專利名稱：一種細(xì)腳擬青霉誘變菌株及其培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開ー種細(xì)腳擬青霉誘變菌株，為ー種新的菌株品種，本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)腳擬青霉PaeciAw ァces tenuipes (Peck) Samson是ー種常見的昆蟲病原真菌，分類上隸屬于鱗翅目半知菌亞門，絲孢綱，擬青霉屬，為高雄山蟲草的無性型。以天然冬蟲夏草做對(duì)照分析表明，細(xì)腳擬青霉的主要化學(xué)組分如留醇類、糖醇類、生物堿、有機(jī)酸類和微量元素與前者十分相似，所含氨基酸種類亦相同，但多種氨基酸含量卻高于冬蟲夏草。 藥理作用方面研究表明細(xì)腳擬青霉具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能，具有良好的藥用前景和開發(fā)價(jià)值。在本發(fā)明中，選育了一株細(xì)腳擬青霉優(yōu)良菌株，其菌絲體內(nèi)多糖、甘露醇和腺苷含量均較野生型細(xì)腳擬青霉有顯著提高，對(duì)其深入研究和廣泛應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)腳擬青霉誘變菌株，為ー種新的菌株，其菌絲體內(nèi)多糖、腺苷、甘露醇含量和野生菌相比有顯著提高。本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，適用于エ業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的細(xì)腳擬青霉誘變菌株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址 武漢武漢大學(xué)，保藏日期2011年4月28日，分類名稱細(xì)腳擬青霉N45 Paecilomyces tenuipes Samson N45 ；保藏登記號(hào)為 CCTCC NO. M 2011145。本發(fā)明所述的細(xì)腳擬青霉菌株培育方法，包括以下步驟
1)將細(xì)腳擬青霉原始菌株P(guān)aeciAw ァcestenuipes Samson Ptl96，接種于PDA斜面， M-26°C恒溫箱中培養(yǎng)3-7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為3 X IO7個(gè)/mL的孢子懸液；
2)取制備得到的孢子懸液5mL，轉(zhuǎn)入滅菌包裝袋內(nèi)進(jìn)行高壓處理。在溫度州で、壓カ 200M Pa條件下處理30min后。取高壓處理后孢子懸液于無菌蒸餾水中逐級(jí)稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)3-4天后，將菌株于96孔板保存；
3)利用平板初步篩選生長(zhǎng)迅速的菌株；
4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復(fù)蘇，傳代后沈で，150rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4天，得菌絲體，測(cè)定菌絲體干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，篩選高產(chǎn)的細(xì)腳擬青霉菌株。5)獲得的高產(chǎn)細(xì)腳擬青霉誘變菌株經(jīng)過連續(xù)傳代，培養(yǎng)條件為州で，150rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)96h，測(cè)定菌絲體干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，從而最終確定目的菌株。本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)腳擬青霉菌株的培養(yǎng)基，其特征在于是由以下藥物按重量份數(shù)比制成的葡萄糖40 g/L、牛肉膏10 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、KH2PO4 0.688 g/L、 MgSO4 · 7H20 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、VB1 0.201 g/L、VB12 0.130 g/L ； 本發(fā)明所述的細(xì)腳擬青霉誘變株的特征為
1)細(xì)腳擬青霉誘變菌株菌絲體干重及腺苷、粗多糖和甘露醇四種有效成分的含量與原始菌株相比均有明顯提高，其中，菌體體干重達(dá)15. 83g/L，較原出發(fā)菌提高了 3. 735%;腺苷含量可達(dá)0.054 g/L，較原出發(fā)菌提高了 80% ；多糖含量可達(dá)0ル42 g/L，較原出發(fā)菌提高了 44. 15% ；甘露醇含量可達(dá)2. 019 g/L，較原出發(fā)菌提高了 78.989%。2)細(xì)腳擬青霉誘變菌株經(jīng)過20次以上的連續(xù)傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明的積極效果在于誘變的細(xì)腳擬青霉新菌株經(jīng)10次以上傳代培養(yǎng)不退化， 具有遺傳穩(wěn)定性，并且胞內(nèi)多糖、腺苷和甘露醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比原始菌高出許多倍。


圖1、碳源對(duì)期望值的影響； 圖2、氮源對(duì)期望值的影響；
圖3、無機(jī)鹽對(duì)期望值的影響； 圖4、各因素間的響應(yīng)面及等高線圖； 圖5、隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)與ife相關(guān)圖； 圖6、遺傳代數(shù)與擬合值相關(guān)圖。具體實(shí)施方法
為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1 :細(xì)腳擬青霉突變株的誘變和選育方法 (1) 細(xì)腳擬青霉誘變
將細(xì)腳擬青霉原始菌株P(guān)aeciAw ァCe1S tenuipes Samson Pt 196，接種于PDA斜面，26°C 恒溫箱中培養(yǎng)5天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水1. 5mL，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為3 X IO7個(gè)/mL的孢子懸液。在無菌條件下裝入鋁箔聚丙烯袋中，封ロ。在溫度沈。C、壓カ200M 1 條件下處理30min后，取孢子懸液于無菌蒸餾水中逐級(jí)稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)4天后，將菌株于96孔板保存。用滅菌的牙簽將96孔板中菌株挑到PDA培養(yǎng)基的平板上，每板20個(gè)菌落，^TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；將生長(zhǎng)較迅速的菌落，再次挑到 PDA培養(yǎng)基中，每板10株左右，26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；將生長(zhǎng)較迅速的菌落挑到盛有 PDA培養(yǎng)基的搖瓶中復(fù)蘇5天；將菌株傳代培養(yǎng)，在盛有IOOmL PDA培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，接種細(xì)腳擬青霉誘變菌株菌懸液2mL，沈。C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4d。將誘變得到的突變菌株保存于48孔板中，離心菌絲體，5000rpm，離心lOmin，水洗一次，菌絲體鋪于平板凍干，凍干粉末稱重，粉碎，過60目篩。(2)四種有效成分的提取及含量的測(cè)定
稱取細(xì)腳擬青霉菌絲體干粉0. lg，加入5mL蒸餾水，80°C水浴浸提池，8000 g/min離心10 min，取上清測(cè)定菌絲體多糖含量。稱取細(xì)腳擬青霉菌絲體干粉0. lg，加入5mL蒸餾水，45°C水浴浸提池，8000 g/min離心10 min,取上清測(cè)定菌絲體腺苷和甘露醇含量。采用蒽銅-硫酸法測(cè)定總糖含量；DNS方法測(cè)定還原糖含量，多糖含量=總糖含量-還原糖含量；采用HPLC法測(cè)定細(xì)腳擬青霉菌絲體中腺苷含量；利用分光光度法測(cè)定甘露醇含量。(3)高產(chǎn)誘變株的篩選
從誘變的細(xì)腳擬青霉突變體中，篩選出菌絲體干重和四種有效成分含量明顯提高的優(yōu)良菌株(見表1)，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔一代測(cè)定菌株干重及三種有效成分含量，測(cè)量方法同步驟(2)，共培養(yǎng)10代，考察篩選得到高產(chǎn)誘變株的穩(wěn)定遺傳特征。表1誘變菌株四項(xiàng)指標(biāo)提高值
權(quán)利要求
1.一種細(xì)腳擬青霉誘變菌株，其保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011145。
2.培養(yǎng)權(quán)利要求1所述細(xì)腳擬青霉菌株的方法，包括以下步驟1)將細(xì)腳擬青霉原始菌株P(guān)aecilomycestenuipes Samson Ptl96，接種于PDA斜面， M-26°C恒溫箱中培養(yǎng)3-7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為3 X 107個(gè)/mL的孢子懸液；2)取制備得到的孢子懸液5mL，轉(zhuǎn)入滅菌包裝袋內(nèi)進(jìn)行高壓處理；在溫度洸で、壓カ200M Pa條件下處理30min后；取高壓處理后孢子懸液于無菌蒸餾水中逐級(jí)稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)3-4天后，將菌株于96孔板保存；3)利用平板初步篩選生長(zhǎng)迅速的菌株；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復(fù)蘇，傳代后沈で，150rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4天，得菌絲體，測(cè)定菌絲體干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，篩選高產(chǎn)的細(xì)腳擬青霉菌株；5)獲得的高產(chǎn)細(xì)腳擬青霉誘變菌株經(jīng)過連續(xù)傳代，培養(yǎng)條件為沈で，150rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)96h，測(cè)定菌絲體干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，從而最終確定目的菌株。
3.培養(yǎng)權(quán)利要求1所述細(xì)腳擬青霉菌株的培養(yǎng)基，其特征在于是由以下藥物按重量份數(shù)比制成的葡萄糖40 g/L、牛肉膏10 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、KH2PO4 0.688 g/L、 MgSO4 · 7H20 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、VB1 0.201 g/L、VB12 0.130 g/L。
全文摘要
誘變的細(xì)腳擬青霉新菌株經(jīng)10次以上傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性，并且胞內(nèi)多糖、腺苷和甘露醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比原始菌高出許多倍。
文檔編號(hào)C12N15/01GK102533567SQ20111042726
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者孟令軍, 孟慶繁, 宋佳, 杜林娜, 滕利榮, 逯家輝 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)