專利名稱：豬cd28受體，編碼其的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物基因工程領(lǐng)域，具體涉及豬CD^受體，編碼其的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國是ー個豬肉生產(chǎn)和消費大國，然而目前豬瘟、繁殖和呼吸綜合癥(藍耳病， PRRSV)等疫病嚴重流行是我國養(yǎng)豬行業(yè)面臨的最大困難，因此疫病防控成為穩(wěn)定和發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的重大問題。然而，近年來豬病普遍呈現(xiàn)多病原交叉混合感染，豬的抗病能力和疫苗的防治效果明顯降低。因此要做好疫病防控工作，需要尋找疫苗研發(fā)的新策略，或者尋求替代或輔助途徑，如培育出具有抗病性的新品種豬。然而已有的研究成果多致カ于利用特定疾病抗性基因培養(yǎng)單ー抗病特性的家畜新品種。而這種策略顯然與當前我國養(yǎng)豬業(yè)疫病多發(fā)的現(xiàn)實狀況差距太大。因此，培育出具有廣譜抗病性的新品種豬成為眾多科研人員的理想。適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)在動物抵抗病原體侵襲過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。T細胞的活化更是該反應(yīng)的重中之重。近年來的研究證明，T細胞的有效激活需要雙信號刺激。 ー是MHC-抗原肽與TCR結(jié)合產(chǎn)生的第一信號，ニ是共刺激受體，主要是CM8與其配體結(jié)合產(chǎn)生的第二信號。在正常的機體微環(huán)境下，抗原遞呈細胞遞呈出來的抗原肽往往數(shù)量較少， 其與TCR的結(jié)合不足以活化T細胞，容易造成T細胞反應(yīng)無能。而T細胞共刺激受體CM8 等提供的共刺激信號通路可以彌補較弱的TCR信號，從而激活T細胞。再者，當TCR與抗原肽的親和不足吋，往往難以活化T細胞，而足夠的共刺激信號也能起到增強TCR信號通路的作用，從而激活T細胞?？傊銐虻墓泊碳ば盘?，既可以克服TCR占有率較少的問題，還可以彌補TCR親和カ的不足。因此共刺激受體介導(dǎo)的信號能增強適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能，從而具備成為廣譜抗病基因候選的潛能。CD^受體作為共刺激受體中的典型代表，其基因序列信息和蛋白功能在人和小鼠的相關(guān)研究中，已有詳盡的描述。CD^受體是公認的T細胞起始增殖及存活的主要共刺激分子。該受體與其配體B7. 1(亦名⑶80)或B7.2(亦名⑶86)連接后，對T細胞的激活、增殖和存活都有明顯的促進作用，而且可以影響T細胞的分化方向，并上調(diào)IFN-Y等細胞因子的表達。已有研究發(fā)現(xiàn)老年人T細胞表面的⑶觀分子表達水平明顯下調(diào)，某些免疫系統(tǒng)激活滯后的病例也表現(xiàn)為CD^分子表達水平較低。因此，CD^分子的表達水平直接影響免疫系統(tǒng)的有效激活，進而影響生物個體的抗病能力。⑶觀受體對T細胞免疫反應(yīng)的建立、增強及其維持都具有重要作用，這預(yù)示著他們作為靶基因在轉(zhuǎn)基因育種研究及應(yīng)用中具有良好的前景。但是目前絕大多數(shù)共刺激分子相關(guān)研究都是基于基因敲除或者是利用抗CD^的單抗來除去或者增強共刺激信號的方式進行的。這些策略明顯不適于育種研究。再者，豬的CD^受體目前只有預(yù)測的基因序列信息被公布，其確切的編碼序列及其蛋白功能在此之前均未有報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種豬CD^受體，編碼其的基因及其應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種豬⑶觀受體，其為由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或増加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明豬⑶觀受體還包括由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加ー個或幾個氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID NO. 2所示的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。例如在非活性區(qū)段， 將第181位的絲氨酸替換為蘇氨酸，或是將第188位的谷氨酰胺缺失，或是在198位后面增加3個脯氨酸。優(yōu)選的，衍生蛋白的氨基酸序列與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的同源性可為 70%以上，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因。優(yōu)選的，本發(fā)明提供的編碼豬CD^受體的基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發(fā)明還提供的含有豬0擬8受體基因的載體、細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供所述的豬CM8受體在提高豬廣譜抗病性中的應(yīng)用。如通過制備抗豬CD^單抗來研制生物制劑，以ロ服或注射方式給藥后，該單抗與CD^受體的結(jié)合可增強 T細胞激活所需的第二信號，進而增強T細胞免疫反應(yīng)，提高豬的抗病能力。本發(fā)明還提供上述的豬CD^受體基因在培育廣譜抗病性豬中的應(yīng)用。具體方法為1)將豬CD^受體基因克隆到真核表達載體上，或通過體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得豬 CD28受體基因mRNA ；2)利用電穿孔法將制備的重組載體或mRNA導(dǎo)入豬胚胎細胞；3)獲得⑶觀表達水平上調(diào)，從而廣譜性抗病性提高的轉(zhuǎn)基因豬。本發(fā)明基于共刺激受體CD^的轉(zhuǎn)基因策略是動物育種研究的ー項新型策略。將共刺激受體CM8特異性地高表達于T細胞，可以增強T細胞在受到抗原刺激時的激活、增殖和細胞因子分泌活性，進而增強宿主后天性免疫應(yīng)答、增強疫苗免疫效果。所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)見轉(zhuǎn)基因動物個體培育成功后，在病原感染時的免疫功能及其抗病能力也將明顯提高。基于高表達CD^的策略，與培養(yǎng)單ー抗病特性的家畜新品種相比，可以更有效地地增強宿主在受到多病原交叉混合感染時的抗病能力，并提高疫苗效果。


圖1是載體pIRES-OT^HA構(gòu)成模式圖，其中CMV 巨細胞病毒(CMV)啟動子，可調(diào)控目的基因在真核細胞內(nèi)表達的啟動子；CD^ 豬CD^基因編碼區(qū)；HA 編碼ー個HA(流感病毒血細胞凝集素抗原決定簇)短肽的一段基因序列，可作為標簽來檢測所融合蛋白的表達情況；IRES 真核mRNA 5'端具有一段較短的RNA序列，能獨立地起始翻譯；EGFP 增強型綠熒光蛋白基因編碼區(qū)；SV40 是是猴空泡病毒40mRNA末端的一段多聚腺苷酸殘基，具有終止轉(zhuǎn)錄、增強RNA的穩(wěn)定性的作用。圖2是用鼠⑶觀mRNA轉(zhuǎn)染鼠T細胞后，用流式細胞術(shù)檢測其⑶觀高表達的情況。 其中A為轉(zhuǎn)染20 μ g⑶觀mRNA后，高表達⑶觀的T細胞數(shù)量增多；B為高表達⑶觀的T 細胞熒光強度增強，即平均每個T細胞表面CD^分子數(shù)量增多。圖3是用鼠CD^ mRNA轉(zhuǎn)染鼠T細胞后，在受到抗原遞呈系統(tǒng)刺激吋，細胞表面激活標志分子(Marker)表達水平上調(diào)的情況。其中A為轉(zhuǎn)染20 μ g⑶觀mRNA后，激活 marker (⑶25、⑶44和⑶69)高表達的T細胞數(shù)量增多；B為高表達激活Marker (⑶25、⑶44 和CD69)的T細胞熒光強度增強，即平均每個T細胞表面激活Marker數(shù)量增多。圖4是用鼠CD^ mRNA轉(zhuǎn)染鼠T細胞后，在受到抗原遞呈系統(tǒng)刺激吋，細胞分泌 IFN-Y的量增多，但IL-4的分泌量較未轉(zhuǎn)染⑶觀mRNA的細胞沒有明顯變化。圖5是用鼠CD^ mRNA轉(zhuǎn)染鼠T細胞后，在受到抗原遞呈系統(tǒng)刺激吋，細胞分化方向受到明顯影響。其中轉(zhuǎn)錄因子T-bet，GATA3，RORyt的上調(diào)表明更多T細胞向 ι ，Th2 和Thl7這些具有正向免疫調(diào)控作用的亞型分化，F(xiàn)oxp3因子的下調(diào)表明T細胞向Treg方向(負向調(diào)控)的分化受到抑制。圖6是豬外周血單個核細胞(PBMC)轉(zhuǎn)染pIRES-Q^8HA質(zhì)粒后，用^festern blot 方法檢測其外源蛋白表達情況。圖7是豬外周血單個核細胞(PBMC)轉(zhuǎn)染pIRES-OT^HA質(zhì)粒后在受到抗原 (PRRSV)刺激吋，其T細胞激活marker⑶25分子的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高。圖8是豬外周血單個核細胞(PBMC)轉(zhuǎn)染pIRES-OT^HA質(zhì)粒后在受到抗原 (PRRSV)刺激吋，其PBMC細胞內(nèi)IFN-Y轉(zhuǎn)錄水平明顯提高。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1^ 基因的克隆本發(fā)明以人和豬基因序列比對結(jié)果具有較高相似性為理論基礎(chǔ)，根據(jù)人的CD^ 序列設(shè)計引物，以五指山豬的cDNA為模板調(diào)取豬的CD^疑似序列。具體操作步驟為(1)通過與人類的CD^基因序列進行比對，在豬的基因組中找到相似性較高的基因片段，并據(jù)此設(shè)計引物(見表1 :P1和P2)。(2)豬外周血單個核細胞(PBMC) cDNA的提取從豬的前腔靜脈無菌采取20ml肝素鈉抗凝血，經(jīng)PBS等體積稀釋、混勻后，將其緩慢加于等體積的豬淋巴細胞分離液(天津灝翔，中國)上，水平轉(zhuǎn)子離心1800rpm，20min。之后吸取血漿下的淋巴細胞層，獲得PBMC。利用hvitrogen公司的Trizol試劑(TRIzol LSReagent)提取PBMC的總RNA，再用ABI公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FirstStrand Synthesis Kit for RT-PCR)合成豬的 cDNA。(3)以豬的cDNA為模板，利用NEB公司的phusion高保真聚合酶試劑盒擴增其 ⑶觀的疑似序列。擴增反應(yīng)體系雙蒸水，34.5μ 1 ;5 X HF buffer, 10 μ 1 ； IOmM dNTPmix, 1 μ 1 ； 25 μ M Ρ1，1μ 1 ;25μΜ Ρ2，1μ 1 ；phusion 聚合酶，0· 5 μ 1 ；cDNA,2y 1。反應(yīng)程序預(yù)變性98°C，Imin ；
5
循環(huán)(35 個)98°C，IOs ；55°C，20s ；72°C，Imin ；補充延伸72°C，IOmin0擴增所得產(chǎn)物連接到商品化克隆載體(pEASY-Blimt Simple)上，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。(4)根據(jù)步驟(3)所測得的序列信息設(shè)計5’ RACE和3’ RACE所需引物(表1 5，GSPl 和 5，GSP2 ；3，GSPl 和 3，GSP2)，利用 TAKARA 公司的試劑盒(5，-Full RACE Kit 和 3，-Full RACE Core SetVer. 2. 0)，獲取其5，和3，末端的轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(UTR)序列信息， cDNA全長序列如SEQ ID No. 1所示，該蛋白的全長氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。表1豬⑶觀基因克隆所用的引物
權(quán)利要求
1.豬CDW受體分子，其為1)由SEQID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQID NO. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加ー個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述的豬CD^受體的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在干，核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細胞。
6.權(quán)利要求1所述的豬CD^受體在提高豬廣譜抗病性中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在干，以權(quán)利要求1所述的豬CD^受體分子為免疫原，制備CD^的單克隆抗體，再制備成制劑后進行給藥，提高豬的廣譜抗病能力。
8.權(quán)利要求2或3所述的基因在培育廣譜抗病性豬中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在干，包括如下步驟1)將豬CD^受體基因克隆到真核表達載體上，或通過體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得豬CD^受體基因mRNA ；2)利用電穿孔法將制備的重組載體或mRNA導(dǎo)入豬胚胎細胞；3)獲得CD^表達水平上調(diào)，從而廣譜性抗病性提高的轉(zhuǎn)基因豬。
全文摘要
本發(fā)明提供豬CD28受體分子，其為1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼其的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。本發(fā)明提供的共刺激受體CD28特異性地高表達于T細胞，可以增強T細胞在受到抗原刺激時的激活、增殖和細胞因子分泌活性，進而增強宿主后天性免疫應(yīng)答、增強疫苗免疫效果。
文檔編號C12N15/85GK102558341SQ201110427748
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者劉賢勇, 索勛, 蘇華荔, 趙新新, 黃驍舾 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學