專利名稱：轉(zhuǎn)基因大豆gts40-3-2核酸定量檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體來說，涉及一種轉(zhuǎn)因大豆 GTS40-3-2定量檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其構(gòu)建與定量方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)被稱為是“應(yīng)用最為迅速的生物技術(shù)”，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，幫助農(nóng)民增收，為解決全球人口增長所帶來的糧食問題開辟了新的途徑。所謂轉(zhuǎn)基因植物(Genetically modified organism, GM0)是指利用生物技術(shù)，將從不同生物中分離或人工合成的基因在體外進(jìn)行重組，然后導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，使新的基因在受體細(xì)胞內(nèi)整合、表達(dá)、其再生植株能通過無性或有性增殖過程，將外源基因遺傳給后代，由此獲得的遺傳修飾植物類型稱為轉(zhuǎn)基因植物。 以轉(zhuǎn)基因植物直接為食品或為原料加工生產(chǎn)的食品稱為轉(zhuǎn)基因食品。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將基因在不同物種之間轉(zhuǎn)移，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在性狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費品質(zhì)等方面向人類所需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變，滿足人類的各種需求，例如提高產(chǎn)量、表達(dá)特殊營養(yǎng)成分甚至獲得抗除草劑抗病毒或抗蟲害的能力。例如轉(zhuǎn)基因大豆是全世界種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，轉(zhuǎn)基因大豆主要是導(dǎo)入了抗草甘膦基因EPSPS基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)該基因編碼磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶，使大豆能夠耐受除草劑草甘膦的傷害，大大方便大豆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和管理。但是隨著轉(zhuǎn)基因作物在全世界范圍內(nèi)的廣泛種植，其食用安全和環(huán)境安全問題也引起了廣大消費者和各國政府及相關(guān)機構(gòu)人員的重視。轉(zhuǎn)基因作物在實驗室內(nèi)產(chǎn)生，是大跨度、跳躍式的轉(zhuǎn)移基因，不同于漫長的自然選擇和相近物種的雜交。在理論上，轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)生是人為的加快了某些物種的生物進(jìn)化速度。這些物種沒有經(jīng)過長期的自然選擇的過程，其本身的安全性未知，并且對已有生物的多樣性會產(chǎn)生影響。因此很多國家和地區(qū)紛紛制定轉(zhuǎn)基因生物安全管理法規(guī)，實施標(biāo)簽制度，并積極發(fā)展轉(zhuǎn)基因作物檢測監(jiān)測技術(shù)。應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測方法主要有兩種核酸檢測、蛋白質(zhì)檢測。其中核酸檢測方法由于檢測靈敏度高、適用范圍廣、操作簡便等原因已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的主要檢測方法。另外核酸由于在生物細(xì)胞中含量相對穩(wěn)定，在產(chǎn)品加工中也相對不容易被破壞，因此常用作轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測目標(biāo)。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timeFluorescent Quantitative PCR, FQ-PCR) 方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)的一種，是公認(rèn)的目前核酸檢測的最常用定量檢測方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱體外基因擴增技術(shù)，是一項在短時間內(nèi)體外大量擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。近年來出現(xiàn)的核酸定量PCR技術(shù)，尤其是實時熒光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)，實現(xiàn)了 PCR由定性到定量的飛躍。實時熒光定量PCR技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入能特異標(biāo)記 PCR產(chǎn)物的熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸定量和分析技術(shù)，該技術(shù)融會了 PCR的高靈敏性、DNA雜交技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量優(yōu)點，且操作簡便、污染少，已成為分子生物學(xué)等許多研究及應(yīng)用科學(xué)中的重要工具。在實際檢測中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分重要。目前，國內(nèi)用于轉(zhuǎn)基因生物檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還很少，目前只有一種轉(zhuǎn)基因大豆粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。國際領(lǐng)先的生物計量單位或者實驗室已經(jīng)開始進(jìn)行轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，例如位于比利時的歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所(IRMM)，已經(jīng)配制并提供涉及14種轉(zhuǎn)基因作物的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CRMs)系列標(biāo)準(zhǔn)品60多種，這些標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)在市場上銷售，但國際有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的價格居高不下，不能滿足日益增多的轉(zhuǎn)基因檢測的需求。并且，現(xiàn)有的這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多是原始農(nóng)產(chǎn)品植物材料的植株或者種子等組織器官的干燥粉末，在使用中還需要從中提取DNA，制備、貯存和測定過程因素影響眾多，很難維持恒定的量，很難保證測量的穩(wěn)定性，溯源性差。相比之下，質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在很多方面具有明顯優(yōu)勢，質(zhì)粒分子是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在GMO鑒定檢測中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，DNA易于擴增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并且純度較高； 且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個質(zhì)粒分子可以同時包含多個外源目的基因，經(jīng)濟又高效。但目前質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制還不完善，很多檢測實驗室使用的陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品缺乏嚴(yán)格的溯源性考察，因此檢測結(jié)果一致性、互通性和可靠性不能保證，給檢測中的定量帶來了較大的不確定性，制約了我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測工作的量值溯源發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR檢測中陽性品缺乏和陽性標(biāo)準(zhǔn)品配置的難題，提供一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。本發(fā)明人通過對轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，設(shè)計引物PCR擴增獲得其結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段；通過分子克隆的方法構(gòu)建到一個質(zhì)粒分子中而成人工重組質(zhì)粒分子PXL02 ；用電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜(ICP-MQ的方法檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的含磷量，從而換算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的濃度。本發(fā)明中構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子完全可以替代轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2陽性標(biāo)準(zhǔn)品，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子完全適用于對轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2樣品的結(jié)構(gòu)特異性、品系特異性定量PCR分析和檢測，徹底解決轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2檢測中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，并保證了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的溯源性。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一是一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。本發(fā)明中，所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列，是指轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2基因組中外源插入片段的一段序列，這段序列可作為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列，較佳的如其基因組中的CTP4序列以及CTP4序列兩側(cè)的序列所組成的核苷酸片段，其優(yōu)選的形式可以是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分CP4EPSPS序列。其中，所述的“部分”是50-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 的結(jié)構(gòu)特異性序列。其更優(yōu)選的形式是109bp長的35S啟動子序列、CTP4序列(共長216bp) 及36^p的CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段。所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，是指轉(zhuǎn)基因大豆GTS40_3_2基因組中的一段序列，這段序列可作為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，較佳的如其基因組中含有的外源插入載體序列以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的片段。所述轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列優(yōu)選的形式可以是部分外源插入載體序列和與該外源插入載體相鄰接的部分大豆基因組序列所組成的核苷酸片段。其中，所述的“部分”是50-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 的品系特異性序列。所述轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列更優(yōu)選的形式是包括 192bp的載體序列和127bp與該載體序列相鄰接的大豆基因組序列。本發(fā)明中，所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點。本發(fā)明中所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段，是指大豆凝集素基因中具有大豆凝集素基因特異性的片段。在大豆凝集素基因中，全長基因的l(^9bp 1579bp的片段是具有特異性的。本發(fā)明所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段優(yōu)選的就是選自Lectin全長基因的第10 位至第1579位的連續(xù)的50-550bp的核苷酸片段，最優(yōu)的就是Lectin全長基因的第10 位至第1579位的片段。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是一種所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，包括以下步驟①利用引物通過PCR特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段；②分別依次將PCR擴增得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段克隆至克隆質(zhì)粒載體上，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02。本發(fā)明中，所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分CP4EPSPS序列；所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列是轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組相鄰接的序列；所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 Lectin是大豆凝集素基因。本發(fā)明中，所述的PCR引物是長度為的寡核苷酸鏈，其與轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列或者大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段完全相同或互補。本發(fā)明中，所述的特異性擴增是利用設(shè)計的PCR引物特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。本發(fā)明中，所述的克隆是將上述PCR擴增得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段按照設(shè)計的限制性內(nèi)切酶酶切位點依次連接到質(zhì)粒載體上，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PXL02。本發(fā)明中，所述的質(zhì)粒載體可以是任何常規(guī)載體，較佳的是克隆載體，更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，如pUC19、pUC18，，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptII SK或pGEM系列載體。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是一種所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的定量方法，包括以下步驟①提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02 ；②根據(jù)步驟①所得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的堿基組成和序列長度，計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02分子中的磷元素的含量；③配制梯度濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用此標(biāo)準(zhǔn)溶液作出電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜 (ICP-MS)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。④ICP-MS檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02溶液，并根據(jù)步驟③所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02溶液的磷含量。⑤根據(jù)步驟④所得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02溶液的磷含量和步驟②所得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02分子中的磷元素的含量，計算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的濃度。本發(fā)明中，電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜檢測的參數(shù)優(yōu)選RF power為1100W，霧化氣流量為1. 08L/min，輔助氣流量為1. 2L/min，等電子體氣流量為16L/min。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR檢測方法， 所采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。本發(fā)明的有益效果在于，利用PCR擴增和分子克隆的方法構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，并利用電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜(ICP-MQ對其進(jìn)行定量，保證了其良好的溯源性。本發(fā)明的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以替代轉(zhuǎn)因大豆GTS40-3-2的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2結(jié)構(gòu)特異性、品系特異性的定量PCR檢測。


圖1是本發(fā)明一質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的構(gòu)建流程圖。圖2是本發(fā)明一質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2核酸定量檢測用的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其構(gòu)建與定量方法。本質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以替代轉(zhuǎn)因大豆GTS40-3-2陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2結(jié)構(gòu)特異性、品系特異性的定量PCR檢測。本發(fā)明通過對轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，設(shè)計PCR引物， 經(jīng)PCR擴增獲得其結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段；通過分子克隆的方法將其構(gòu)建到一個質(zhì)粒中，從而形成人工重組質(zhì)粒分子PXL02 ；用電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜(ICP-MQ的方法檢測質(zhì)粒陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的含磷量，從而換算出質(zhì)粒陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的濃度。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子完全可以替代轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 本質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子完全適用于對轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2樣品的結(jié)構(gòu)特異性、品系特異性定量 PCR分析和檢測，徹底解決轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2檢測中陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，并保證了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的溯源性。
核酸定量PCR檢測大豆GTS-40-3-2的原理采用實時熒光PCR技術(shù)和可特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2中結(jié)構(gòu)基因或品系特異性基因以及大豆Lectin基因的引物和兩端標(biāo)記熒光的探針，分別擴增測試樣品 DNA，并實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物。與此同時，用相同的引物、探針和條件擴增已知濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(或陽性標(biāo)準(zhǔn)分子)，以獲得穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)外源基因(結(jié)構(gòu)特異性基因或品系性特異基因)和內(nèi)源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線可分別計算出樣品中對應(yīng)基因的絕對含量(拷貝數(shù)或濃度)，并由絕對含量計算計算轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2在測試樣品中的相對含量。如采用陽性標(biāo)準(zhǔn)分子時計算相對含量應(yīng)使用轉(zhuǎn)換系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準(zhǔn)設(shè)備，評價測量方法或給材料賦值的材料或物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因植物檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)是一類用原始植物材料制成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是純合的轉(zhuǎn)基因植物材料，在PCR檢測過程中用作陽性對照和配置定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，用于對GMO混合水平進(jìn)行量化和分析。在轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測過程中，陽性標(biāo)準(zhǔn)品是必須的，因此陽性標(biāo)準(zhǔn)品的配置要求非常嚴(yán)格，必須經(jīng)過多個實驗室的實驗驗證方可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測。這類來源于農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其制備、貯存和測定過程受很多因子影響，很難維持恒定的量，而且并非所有的作物轉(zhuǎn)基因品系都存在標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在GMO鑒定檢測中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，DNA易于擴增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并且純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時包含多個外源目的基因，經(jīng)濟又高效。甚至有學(xué)者將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子稱為“金標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”。在轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測過程中，標(biāo)準(zhǔn)分子根據(jù)分子量大小與植物基因組DNA分子換算，從而完成對轉(zhuǎn)基因樣品的定量分析。標(biāo)準(zhǔn)分子可以應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因PCR檢測，尤其是定量PCR檢測中。本發(fā)明的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。本發(fā)明中，所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列，是指轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2基因組中外源插入片段的一段序列，這段序列可作為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列，較佳的如其基因組中的CTP4序列以及CTP4序列兩側(cè)的序列所組成的核苷酸片段，其優(yōu)選的形式可以是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分CP4 EPSPS序列。其中，所述的“部分”是50-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 的結(jié)構(gòu)特異性序列。其更優(yōu)選的形式是109bp長的35S啟動子序列、CTP4序列(共長216bp) 及365bp的CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段。所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列較佳的如SEQ ID NO. 1所示，其中第1位到109位為部分35S啟動子序列，第110 位到3 位為CTP4序列，第327到691位為部分CP4 EPSPS序列。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，是指轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因組中的一段序列，這段序列可作為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列，較佳的如其基因組中含有的外源插入載體序列以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的片段。所述轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列優(yōu)選的形式可以是部分外源插入載體序列和與該外源插入載體相鄰接的部分大豆基因組序列所組成的核苷酸片段。其中，所述的“部分”可以是20-500bp的長度。有了這“部分”序列，即可形成轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列。所述轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列更優(yōu)選的形式是包括192bp的載體序列和127bp與該載體序列相鄰接的大豆基因組序列。優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列如SEQ ID NO. 2所示，其中第1位到第192位是外源插入載體序列，其中第193位到第319位是相鄰接的大豆基因組序列。本發(fā)明中，所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點。本發(fā)明中所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段，是指大豆凝集素基因中具有大豆凝集素基因特異性的片段。在大豆凝集素基因中，全長基因的第10 位 第1579位的片段是具有特異性的。本發(fā)明所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段優(yōu)選的就是選自Lectin全長基因的第 1029位至第1579位的連續(xù)的50-550bp的核苷酸片段，最優(yōu)的就是Lectin全長基因的第 1029位至第1579位的片段。優(yōu)選的，所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。本發(fā)明所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的序列較佳的如SEQ ID NO. 10所示，其中第 1336位到第20 位為結(jié)構(gòu)特異性序列，第986位到第1305位為品系特異性序列，第413位到第963位為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建方法本發(fā)明所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02構(gòu)建方法，包括以下步驟①利用數(shù)據(jù)庫(比如Genbank、上海市轉(zhuǎn)基因生物安全性檢測評估共享服務(wù)平臺 http://www. shgmo. org/welcome. htm)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列、大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin序列。②設(shè)計PCR特異性引物；所述的PCR引物，指的是長度為的寡核苷酸鏈，其與轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列或者大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段完全相同或互補。較佳的，擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列的引物對中，一條引物的序列是 SEQ ID N0. 4，另一個是 SEQ ID N0. 5。擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列的引物對中，一條引物的序列是 SEQ ID N0. 6，另一個是 SEQ ID N0. 7。擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段的引物對中， 一條引物的序列是SEQ ID N0. 8，另一個是SEQ ID N0. 9。③特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。所謂的特異性擴增，指的是利用設(shè)計的PCR引物特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。
④分別依次將PCR擴增得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段克隆至克隆質(zhì)粒載體上，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02 ；所述的克隆，指的是將上述PCR擴增得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段按照設(shè)計的限制性內(nèi)切酶酶切位點依次連接到質(zhì)粒載體上，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PXL02。所述的質(zhì)粒載體可以是任何常規(guī)載體，較佳的是克隆載體，更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，如 pUC19、pUC18，，pUC118，pUC119, pUC19, pBlueScript II SK 或 pGEM系列載體。⑤測序驗證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的序列。⑥質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的定量PCR檢測方法驗證。所述的定量PCR檢測方法驗證，是指檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02在進(jìn)行定量PCR分析時的特異性、靈敏度、重復(fù)性和重演性等特性，以鑒定該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子替代轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力，以及實際應(yīng)用于定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的測定有效性。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的定量方法本發(fā)明所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的定量方法，包括以下步驟①提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02 ；②根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的堿基組成和序列長度，計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的磷元素的含量；③配制梯度濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用此標(biāo)準(zhǔn)溶液作出ICP-MS的標(biāo)準(zhǔn)曲線。④ICP-MS檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的
磷含量。⑤據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的磷含量計算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的濃度。下面對本發(fā)明的實施方式作詳細(xì)說明。本實施例在本發(fā)明技術(shù)方案的前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方未能，通常按照常規(guī)條件操作，如可參照Sambrook等編著分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗的操作間的溫度， 一般為25 °C。實施例1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建一、實驗試劑限制性內(nèi)切酶Kpnl、Hindlll、XbaI,以及限制性內(nèi)切酶對應(yīng)緩沖液購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。pUC19 載體、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、dNTP、DL2000 Marker購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；DNA引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。二、實驗儀器
DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)PTC-100 型 PCR 擴增儀(MJ Research Inc.)DNA電泳分析系統(tǒng)，包括暗箱、數(shù)碼照相機、計算機、掃描儀、噴墨打印機、光敏打印機、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖像分析軟件(上海天能公司)其它儀器包括離心機、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、天平等。三、實驗方法和過程1、在GenBank中搜索大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin ；在上海市轉(zhuǎn)基因生物安全性檢測評估共享服務(wù)平臺(http://www.shgmo.org/welcome.htm)上查詢獲得轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的外源插入載體在轉(zhuǎn)基因作物中的具體插入方式和拷貝數(shù)，并查閱外源插入載體中主要元件的序列信息。2、構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的PCR引物序列設(shè)計構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的示意圖見圖1。根據(jù)獲得的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源插入序列信息，利用軟件I^rimer 5.0設(shè)計兩對PCR引物。一對引物用于擴增轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性基因，一條引物位于35S啟動子序列上，一條位于CP4 EPSPS基因序列上；另一對引物用于擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性基因，一條引物位于大豆基因組上，另一條位于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的外源插入載體上。另外設(shè)計一對引物用于擴增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性序列。各引物的兩端加上分子克隆所需的酶切位點及保護(hù)堿基。在引物設(shè)計過程中，力求使構(gòu)建的質(zhì)粒適用于更多的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的檢測，質(zhì)粒中包含的序列既可適用于結(jié)構(gòu)特異性序列擴增，也可適用于品系特異性序列擴增， 同時要兼顧檢測結(jié)果的特異性。具體的引物序列見表1。 表1.構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的PCR引物序列
目標(biāo)序列引物引物序列(5’ 3、)擴增片段大小(bp)結(jié)構(gòu)特異性序列正向CCCAAGCTTGATGACGCACAATCCCACTATCC709反向CCCAAGCTTGTCGCCGATGAAGGTGCTGTC品系特異性序列正向TGCTCTAGAGATCGGAGTTTCTCCTCCTGC337反向TGCTCTAGACAATTGCGTGGTGAACTTTCTGLectin正向CGGGGTACCTTGGTACTGGTGCTACTGACC570反向CGGGGTACCGGTGGAGGCATCATAGGTAA3、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列的擴增根據(jù)表1的引物，以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因組DNA為模板，對其結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列進(jìn)行PCR擴增(反應(yīng)體系和條件見表2、3)，得到 709bp的結(jié)構(gòu)特異性序列、337bp的品系特異性序列和570bp的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Lectin基因序列。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。表2.構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的PCR擴增體系
反應(yīng)試劑用量(UL)IOXbuffer2dNTP(2. 5mM)1上游引物(IOnM)1下游引物(IOnM)1Taq酶(2. 5單位/反應(yīng))1DNA模板1續(xù)20補足至20 μ L 表3.構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的PCR擴增條件
循環(huán)數(shù)溫度(°c)時間1955分鐘309535秒5735秒7240秒1725分鐘4、將PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒載體PUC19上分別用限制性內(nèi)切酶HindIII消化擴增得到的結(jié)構(gòu)特異性序列與載體pUC19，回收酶切后的結(jié)構(gòu)特異性序列及線性質(zhì)粒PUC19，T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到中間質(zhì)粒分子pUC19_l。分別用限制性內(nèi)切酶^CbaI消化擴增得到的品系特異性序列與中間質(zhì)粒分子pUC19_l，回收酶切后的品系特異性序列及線性中間質(zhì)粒pUC19_l， T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，得到中間質(zhì)粒分子pUC19_2。用限制性內(nèi)切酶KpnI消化擴增得到的Lectin基因特異性序列與中間質(zhì)粒分子pUC19_2，回收酶切后的Lectin序列及線性中間質(zhì)粒pUC19_2，T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02，見圖2。酶切反應(yīng)體系及連接體系見表4、5。表4.酶切反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于，含有轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列是部分35S啟動子序列、CTP4序列以及部分CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段；所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列是轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源插入載體以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的核苷酸片段，所述的“部分”是50-500bp的長度；其特征在于，所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 Lectin是大豆凝集素基因。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法， 其特征在于，包括以下步驟①利用引物通過PCR特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段；②分別依次將PCR擴增得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段克隆至克隆載體上，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子 pXL02。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，其特征是， 所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列是部分35S啟動子序列、CTP4序列及部分 CP4 EPSPS序列所組成的核苷酸片段；所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的品系特異性序列是轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源插入載體以及與該外源插入載體相鄰接的大豆基因組序列所組成的核苷酸片段；所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin是大豆凝集素基因。
5.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法， 其特征是，所述的特異性擴增是利用設(shè)計的PCR引物特異性擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。
6.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法， 其特征是，所述的克隆是將上述PCR擴增得到的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、 品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段依次連接到質(zhì)粒載體上，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PXL02。
7.—種如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的定量方法， 其特征在于，包括以下步驟①提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02；②根據(jù)步驟①所得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02的堿基組成和序列長度，計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子 PXL02分子中的磷元素的含量；③配制梯度濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用此標(biāo)準(zhǔn)溶液作出電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜 (ICP-MS)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。④ICP-MS檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02溶液，并根據(jù)步驟③所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02溶液的磷含量。⑤根據(jù)步驟④所得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL02溶液的磷含量和步驟②所得的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02分子中的磷元素的含量，計算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL02的濃度。
8.如權(quán)利要求7所述的所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的定量方法，其特征是，ICP-MS參數(shù)如下RF power為1100W，霧化氣流量為1. 08L/min，輔助氣流量為 1. 2L/min，等電子體氣流量為16L/min。
9.一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR檢測方法，其特征是，所采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是如權(quán)利要求1或2所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。
10.如權(quán)利要求1或2所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的核酸定量PCR 檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。通過對轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的外源插入基因序列的分析，設(shè)計引物PCR擴增獲得其結(jié)構(gòu)特異性序列、品系特異性序列及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段；通過分子克隆的方法構(gòu)建到一個質(zhì)粒分子中形成人工重組質(zhì)粒分子pXL02；用電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜(ICP-MS)的方法檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的含磷量，從而換算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的濃度。本發(fā)明中構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子完全可以替代轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2陽性標(biāo)準(zhǔn)品，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子完全適用于對轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2樣品的結(jié)構(gòu)特異性、品系特異性定量PCR分析和檢測。
文檔編號C12N15/66GK102517393SQ20111043921
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者丁敏, 任淑貞, 劉剛, 孫榮榮, 徐勤, 李蘭英, 許麗, 龔飛雁 申請人:上海市計量測試技術(shù)研究院