專利名稱：用于腫瘤早期診斷的多基因聯(lián)合檢測(cè)的探針、引物及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物試劑，具體涉及用于腫瘤早期診斷的多基因聯(lián)合檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤是危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病，是導(dǎo)致人類死亡的最主要死因之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)顯示，2008年全球腫瘤新發(fā)病例約為1270萬，腫瘤死亡例數(shù)為760萬。目前全球每年新增腫瘤患者約為900萬人，預(yù)計(jì)到2020年全世界腫瘤發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%，全球每年新增腫瘤患者人數(shù)將達(dá)到1500萬人。我國腫瘤的發(fā)病率和死亡率居世界之首，每年死于腫瘤的人數(shù)超過160萬，腫瘤發(fā)病率約為200/10萬人，每年新發(fā)病例高達(dá)220萬人，中國每4個(gè)死亡者中就有一個(gè)死于腫瘤，居死亡原因之首。腫瘤的早期診斷，早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高腫瘤患者生存率的最重要的途徑，其中早期診斷是關(guān)鍵，是提高腫瘤患者的治愈率，延長生存期的首要環(huán)節(jié)。臨床研究表明，腫瘤早期診斷并及時(shí)給予科學(xué)的治療，其5年生存率能提高到80% -90%，其中有50%以上的腫瘤是可以治愈的，如，乳腺癌早期診斷并給予科學(xué)的治療，其5年生存率可高達(dá)85%，而晚診斷者只有50%。肺癌早期診斷并給予科學(xué)的治療，5年生存率可達(dá)90%，而晚期診斷的生存率僅占為45%。因此，腫瘤早篩查、早診斷是提高腫瘤治療效果關(guān)鍵，是延長患者生存期，提高治療效果的重要途徑。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展涉及到多基因的驅(qū)動(dòng)性突變，是由驅(qū)動(dòng)性突變基因所引起的多步驟、多階段的一個(gè)惡性轉(zhuǎn)變過程。目前研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的驅(qū)動(dòng)性突變基因主要有 P53、KRAS, EGFR、BRAF, PIK3CA 和 MEKl 等基因。多項(xiàng)研究表明，P53、KRAS, EGFR、BRAF, PIK3CA和MEKl等基因在腫瘤中有較高突變率，其單個(gè)基因篩查敏感度約為20-60%。然而，大部分單個(gè)基因檢測(cè)用于腫瘤早期篩查，其檢測(cè)敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測(cè)可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度，研究顯示，運(yùn)用多基因聯(lián)合檢測(cè)的敏感度可以到達(dá) 60 -93 。Ye 等人(Ye et al. , Genetics and Molecular Research2009. 8 ；1509-1518)同時(shí)檢測(cè)p53，pl6、Rb、EGFR基因，結(jié)果表明聯(lián)合檢測(cè)四個(gè)基因用于肺癌早期診斷的敏感度為68%，準(zhǔn)確率達(dá)72. 3%。Wu等人(Wu et al.，Medical Journalof Wuhan University 2009. 22 ;47_49)聯(lián)合 p53、KRAS、pl5、pl6 四基因作為肺癌早期診斷的指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)其敏感度為78%,特異度為93%。Ahlquist等人(Ahlquist et al.,Gastroenterology 2000. 119 ; 1219-1227)的聯(lián)合檢測(cè)了 APC、KRAS、P53、BAT26 和 L-DNA 基因，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)上述6個(gè)基因診斷結(jié)腸癌的敏感度可以高達(dá)91 %。因此，通過聯(lián)合檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的驅(qū)動(dòng)性突變，對(duì)于腫瘤的早期篩查或診斷，提高腫瘤患者的治愈率，改善預(yù)后 有重大意義。血液檢測(cè)是臨床腫瘤早期篩查和診斷的重要手段之一，具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、小創(chuàng)傷、便于在同一患者多次重復(fù)進(jìn)行，易于被患者接受，臨床應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。通過檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物或腫瘤相關(guān)基因驅(qū)動(dòng)突變已成為臨床腫瘤檢測(cè)主要檢測(cè)靶標(biāo)，腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)通常是基于蛋白水平檢測(cè)，通過檢測(cè)血液中腫瘤特異特異表達(dá)蛋白達(dá)到腫瘤的早篩查、早診斷。目前，臨床檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的方法主要有酶聯(lián)免疫技術(shù)和熒光免疫技術(shù)，通過檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)進(jìn)行早期腫瘤診斷，但這種方法操作復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度低、費(fèi)用高、不能滿足臨床篩查，診斷和檢測(cè)的實(shí)際需求，從而使腫瘤患者錯(cuò)失了最佳的治療時(shí)期。因此，酶聯(lián)免疫等檢測(cè)技術(shù)不能達(dá)到臨床應(yīng)用的實(shí)際需求。臨床迫切需要開發(fā)一種高靈敏度、高特異度的檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)采用高靈敏度檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)腫瘤早期篩查或診斷，從而為腫瘤的早期篩查或診斷提供科學(xué)參考依據(jù)。針對(duì)上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測(cè)的試劑盒，通過聯(lián)合檢 測(cè) p53、KRAS、EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)、BRAF、PIK3CA (Phosphoinositide-3-kinase)和MEKl 6個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期篩查或診斷。本發(fā)明設(shè)計(jì)運(yùn)用一種新型環(huán)形引物，大幅度提高檢測(cè)的靈敏度。該檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)到0. 1%，同時(shí)具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤早期篩查或診斷多基因聯(lián)合突變檢測(cè)試劑盒的引物及探針，包括有P53、KRAS, EGFR、BRAF, PIK3CA和MEKl驅(qū)動(dòng)性基因突變的檢測(cè)探針和引物，通過對(duì)驅(qū)動(dòng)性突變的聯(lián)合檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，其特異引物與探針包括如下序列表1P53驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針核苷酸序列
權(quán)利要求
1.用于腫瘤早期診斷的探針和引物，其特征在于，包括以下的探針和引物中的至少ー組 (1)P53驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQID NO =I-SEQ ID NO 15 ； (2)KRAS驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQID NO :16_SEQ ID NO :35 ; (3)EGFR驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQ ID NO :36_SEQ ID NO :59 ; (4)BRAF驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQ ID NO :60_SEQ ID NO :62 ; (5)PIK3CA驅(qū)動(dòng)突變檢測(cè)探針和引物SEQID NO :63_SEQ ID NO :80 ;或 (6)MEK1驅(qū)動(dòng)突變檢測(cè)探針和引物SEQID NO 81-SEQ ID NO :91。
2.用于腫瘤早期診斷的多基因聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如下的探針和引物 p53驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQ ID NO : I-SEQ ID NO 15 ； KRAS驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQ ID NO :16_SEQ ID NO :35 ； EGFR驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQ ID NO :36_SEQ ID NO :59 ; BRAF驅(qū)動(dòng)突變特異性引物和探針SEQ ID NO :60_SEQ ID NO :62 ; PIK3CA驅(qū)動(dòng)突變檢測(cè)探針和引物SEQ ID NO :63_SEQ ID NO :80 ;和 MEKl驅(qū)動(dòng)突變檢測(cè)探針和引物SEQ ID NO 81-SEQ ID NO :91。
3.用于腫瘤早期診斷的多基因聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的設(shè)計(jì)方法，包括 (1)根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的人類p53、KRAS、EGFR、BRAF,PIK3CA和MEKl為野生型基因序列，針對(duì)有P53、KRAS、EGFR、BRAF,PIK3CA和MEKl的突變位點(diǎn)為基礎(chǔ)，來設(shè)計(jì)引物和探針； (2)針對(duì)有p53、KRAS、EGFR、BRAF,PIK3CA和MEKl驅(qū)動(dòng)性突變選定的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并整套的特異性引物和探針； (3)提取檢測(cè)樣本中基因組DNA，包括全血、血液、血漿中的DNA； (4)配制各反應(yīng)熒光PCR擴(kuò)增突變基因反應(yīng)體系； (5)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)反應(yīng)體系的FAM和HEX熒光強(qiáng)度，以HEX信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值Ct > 18表明檢測(cè)DNA在允許范圍內(nèi)，F(xiàn)AM信號(hào)結(jié)果可信；以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為O或31 :陰性；Ct值小于28 :陽性。
4.如權(quán)利要求3所述配制用于p53、KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA和MEKl熒光PCR擴(kuò)增體系，其特征在于，所述熒光PCR體系組成包括 DNA 模板1-7 mL 各引物0.1-1.0 μπιο 各探針O. 1-1. O pmol Taq 酶O. 5-5. O U 甲酰胺1-5%。
dNTPO. 2-5. O mmol MgCL2I. 0-10. O mmol 總體積10-40 mL
5.一種用于腫瘤治療預(yù)后的基因突變檢測(cè)，其特征在于，包括以下的探針和引物中的至少ー組 SEQ ID NO I-SEQ ID NO 91。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于腫瘤早期診斷的多基因聯(lián)合檢測(cè)的探針、引物及試劑盒，本發(fā)明的探針和引物包括SEQ ID NO1-SEQ ID NO91，可以對(duì)p53、KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA和MEK1基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)；可在一個(gè)PCR反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多種驅(qū)動(dòng)性突變；靈敏度高，5-10拷貝的突變可以檢出；特異性強(qiáng)，10ng的野生型基因組DNA不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號(hào)；檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102628077SQ20111043959
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者張海龍, 江風(fēng)閣, 肖桃英, 鄭立謀, 阮力 申請(qǐng)人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司