專利名稱：組織特異性啟動子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織特異性啟動子及其用途，特別是涉及一種光合組織特異性的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因啟動子及其用途。
背景技術(shù)：
異源DNA序列在植物宿主中的表達依賴于具有在植物宿主中起作用的可操作地連接的啟動子。啟動子序列的選擇將決定異源DNA序列在植物宿主中表達的時間和位置。 因此，當(dāng)需要在植物優(yōu)選的組織中表達時，使用組織特異性啟動子。相反，當(dāng)需要在全部植物細胞中表達時，使用組成型啟動子。例如，通過對植物基因組的遺傳操縱，使之含有與異源抗蟲基因可操作連接的組織特異性啟動子，使得抗昆蟲物質(zhì)在易感植物組織中特異地表達，可以實現(xiàn)植物對昆蟲侵襲的抗性增加。異源核苷酸序列在目標組織中的優(yōu)先表達減少了組成型啟動子在全部植物細胞中啟動異源核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所發(fā)生的植物資源消耗。
光合組織為在植物體中可以進行光合作用或潛在光合作用的部分，例如綠色葉片、葉鞘、果殼等，光合組織通過光合作用利用無機物生產(chǎn)有機物(淀粉)并且貯存能量，以使植物體獲得生長發(fā)育必需的養(yǎng)分。在某些情況下，人們希望某些重要的功能基因僅在光合組織中特異表達。例如，光合組織作為有機物(淀粉)和能量的供給者使其成為各種昆蟲的靶標，包括玉米螟、二化螟、蚜蟲、棉鈴蟲等，這些昆蟲通過多種機制對植物造成損害， 包括被昆蟲掠奪營養(yǎng)物和水分、昆蟲將病毒顆粒引入侵襲組織中并使組織對真菌侵襲易感等；因此需要有與幫助植物抵抗外部侵襲(如昆蟲、病毒、真菌、線蟲及其類似物)的異源核苷酸序列可操作連接的光合組織特異性啟動子。
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，簡稱PEPC) 基因啟動子作為光合組織特異性啟動子由Hudspeth等(Hudspeth R. L. and Grula J. W.， Plant Molecular Biology 12 :579_589，1989)從美國玉米自交品種B73中分離并進行鑒定以來，至今其相關(guān)研究甚少，且B73是美國的早期品種，與中國目前的玉米品種親緣關(guān)系較遠，因此需要來源于中國玉米品種的PEPC基因啟動子，使異源核苷酸序列能夠在光合組織中高效特異表達。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種組織特異性啟動子及其用途，即新的分離自中國玉米品種綜31 (Z31)的PEPC基因啟動子，使目的異源核苷酸序列能夠在光合組織中高效特異表達。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種組織特異性啟動子，其核苷酸序列包括如下 (a)或(b)的序列
(a)具有SEQ ID NO=I自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列；
(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
進一步地，所述組織特異性啟動子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列
(a)具有SEQ ID NO=I自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列；
(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述組織特異性啟動子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列
(a)具有SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列；
(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
上述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0. 5% SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中， 在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的所述的組織特異性啟動子的嵌合基因。
進一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述的嵌合基因的表達盒。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述的嵌合基因的重組載體。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述的嵌合基因的宿主細胞。
進一步地，所述宿主細胞為植物細胞。
優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在其細胞中含有所述的嵌合基因的植物的光合組織。
進一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，包括將與所述的組織特異性啟動子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定的整合進植物細胞中。
進一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列在光合組織中表達。更優(yōu)選地，所述光合組織為葉肉組織。
進一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)。所述目的異源核苷酸序列編碼昆蟲抗性蛋白質(zhì)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述的組織特異性啟動子用于在植物光合組織中優(yōu)先表達目的異源核苷酸序列的用途。
優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
進一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中術(shù)語“啟動子”是指DNA調(diào)節(jié)區(qū)，通常含有能夠引導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的適合轉(zhuǎn)錄起始位點啟動RNA合成的TATA盒。啟動子可另外含有其它的識別序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，稱作上游啟動子元件，它們影響轉(zhuǎn)錄起始速率。公認地，由于本發(fā)明啟動子區(qū)域核苷酸序列已經(jīng)確定，從本發(fā)明具體啟動子區(qū)域上游的5’非翻譯區(qū)內(nèi)進一步分離和鑒定調(diào)節(jié)元件屬于現(xiàn)有技術(shù)。因此，本發(fā)明啟動子區(qū)域進一步包括上游調(diào)節(jié)元件，它賦予與本發(fā)明啟動子序列可操作地連接的任何異源核苷酸序列組織特異性表達，優(yōu)選是在光合組織中特異性表達，更優(yōu)選地在葉肉組織中特異性表達。
本發(fā)明中術(shù)語“基因”是指在適宜的調(diào)控區(qū)域(例如植物可表達性啟動子區(qū)域)控制下在細胞內(nèi)含有被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)的DNA區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域”)的任何DNA片段。因此，基因可能含有幾種可操作性連接的DNA片段，例如啟動子、5’非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域和含有多聚腺苷酸化位點的3’非翻譯區(qū)域。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因是通常不在植物物種中發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者是在天然情況下其啟動子與部分或全部轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域或者與該基因的至少另一調(diào)控區(qū)域無關(guān)的任何基因。
本發(fā)明分離的啟動子序列的特征是提供目的異源核苷酸序列的光合組織特異性表達。所述光合組織為在植物體中可以進行光合作用或潛在光合作用的部分，例如綠色葉片、葉鞘、果殼等，光合組織通過光合作用利用無機物生產(chǎn)有機物(淀粉)并且貯存能量，以使植物體獲得生長發(fā)育必需的養(yǎng)分。本發(fā)明中術(shù)語“光合組織特異性”是指為特定目的，目的異源核苷酸序列在植物(例如水稻植物(“水稻光合組織特異性”))光合組織細胞中的高度特異性表達。換言之，目的異源核苷酸序列主要在植物的光合組織中表達，植物的非光合組織中的DNA轉(zhuǎn)錄物水平是無法檢測到的或是非常低的(每微克總RNA低于約0. 2皮克)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相同目的能夠容易地鑒定并利用功能上等價的啟動子。具有本質(zhì)上與含有本發(fā)明SEQ ID NO :1自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列、或 SEQ ID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列、或具有啟動子活性部分的核苷酸序列的玉米PEPC基因啟動子相似的啟動子活性的DNA序列，是這些啟動子的功能等價物。這些功能等價啟動子能在嚴格條件下與含有上述核苷酸序列的玉米PEPC基因啟動子區(qū)域雜交。
在雜交技術(shù)中，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探針，與來自被選生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段(如基因組文庫或cDNA文庫)群體中存在的其它對應(yīng)核苷酸序列選擇性地雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探測的基團如32P或其它任何可探測標記物標記。因此，例如，通過標記根據(jù)本發(fā)明序列的合成寡核苷酸可以制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法為本領(lǐng)域已知并公開于Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview, New York)0
序列的雜交可在嚴格條件下進行。所述“嚴格條件”是指探針將與其靶序列雜交至可探測程度超過與其它序列雜交(如至少2倍于背景)的條件。嚴格條件具有序列依賴性， 且因環(huán)境的不同而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒定與探針100%互補的靶序列(同源探測)?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴格條件以允許一些序列錯配，使得探測到較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針長度短于大約1000個核苷酸，優(yōu)選地短于500 個核苷酸。
典型地，嚴格條件是在pH7. 0至8. 3下鹽濃度低于大約1. 5M Na離子，典型地大約 0. 01至1. OM Na離子濃度(或其它鹽類)，溫度對短探針(如10至50個核苷酸)至少大約30°C，對長探針(如超過50個核苷酸)至少大約60°C。通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可獲得嚴格條件。低嚴格條件，例如，包括在30-35%甲酰胺、IM NaCl、1% SDS (十二烷基磺酸鈉)的緩沖溶液中37°C雜交，在IX至2XSSC(20XSSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中50-55°C洗滌。中度嚴格條件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1. OMNaClU % SDS的緩中溶液中37°C雜交，在0. 5X至IXSSC中55-60°C洗滌。高度嚴格條件，例如，包括在50% 甲酰胺、IM妝(1、1%503的緩沖溶液中371雜交，在0.1\55(中60-651洗滌。非必要地，洗滌緩沖液可含有大約0. 至的SDS。雜交時間一般少于大約M小時，通常大約 4至12小時。
特別典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。 對于 DNA-DNA 雜交體，Tm 可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 的方程估算:Tm = 81. 5°C +16. 6 (IogM) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L ；其中 M 是單價陽離子的摩爾濃度，％ GC是鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％ form是甲酰胺在雜交溶液中的百分比，L是雜交體在堿基對中的長度。Tm是50%互補靶序列與完全配對探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強度和PH下)。每的錯配需Tm降低大約1°C;因此， Tm雜交和/或洗滌條件可被調(diào)節(jié)以與所需同一性的序列雜交。例如，如果探尋的序列具有彡90%的同一性，1可以降低10°C。一般地，選擇的嚴格條件是低于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)大約5°C，且其在規(guī)定的離子強度和pH下互補。但是，高度嚴格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度0^1、2、3或41的雜交和/或洗滌；中度嚴格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度 (Tm)6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低度嚴格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm) 11、 12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。應(yīng)用此方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解雜交和/或洗滌溶液的條件隨嚴格度的變化而變化。如果所需的錯配程度使Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以能夠使用較高的溫度。核酸雜交的指南見于Tijssen (1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室技術(shù)-用核酸探針雜交，第I部分，第2章(Elsevier, New York)；和Ausubel等人編輯(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法第 2 章(Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York)。見 Sambrook 等人(1989)分子克隆實驗室手冊(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
因此，具有啟動子活性并在嚴格條件下與本發(fā)明啟動子序列或其片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40 % -50 %同源，大約60 %、65 %或 70% 同源，甚至至少大約 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40% -50%、大約60%、65% 或 70% 同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更大的序列同一性。
其它功能等價啟動子含有這樣的核苷酸序列，即能用含有SEQ ID NO=I自第812 位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO=I自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的至少約25、優(yōu)選至少約50、特別是至少約100個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶鏈式反應(yīng)中擴增的核苷酸序列。
還可以構(gòu)建人工啟動子，其包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的5’調(diào)控區(qū)域的決定啟動子的光合組織特異性的內(nèi)部序列。所述人工啟動子可能包含能在植物中表達的另一啟動子的“核心啟動子”或“TATA盒區(qū)域”，例如WO 93/19188中所述的CaMV 35S“TATA盒區(qū)域”。含有所述人工啟動子的啟動子區(qū)域的適用性可以通過它們與目的異源核苷酸序列的適當(dāng)融合以及目的異源核苷酸序列在適宜組織、適當(dāng)發(fā)育階段的表達的檢測進行鑒定。
本發(fā)明所述的啟動子序列及其片段，當(dāng)組裝進DNA結(jié)構(gòu)使啟動子序列與目的異源核苷酸序列可操作地連接時，用于遺傳性操控任何植物。所述“可操作地連接”是指本發(fā)明的啟動子序列與第二個序列之間的功能性連接，其中啟動子序列啟動和調(diào)節(jié)對應(yīng)于第二個序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般地，可操作地連接是指被連接的核酸序列是連續(xù)的，必要時相鄰地結(jié)合兩個蛋白編碼區(qū)，并在同一個閱讀框內(nèi)。以此方式，啟動子核苷酸序列與目的異源核苷酸序列構(gòu)成所述嵌合基因在表達盒中一起提供，以在目的植物中表達。這種表達盒提供了大量限制性位點以插入目的異源核苷酸序列，所述目的異源核苷酸序列將受到包含本發(fā)明啟動子序列的調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。表達盒可另外含有至少一個將共轉(zhuǎn)化進生物體的附加基因?？蛇x擇地，附加基因可以在多個表達盒上被提供。
表達盒可另外含有可選擇的標記基因。一般地，表達盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的選擇性標記基因。所述選擇性標記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細胞或組織。所述選擇性標記基因包括但不限于，編碼抗生素抗性的基因(如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (NPT))、磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予除草劑抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，4_ 二氯苯氧乙酸酯Q，4-D)。
表達盒包括沿5’_3’方向轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明的啟動子序列、翻譯起始區(qū)、目的異源核苷酸序列、和在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。目的異源核苷酸序列可以是天然的或?qū)χ参锼拗魍庠吹幕虍愒吹??？蛇x擇地，目的異源核苷酸序列可以是天然序列或選擇性合成序列?！巴庠础笔侵冈趯?dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的天然植物中不存在所述的導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。例如， 嵌合基因包含本發(fā)明的啟動子序列，本發(fā)明的啟動子序列可操作地與不同于本發(fā)明的啟動子序列的編碼序列連接。
終止區(qū)可來源于本發(fā)明的啟動子序列，也可來源于可操作連接的目的異源核苷酸序列，或可來源于另外的來源。傳統(tǒng)的終止區(qū)可從土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒獲得，如肉堿合成酶和胭脂堿合成酶(N0Q終止區(qū)。
在表達盒制備中，可以操控不同的DNA片段以提供適當(dāng)方向的DNA序列，并在適合的時候提供適當(dāng)?shù)拈喿x框。所以，可應(yīng)用接受子或連接子結(jié)合DNA片段，或可進行其它操控以提供方便的限制性位點、去除多余的DNA、去除限制性位點等。為此目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、再取代，如轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)換。
在適合的情況下，目的異源核苷酸序列可被優(yōu)化以增加在轉(zhuǎn)化植物中的表達量。 即可用植物優(yōu)選的密碼子合成基因以改善表達。
本領(lǐng)域公知的，另外的序列修飾可提高細胞宿主中的基因表達水平。這些包括但不限于，去除編碼假性聚腺苷信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點信號、轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表達的序列。序列的G-C含量可調(diào)節(jié)到指定宿主細胞的平均水平，引用宿主細胞中已知的基因表達水平進行計算?？赡艿?，修飾序列以避免預(yù)測的發(fā)夾式mRNA 二級結(jié)構(gòu)。
在表達盒或重組載體中，表達盒可另外含有5’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以起改進轉(zhuǎn)錄效率的作用。所述前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，細小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編碼區(qū))；馬鈴薯病毒組前導(dǎo)序列，例如煙草蝕刻病毒(TEV)前導(dǎo)序列、玉米矮小花葉病毒(MDMV)前導(dǎo)序列和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白 (BiP)；來自紫花苜蓿花葉病毒包被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列；煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列；和玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)前導(dǎo)序列。還可以使用其它已知的改進轉(zhuǎn)錄效率的元件，例如內(nèi)含子等。
本發(fā)明的啟動子序列可用來啟動與目的異源核苷酸序列的信使RNA(mRNA)至少部分互補的反義結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建反義核苷酸序列以與相應(yīng)的mRNA雜交。只要反義序列長到可與相應(yīng)的mRNA雜交并干擾其表達，就可進行反義序列的修飾。以此方式，可以使用與相應(yīng)的反義序列具有70%，優(yōu)選的80%，更優(yōu)選的85%序列同一性的反義結(jié)構(gòu)。此夕卜， 反義核苷酸序列的一部分可被用來破壞靶基因的表達。一般，可使用至少50個核苷酸、100 個核苷酸、200個核苷酸或更多個核苷酸的序列。
本發(fā)明的啟動子序列還可用于啟動正義方向的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄以抑制植物中內(nèi)源性基因的表達。應(yīng)用正義方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表達的方法為本領(lǐng)域已知。該方法通常涉及用含啟動子的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，啟動子可操作地連接至少一部分相當(dāng)于內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄體的核苷酸序列，并驅(qū)動其在植物中表達。典型地，所述核苷酸序列與內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄體的序列具有實質(zhì)上地序列同一性，優(yōu)選地超過大約65%序列同一性，更優(yōu)選地超過大約85%序列同一性，最優(yōu)選地超過大約95%序列同一性。
本發(fā)明的啟動子序列被用于目的異源核苷酸序列的組織特異性表達?！爱愒春塑账嵝蛄小笔侵阜翘烊坏嘏c啟動子序列一起存在的序列。雖然所述核苷酸序列與啟動子序列是異源的，但對植物宿主可能是同源的或天然的或異源的或外源的?？刹僮鞯嘏c本發(fā)明的啟動子連接的異源核苷酸序列可編碼目的蛋白質(zhì)。這種異源核苷酸序列的實例包括但不限于，編碼賦予以下抗性多肽的核苷酸序列非生物應(yīng)激如干旱、溫度、鹽度、臭氧和除草劑， 或生物應(yīng)激如病原體侵襲，包括昆蟲、病毒、細菌、真菌和線蟲類，并防止產(chǎn)生這些生物體伴隨的疾病。
本發(fā)明中除草劑耐性蛋白質(zhì)可以表達對除草劑的抗性和/或耐受性。這些基因包括但不限于，乙酰乳酸合酶(ALS)基因、EPSPS基因、PAT基因、GOX基因、GAT基因等。
本發(fā)明中“昆蟲抗性”是指植物避免植物-昆蟲相互作用所致的癥狀和損害。即阻止昆蟲引起的植物損害、農(nóng)作物損害、植物損形和植物疾病，或可選擇地，將由昆蟲引起的植物損害、農(nóng)作物損害、植物損形和植物疾病減少到最小或減輕。所述昆蟲可以屬于鱗翅目 (如玉米螟)、半翅目(如椿象)、鞘翅目(如甲蟲)、直翅目(如飛蝗)、同翅目(如蚜蟲)、 雙翅目(如蠅)等。本領(lǐng)域公知的，目的昆蟲抗性蛋白質(zhì)包括但不限于，芽孢桿菌毒性蛋白； 凝集素類，其中凝集素包括雪花蓮凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麥芽凝集素、馬鈴薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶類，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶1或大豆脂氧化酶；昆蟲殼多糖酶等。
吸食樹汁或啃食葉片的害蟲將病毒從感染的植物傳遞給健康植物。所述病毒包括但不限于，水稻東格魯桿狀病毒、煙草花葉病毒、甘薯萎黃矮小病毒和甘薯羽狀斑點病毒等。因此，優(yōu)選在光合組織中表達具有抗致病原體活性或使病毒病原體的影響最小化的異源核苷酸序列。
本發(fā)明的啟動子序列和方法可用于任何目的異源核苷酸序列在植物宿主中的表達調(diào)節(jié)，以改變植物的表現(xiàn)型。各種目的表現(xiàn)型改變包括但不限于，改變植物的脂肪酸成分、改變植物的氨基酸含量、改變植物病原體防御機制等。上述改變可以通過提供異源產(chǎn)物的表達或增加植物內(nèi)源性產(chǎn)物的表達而得到。可選擇地，上述改變可以通過減少植物中一個或多個內(nèi)源性產(chǎn)物的表達而得到，特別是酶或輔助因子。上述改變將導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表現(xiàn)型改變。
轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞類型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、 電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞可按照常規(guī)的方式生長成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征。可培育二代或多代以保證穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達的種子。
本發(fā)明提供了一種組織特異性啟動子及其用途，具有以下優(yōu)點
1、首次分離。本發(fā)明組織特異性啟動子首次分離自中國玉米品種Z31的PEPC基因。
2、活性高。本發(fā)明組織特異性啟動子可以顯著地提高目的異源核苷酸序列在植物光合組織中的表達量，如在葉片中由本發(fā)明組織特異性啟動子驅(qū)動的⑶S活性值可高達 9897 士 50(pmol 4-MU/mg 蛋白 /min)，GUS 染色也明顯較深。
3、組織專一性強。本發(fā)明組織特異性啟動子顯著地提高目的異源核苷酸序列在植物光合組織中的表達量，而顯著地降低了目的異源核苷酸序列在植物非光合組織中的表達量，如在非光合組織的根和花中表達很弱，顯著地增強了目的異源核苷酸序列在植物光合組織中表達的組織專一性。
下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。


圖1為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的重組克隆載體pT_prZ31PEPC(B&H)構(gòu)建流程圖2為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的重組表達載體P90005構(gòu)建流程圖3為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的重組表達載體P90007構(gòu)建流程圖4為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株葉片的GUS染色圖5為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株根的⑶S染色圖6為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株莖的⑶S染色圖7為本發(fā)明組織特異性啟動子及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株花粉的GUS染色圖。
具體實施方式
下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明殺蟲基因及其用途的技術(shù)方案。
第一實施例、分離啟動子序列
1、DNA 的提取
DNA提取按照常規(guī)采用的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法取2克幼嫩的玉米品種Dl (綜31)植株的葉片在液氮中研磨成粉后，加入0. 5ml于溫度65°C預(yù)熱的DNA提取 CTAB Buffer (20g/L CTAB, 1. 4M NaCl, IOOmMTris-HCl, 20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，用 NaOH 調(diào)pH至8. 0)，充分混勻后，于溫度65°C抽提90min ；加入0. 5倍體積苯酚，0. 5倍體積氯仿，顛倒混勻；12000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))轉(zhuǎn)速下離心IOmin ；吸取上清液，加入2倍體積無水乙醇，輕柔晃動離心管，于溫度4°C靜置30min ； 12000rpm轉(zhuǎn)速下再離心IOmin ；收集DNA到管底；棄上清液，用Iml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，洗滌沉淀；12000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min ；真空抽干或在超凈臺吹干；DNA沉淀溶解于適量的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8. 0) 中，保存在溫度-20°C條件下。
將上述提取的DNA稀釋10倍后作為PCR擴增模板。
2、擴增啟動子區(qū)域
用玉米品種B73的PEPC基因啟動子的已知序列(如序列表中SEQ ID NO :2所示)， 設(shè)計引物進行PCR擴增
引物 1 :CAACTAGGTTGCATAGGATTTCATGATTAA，如序列表中 SEQ ID NO 3 所示；
引物 2 :GCTGGGCCCGTGGAGGTC，如序列表中 SEQ ID NO 4 所示。
具體試劑和擴增條件如下
IOx反應(yīng)緩沖液5μ125mM MgCl24μ1IOmM脫氧核糖核苷酸混合物(dNTP)Ιμ 10μΜ引物12μ110μΜ引物22μ1模板2μ1Taq DNA聚合酶0.5μ1
總體積50μ1
上述反應(yīng)緩沖液為200mMTris-HCl (PH8. 4)，200mM KCl, 15mM MgCl20
PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)94°C變性0. 5min，58°C退火0. 5min，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72°C延伸5min。
3、序列測定
取2 μ 1 上述 PCR 擴增產(chǎn)物與 pGEM-T 載體(Promega，Madison，USA，CAT :A3600)進行連接，操作步驟按!Iomega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進行。然后連接產(chǎn)物用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞(Transgen，Beijing, China ；Cat. No :CD501)，其熱激條件為 50 μ 1大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞、10 μ 1連接產(chǎn)物，42°C水浴30秒；37°C培養(yǎng)1小時(200rpm 轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,瓊脂15g/L， 用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，去上清液，沉淀菌體用100 μ 1冰預(yù)冷的溶液I 05mM Tris-HCl，IOmM EDTA, 50mM葡萄糖，pH8. 0)懸??；加入150 μ 1新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH,質(zhì)量濃度為1 % SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒 4次，混合，置冰上3-5min ；加入150 μ 1冰冷的溶液III (4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-lOmin ；于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ；于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用質(zhì)量濃度為70 %的乙醇洗滌后晾干；加入30 μ 1含foiase (RNA酶)(20 μ g/ml) 的 TE (IOmOTris-HCl，ImM EDTA, PH8. 0)溶解沉淀；于溫度 37°C下水浴 30min，消化 RNA ；于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 提取的質(zhì)粒經(jīng)BamHI和NcoI酶切鑒定后，挑選陽性克隆，進行測序驗證，確認玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
第二實施例、含有玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的重組表達載體P90005 的構(gòu)建
1、引物設(shè)計及PCR擴增
根據(jù)如序列表中SEQ ID NO :1所示的玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列，設(shè)計引物
引物 3 :AAGCAAGGATCCGGATTTCATGATTAACAGTG 如序列表中 SEQ ID NO 5 所示(帶有BamHI酶切位點)；
引物 4 :GGATGGAAGCTTGGCGCGGCGGGAAGCTAAGC 如序列表中 SEQ ID NO 6 所示(帶有HindIII酶切位點)。
以上述含有玉米品種Z31的PEPC基因啟動子的質(zhì)粒的DNA為模板，按照第一實施例中2所述的試劑和PCR擴增條件進行PCR擴增。
2、構(gòu)建含有玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列的重組克隆載體 pT-prZ3IPEPC(B&H)
取2μ 1第二實施例中所述PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega，Madison, USA, CAT :A3600)進行連接，操作步驟按!Iomega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進行， 得到重組克隆載體pT-prZ31PEPC(B&H)，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；Π表示噬菌體fl的復(fù)制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動子；T7為T7 RNA聚合酶啟動子；prZ3 IPEPC為玉米品種Ti 1的PEPC基因啟動子(SEQ ID N0:1第16-2310位)；MCS為多克隆位點)。然后將重組克隆載體 pT-prZ3IPEPC(B&H)用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞(Transgen，Beijing, China ； Cat. No ⑶501)，其熱激條件為50μ 1大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞、10 μ 1質(zhì)粒DNA (重組克隆載體pT-prZ3 IPEPC (B&H))，42°C水浴30秒；37°C培養(yǎng)1小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl IOg/ L，氨芐青霉素100!^/1，用妝0!1調(diào)？!1至7.5)中于溫度37 °C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。
提取的質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體pT-prZ3IPEPC(B&H)中插入的玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列為序列表中SEQ ID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列。
進一步地，PEPC是C4植物光合作用途徑中最重要的酶之一。通過plantcare對玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列進行分析，其含有大量與光合作用相關(guān)的順式作用元件，比如 ACE、Box4、CATT-motif、G-box、GAG-motif、GATA-motif、I-box、MNFl、Spl、as-2-box 等，主要集中在SEQID NO 1的第812-2272位之間。
3、構(gòu)建含有玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的重組表達載體P90005
限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII分別酶切重組克隆載體pT_prZ31PEPC (B&H)和表達載體p90001 (載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的玉米品種Z31 的PEPC基因啟動子片段插到p90001的BamHI和HindIII位點之間，構(gòu)建成重組表達載體 P90005，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan 卡那霉素基因；RB 右邊界Wbi 玉米W^iquitin (泛素)基因啟動子；PMI 磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因；prZ31PEPC 玉米品種Dl的PEPC基因啟動子(SEQ ID NO :1第16-2310位)；⑶S β -葡萄糖苷酸酶基因(SEQ ID NO 7) ；Nos 終止子；LB 左邊界)。
將重組表達載體ρ90005用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞(Transgen， Beijing, China ；Cat. No :CD501)，其熱激條件為:50 μ 1大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞、10 μ 1質(zhì)粒DNA (重組表達載體p90005)，42°C水浴30秒；37°C培養(yǎng)1小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時， 挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體P90005在BamHI和HindIII位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示核苷酸序列，即玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列。
4、構(gòu)建含有玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的重組表達載體p90007 (正對昭)
按照本發(fā)明第二實施例中2所述的構(gòu)建含有玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的重組克隆載體pT-prZ31PEPC (B&H)的方法，利用已知的玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列構(gòu)建含有玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的重組克隆載體pT-prB73PEPC(B&H)。 對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體pT-prB73PEPC(B&H)中插入的玉米品種 B73的PEPC基因啟動子序列為序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，即玉米品種B73 的PEPC基因啟動子序列正確插入。
按照本發(fā)明第二實施例中3所述的構(gòu)建含有玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的重組表達載體P90005的方法，利用已知的玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列構(gòu)建含有玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的重組表達載體p90007，其構(gòu)建流程如圖3所示 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供)；Kan 卡那霉素基因；RB 右邊界；Ubi 玉米WDiquitin基因啟動子；PMI 磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因；prB73PEPC 玉米品種B73的 PEPC基因啟動子(SEQ ID NO 2)；⑶S β -葡萄糖苷酸酶基因(SEQ ID NO 7) ；Nos 終止子；LB 左邊界)。對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組表達載體Ρ90007中插入的玉米品種Β73的PEPC基因啟動子序列為序列表中SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，即玉米品種 Β73的PEPC基因啟動子序列正確插入。
5、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
對已經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體p90005和p90007用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404(Invitrgen, Chicago, USA ；Cat. No :18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為100 μ L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達載體)；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NcoI酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體P90005和p90007結(jié)構(gòu)完全正確。
第三實施例、轉(zhuǎn)入玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的玉米植株的獲得
按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜3(Z;3)的幼胚與第二實施例中5所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實施例中3和4構(gòu)建的重組植物表達載體P90005 和p90007中的T-DNA(包括玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列、玉米品種B73的PEPC 基因啟動子序列、PMI基因和GUS基因)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入玉米品種Z31 的PEPC基因啟動子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的玉米植株(正對照)，同時以野生型玉米植株作為負對照。
對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本發(fā)明組織特異性啟動子的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⒂衩灼贩NZ31的PEPC基因啟動子傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1 侵染步驟)，所述啟動子可操作地與目的異源核苷酸序列相連。在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl = 0. 4-0. 6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮 (AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2 共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮 (AS)100mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0，4_D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS 維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0，4_D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8) 中至少存在一種已知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑 (步驟3 恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4 選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5mg/L、2，4_ 二氯苯氧乙酸0，4-0)1!^/1、瓊脂88/1，？!15.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后， 愈傷組織再生成植物(步驟5 再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤ang/L、甘露糖5mg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C 下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，ρΗ5· 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm 高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
第四實施例、玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列的活性測定
實驗一、⑶S基因拷貝數(shù)的鑒定
分別取轉(zhuǎn)入玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入玉米品種B73 的PEPC基因啟動子序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測⑶S基因的拷貝數(shù)。 同時以野生型玉米植株作為負對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
檢測GUS基因拷貝數(shù)的具體方法如下
步驟11、分別取轉(zhuǎn)入玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientif ic)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為 80-100ng/y 1 ；
步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為負對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是
引物 5 (GF) GAGGACATCTCGGTTGTGACC 如序列表中 SEQ ID NO 8 所示；
引物 6 (GR) TGCCTTGAAAGTCCACCGTATAG 如序列表中 SEQ ID NO 9 所示；
探針(GP):CTTCAATGGCCCAACCGGGACTG 如序列表中 SEQ ID NO 10 所示；
PCR反應(yīng)體系為
所述50X引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50 μ 1和860 μ 1 1 X TE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
PCR反應(yīng)條件為
JumpStart Taq ReadyMix (Sigma) 50χ引物/探針混合物基因組DNA 水 UdH2O)10μ1 Ιμ 3μ1 6μ1步驟溫度時間2195 0C5 分鐘2295 0C30 秒2360 0C1 分鐘24回到步驟22，重復(fù)40次
利用SDS2. 3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
實驗結(jié)果表明，玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列和玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列已經(jīng)整合到所檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入玉米品種Z31的PEPC 基因啟動子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝GUS基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
實驗二、⑶S活性的鑒定
分別取轉(zhuǎn)入玉米品種Z31的PEPC基因啟動子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入玉米品種B73 的PEPC基因啟動子序列的玉米植株的葉片、根、莖和花各IOOmg作為樣品，參照Jefferson 等(Jefferson, R. A. , Kavanagh, Τ.Α.and Bevan, Μ. W. GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. ,1987, 3901-3907)的方法，用4-甲基傘形酮通過熒光法測定PEPC驅(qū)動的⑶S活性。同時以野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株作為負對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗每一組織設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
測定⑶S活性的具體方法如下
步驟31、分別稱取轉(zhuǎn)入玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列的玉米植株的葉片、根、莖和花各lOOmg，加入500μ 1 提取緩沖液(50mM NaPO4 (pH7. 0)、lmM 二硫蘇糖醇(DTT)、10mM EDTA、0. 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)、0. 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100))在研缽中研成勻漿；
步驟32、在溫度4°C、轉(zhuǎn)速4000rpm下離心IOmin后，收集上清液，并置4°C下保存；
步驟33、在 250 μ 1 預(yù)熱(37°C、至少 30min)的反應(yīng)緩沖液(50mM NaPO4 (ρΗ7· 0)、 ImM 二硫蘇糖醇(DTT)、10mM EDTA、0. 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)、0. 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、ImM 4-甲基傘形酮酰-β -葡萄糖苷酸(MUG))中加入50 μ 1所述上清液，混勻，于溫度37°C下反應(yīng)15min后，取出30 μ 1加入到270 μ 1反應(yīng)終止液 (m/v)碳酸鈉)中終止反應(yīng)；
步驟34、制作 4-MU 的標準曲線(0、50、100、250、500、1000、1500 和 2000pmol 4-MU 稀釋于2%碳酸鈉)，用SpectraMax M2測定各樣品的Ex365/Em455值；
步驟35、取所述上清液30 μ 1，用水定容至360 μ 1，取出30 μ 1后加入 100 μ IBCA(二喹啉甲酸)反應(yīng)物(BCA蛋白定量試劑盒)，于溫度37°C下反應(yīng)30min后，再于室溫下冷卻IOmin ；
步驟36、同時以牛血清白蛋白(BSA)制作標準曲線(0、25、50、75、100、150、200和 250 μ g/ml)，用SpectraMax M2測定各樣品的560nm光吸收值；
步驟37、用4-甲基傘形酮G-MU)的皮摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)含量及時間的比值(pmol4-MU/mg蛋白/min)表示GUS活性。
同時以以野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株作為負對照，按照上述方法進行檢測分析。
轉(zhuǎn)基因玉米植株⑶S基因的表達量的實驗結(jié)果如表1所示。分別測得轉(zhuǎn)入玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的玉米植株(DlPEPC)、轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列(B73PEPC)、野生型玉米植株(WT)和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株(NGM)的葉片中 GUS 活性值(pmol 4-MU/mg 蛋白/min)為 9897士50、9675士73、0士 13 和 0士 11 ；轉(zhuǎn)入玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列、野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株的根中GUS 活性值(pmol 4-MU/mg 蛋白/min)為 121 士 15、144士 12、0士21 和 0士23 ；轉(zhuǎn)入玉米品種 Z31 的PEPC基因啟動子序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列、野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株的莖中⑶S活性值(pmol 4-MU/mg蛋白/min)為3321 士52、3123士46、0士沘和0士洸；轉(zhuǎn)入玉米品種Dl的PEPC基因啟動子序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入玉米品種B73的PEPC基因啟動子序列、野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量 PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株的花中⑶S活性值(pmol 4-MU/mg蛋白/min)為99士 13、 132士 15、0士 16 和 0士 18。
表1、四種植株的GUS活性測定平均結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種組織特異性啟動子，其特征在于，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列(a)具有SEQID NO 1自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列；(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織特異性啟動子，其特征在于，所述組織特異性啟動子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列(a)具有SEQID NO 1自第16位至第2310位核苷酸所示的核苷酸序列；(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織特異性啟動子，其特征在于，所述組織特異性啟動子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列(a)具有SEQID NO 1所示的核苷酸序列；(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的權(quán)利要求1所述的組織特異性啟動子的嵌合基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合基因，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
6.一種包含權(quán)利要求4或5所述的嵌合基因的表達盒。
7.一種包含權(quán)利要求4或5所述的嵌合基因的重組載體。
8.一種包含權(quán)利要求4或5所述的嵌合基因的宿主細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為植物細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述宿主細胞，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
11.一種在其細胞中含有權(quán)利要求4或5所述的嵌合基因的植物的光合組織。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的光合組織，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
13.一種在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于，包括將與權(quán)利要求 1所述的組織特異性啟動子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定的整合進植物細胞中。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于， 所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于， 所述目的異源核苷酸序列在光合組織中表達。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于， 所述光合組織為葉肉組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于， 所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于， 所述目的異源核苷酸序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，其特征在于， 所述目的異源核苷酸序列編碼昆蟲抗性蛋白質(zhì)。
20.一種權(quán)利要求1所述的組織特異性啟動子用于在植物光合組織中優(yōu)先表達目的異源核苷酸序列的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組織特異性啟動子用于在植物光合組織中優(yōu)先表達目的異源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組織特異性啟動子用于在植物光合組織中優(yōu)先表達目的異源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織特異性啟動子及其用途，組織特異性啟動子的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列(a)具有SEQ ID NO1自第812位至第2272位核苷酸所示的核苷酸序列；(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明組織特異性啟動子首次分離自中國玉米品種Z31的PEPC基因；同時，顯著地提高目的異源核苷酸序列在植物光合組織中的表達量，而顯著地降低了目的異源核苷酸序列在植物非光合組織中的表達量，顯著地增強了目的異源核苷酸序列在植物光合組織中表達的組織專一性。
文檔編號C12N15/113GK102517285SQ20111043572
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者丁德榮, 龐潔, 張穎, 李曉嬌, 楊進孝, 賈志偉, 郭函子, 魏雪松, 黃金存 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司