鼠體內傳代增毒、純化，β_丙內酯滅活，最終獲得了適用于HFRS預防的疫苗。


圖I顯示的是ELISA檢測不同組血清特異性IgG抗體的水平；
圖2顯示的是不同組的小鼠脾臟細胞刺激率； 圖3、4顯示的是流式檢測胞內Y干擾素染色結果。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的生化試劑為市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I漢坦病毒(Hantavirus) HV004的獲得及鑒定 I、病毒采集及測序
Cl)收集長江中下游地區(qū)1985 2009年鼠肺組織、螨媒懸液、HFRS患者血標本。(2)對這一地區(qū)鼠肺組織、螨媒懸液、HFRS患者血標本進行間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence, IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, EILSA)、(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測，篩選鼠源、螨源、人源的病毒抗原陽性標本。其中RT-PCR篩選過程如下用病毒特異性RNA提取試劑盒(Promega)提取標本總RNA ;核酸分析儀檢測RNA含量，所有標本RNA 0D260/280彡I. 9，后取50ng RNA進行RT-PCR反應；使用隨機引物逆轉錄，其反應條件為37°C反應60min，93°C 5min終止反應，迅速置冰上冷卻3min ；PCR使用設計的新型漢坦病毒通用引物(序列5’ -3’ GATTGAAGATATTGAGTCACC, Pl/5’ -3’ GTTGTATCCCCATTGATTGTG, P2)，其反應條件為 94°C 預變性 3min，94°C 變性 Imin，50° C復性lmin，72°C延伸Imin，循環(huán)35次，最后72° C延伸5min ；1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察病毒核酸擴增結果。切下含目的片段的凝膠，采用Omega gel Extraction kit (Omega)回收DNA，純化后的DNA溶于ddH20中。純化后的PCR產(chǎn)物的測序交由INVITR0GEN公司(上海)完成,序列測定引物為PCR引物。2、確定漢坦病毒優(yōu)勢毒株
已完成624份人源性，896份鼠源性樣本，3829份螨媒標本的RNA的提取和陽性標本的篩選工作。獲得人源性漢坦病毒陽性標本537份，鼠源性漢坦病毒陽性標本58份，從螨體內檢測出病毒RNA。詳細內容如下
(I)從HFRS患者血清中共篩選出陽性標本從624份HFRS患者血清中共篩選出陽性標本537份，獲得漢坦病毒S、M片段序列。完成了 166份長江中游地區(qū)HFRS患者陽性樣本的分型檢測；獲得了 74份人源樣本的序列結果。對現(xiàn)有的病毒基因同源性分析，結果顯示，長江中下游地區(qū)HFRS爆發(fā)的病毒既有HTN型病毒，也有SEO型病毒。前者以與76-118株同源為主，后者以與Z37株相似的病毒為主。(2)鼠樣本中篩選出陽性樣本從687性樣本中篩選出陽性樣本45陽性率6. 5%。獲得了 206份鼠源樣本的測序結果，并進行病毒與宿主基因同源性分析，結果顯示，目前長江中下游地區(qū)漢坦病毒的流行仍以SEO型和HTN型為主，并且有明顯的地區(qū)聚集性。對病毒進行進化樹分析發(fā)現(xiàn)可將我們獲得的SEO型病毒分為三個進化分支，他們都與Z37株有較高的同源性高達96% 100%。HTN型漢坦病毒基因變化更加多樣，它們與Q32和76-118株有較高的同源性分別為83. 9^84. 4%和89. (T89. 2 %。從鼠體內分離漢坦病毒S、M基因序列系統(tǒng)進化樹分析。3、優(yōu)勢病毒疫苗株分離及鑒定
(I)無菌條件下取漢坦病毒 的陽性標本黑線姬鼠鼠肺約0.3 g，加3 m I研磨液(含1% PS的DMEM)在冰上研磨成I :10的懸液。吸取0. 02ml懸液，注射到2 3日齡的BALB/C鼠腦內；正常飼養(yǎng)21天或發(fā)病后無菌取鼠的心、腦、肺、腎組織，用RT-PCR檢測為陽性后，用腦組織勻漿液重新接到新生乳鼠腦內，以這樣的方法進行8代擴增，取心、腦、肺、腎等組織于_80°C保存。(2)同時將b步驟中含有病毒組織按培養(yǎng)基原液(I :1000)勻漿后取IOOii L接種在Vero E6細胞，在Vero E6細胞上盲傳3代后，通過IFA檢測為陽性，核酸鑒定亦為HV004
基因型。(3)對HV004病毒株序列測定和系統(tǒng)進化分析
對部分S片611nt (558-1168nt)以及M片段1353nt (51_1404nt)進行了擴增，并進行了同源性分析。M片段與其他HTN型漢坦病毒的堿基以及推斷的氨基酸同源性分別為82. 8%-90. 6%和92. 6%_97. 6%，而與其他型別的漢坦病毒的堿基同源性低于70%。通過部分S片段的分析，也可得到相似的結果。S、M兩個基因的進化分枝均為一個新的獨立分枝，即HTNV-#10。以上結果說明該分離的病毒與HTN型漢坦病毒的同源性更高，屬HTNV型漢坦病毒。分析HV004的分子特性，以及它能在Veix) E6細胞和乳鼠體內傳代增毒，說明HV004可適用于制備腎綜合征出血熱滅活疫苗。該病毒已于2011年12月7日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CGMCCJia :武漢市武昌珞珈山郵編430072)保藏，分類命名為漢坦病毒(Hantavirus) HV004，保藏號為 CCTCC No. v201139。實施例2病毒疫苗的制備
I、單價疫苗的制備
(I)將HV004經(jīng)BALB/C乳鼠腦組織連續(xù)傳8代，收獲發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，加硫酸魚精蛋白(終濃度為lmg/ml )，初步去除組織DNA，外源DNA含量不大于IOng/劑量。(2)經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，純化病毒顆粒。病毒滴度為6. 5 lgCCID50/ml ;細菌檢查和支原體檢查為陰性，采用IFA法測定病毒滴度為I :1024。(3)用 2%V/V HEPES lmol/L pH7. 5 和 0. 14%W/V NaHC03 在 4°C調純化病毒原液pH至7. 4，逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000。滅活24h，將滅活的病毒液再經(jīng)37°C水解2小時，置2 8°C保存，應不超過30日(15日)。同時做病毒毒力回復實驗為陰性。(4)測定蛋白含量彡200ug/ml，ELISA測定抗原量為I :4096。(5)漢坦病毒按抗原量為I :128稀釋將高壓滅菌的Al (OH) 3按10%比例加入濃縮、純化后的病毒液中，并按0. 02% (W/V)的比例加入柳硫汞制備得Al (OH)3佐劑滅活疫苗。且總蛋白含量不超過40呢/劑。
2、多價疫苗的制備
方法同單價疫苗的制備，具體如下
(I) II型病毒株Hubei- I株(SE0型)的制備時同HV004病毒株。(2)病毒滴定病毒滴度為6. 5 lgCCID50/ml ;細菌檢查和支原體檢查為陰性，采用IFA法測定病毒抗原為I :1024。(3)用 2%V/V HEPES lmol/L ρΗ7· 5 和 O. 14%W/V NaHC03 在 4°C調純化病毒原液pH至7. 4，逐滴加入10%W /V BPL，使其最終濃度為1/4000。滅活24h，將滅活的病毒液再經(jīng)37°C水解2小時，置2 8°C保存，應不超過30日(15日)。同時做病毒毒力回復實驗為陰性。(4)測定蛋白含量彡200ug/ml, ELISA測定抗原量為I :4096。(5)將I型和II型漢坦病毒單價原液分別按抗原量為I :128稀釋后等量混合，且總蛋白含量不超過4(^g/劑含量10%A1 (OH) 3佐劑即為疫苗。實施例3動物實驗
以下以單價疫苗為例作詳細說明
I、疫苗安全性實驗 (I)動物過敏實驗研究
取樣品10ml，同時以小牛血清作為對照，皮下接種三只豚鼠，豚鼠選用250-350g之間。每只接種lml，間隔一周后進行第二次注射，每只皮下I ml，使豚鼠致敏，致敏三周后再以相同樣品靜脈注射每只O. 5ml，觀察豚鼠無過敏性反應出現(xiàn)。(2)異常毒性實驗
異常毒性試驗應進行Balb/C和豚鼠兩種動物試驗，試驗動物應達到清潔級別。小鼠選用體重18-22g，豚鼠選用250-350g之間。注射前分別稱取小鼠和豚鼠的體重，每只小鼠O. 5ml檢品，豚鼠每只5. 0ml，觀察7天體重變化與正常組無較大差別。2、疫苗免疫性實驗
接種方法于0，7，14，21d皮下給予①正常對照組pbs組②高劑量疫苗組(10ug/ml)③中劑量疫苗組(5ug/ml)④低劑量疫苗組(2. 5ug/ml)。于第60天檢測細胞免疫和體液免疫水平
(I)ELISA檢測血清特異性IgG抗體的水平。在490nm下讀取的OD值高劑量組明顯高于PBS組且差異顯著(/7〈0. 001)，低劑量組與PBS組無明顯差異Co>0. 05)(見圖I)。(2)無菌取感小鼠脾臟常規(guī)法制備脾淋巴細胞懸液。以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為2 X 106/ml，加至96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μ /孔，每組每個樣品做六個復孔，前三個復孔每孔加入含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ ，作為對照組，后三個復孔每孔加入含5 μδ/πι1刀豆蛋白及10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ 孔，作為試驗孔。置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在終止培養(yǎng)前4小時加20 μ /孔的ΜΤΤ，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心，棄上清。每孔加100 μ 的DMS0，振蕩混勻后在酶標儀490 nm的波長下檢測其每孔的吸光度值(0D值)。脾細胞增值率用刺激率(SI)表示SI=試驗孔OD均值/對照孔OD均值。圖二所示為高劑量組SI大于PBS組(/7〈0. 01)。(3)胞內Y干擾素染色從不同免疫組動物體內取出腹股溝淋巴結和脾臟制成單細胞懸液(效應T細胞)。從同種背景的陰性對照小鼠分離脾臟細胞，感染漢坦病毒以用作靶細胞。用淋巴細胞刺激試驗和胞內r干擾素染色評價T細胞免疫應答。表一所示為不同組⑶3+⑶8+陽性T細胞百分百。*代表高劑量組⑶3+⑶8+T細胞高于PBS組(/7〈0. 05)。表I不同組⑶3+⑶8+陽性T細胞％
權利要求
1.漢坦病毒GYafliarirw1Se1S) HV004 株，其保藏號為CCTCC No. v201139。
2.權利要求I所述病毒在制備腎綜合征出血熱疫苗中的應用。
3.權利要求I所述病毒制備的疫苗。
4.根據(jù)權利要求3所述的疫苗，其包括權利要求I所述的滅活病毒HV004和佐劑。
5.ー種雙價疫苗，其包括權利要求I所述的滅活病毒HV004以及漢坦病毒Hubei- I株。
6.ー種制備權利要求3或4所述疫苗的方法，其特征在于，將權利要求I所述病毒在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，收獲8代以內發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，經(jīng)滅活純化處理，即得。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白至終濃度為lmg/ml，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL,使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH)3 膠體佐劑。
8.ー種制備權利要求5所述雙價疫苗的方法，其特征在于，將權利要求I所述病毒和分別在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，收獲發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，等量混合，經(jīng)滅活純化處理，即得。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白至終濃度為lmg/ml，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH)3 膠體佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腎綜合征出血熱疫苗及其制備方法。該疫苗是漢坦病毒(Hantaviruses)HV004株的滅活病毒，其保藏號為CCTCCNo.v201139。用該滅活病毒，可以有效防治腎綜合征出血熱(HFRS)。此外，本發(fā)明還公開了一種雙價疫苗，其包括滅活病毒HV004和漢坦病毒Hubei-Ⅰ株。實驗表明該雙價疫苗具有顯著防治HFRS的效果。本發(fā)明還提供了上述疫苗的制備方法，包括病毒的增殖以及滅活純化等步驟。本發(fā)明為HFRS的防治提供了有效途徑，對控制該病的流行具有重要作用。
文檔編號C12R1/93GK102618504SQ20111042617
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權日2011年12月19日
發(fā)明者侯煒, 凌佳馨, 劉東瀛, 劉媛媛, 張一卉, 張云, 李金林, 楊占秋, 熊海蓉, 王繼麟, 羅凡, 肖紅, 魯力 申請人:武漢大學