專利名稱：一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及畜牧業(yè)技術領域，具體地說是一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法及其試劑盒。
背景技術：
退化性軸突病(Degenerative axonopathy)是牛的一種常染色體單基因控制的隱性遺傳病。通過全基因組關聯(lián)分析和單倍體型圖最終確定是由位于牛16號染色體上的線粒體融合素2(MFN2)基因的一個點突變引起的(DrdgemUller C，Reichart U, Seuberlich T, et al. An unusual splice defect in the mitofusin 2 gene(MFN2)is associated with degenerative axonopathy in Tyrolean Grey cattle. PLoS One,2011,6 (4) el8931)。Dr0gemiiller等對44頭患有退化性軸突病牛的DNA測序分析，結果都發(fā)現(xiàn)有一個共同的同義突變位點，SNP c. 2229C>T，它位于MFN2基因第18個外顯子內。c. 2229C > T突變影響了一個CpG 二核苷酸，在哺乳動物中此位點有相當高的突變頻率。c. 2229C > T 突變位點位于一個潛在的外顯子剪接增強子(ESE)基序內。T的突變消除了剪接因子ASF/ SF-2 一個潛在的結合位點，同時，增強了與輔助因子剪接蛋白SC35結合的能力。c. 2229C > T突變影響MFN2基因轉錄的剪接，除了產生野生型轉錄本外，又產生了一個保留第18個內含子的新轉錄本。新轉錄本的第18個內含子前端提前引入了終止密碼子，導致新轉錄本相對于野生型轉錄本缺少最后22個密碼子的開放閱讀框，表達的MFN2蛋白相對于野生型轉錄本缺少一個C末端?；加型嘶暂S突病的牛在1 1. 5月齡時，四肢開始顯示出不斷加重的運動失調， 而且后肢行動不穩(wěn)鍵比前肢表現(xiàn)得更為突出。隨著這些癥狀的加重，最終導致牛呈躺或斜靠體態(tài)。神經病理學發(fā)現(xiàn)受影響牛明顯表現(xiàn)出兩側對稱的軸突退化，使得背側脊髓小腦束和薄束的軸突密度降低(Syring C，Drogemiiller C. Oevermann A, Pfister P, Henke D, et al.Degenerative axonopathy in a Tyrolean Grey calf. J Vet Intern Med,2010,24: 1519-1523)。許多患病的牛在8 10月齡被淘汰，給養(yǎng)牛業(yè)生產帶來了巨大的經濟損失。經系譜記錄分析發(fā)現(xiàn)，這個突變位點最終可以追溯到1972年以前。DrSgemuller 等經研究發(fā)現(xiàn)，該病是由MFN2基因第20個外顯子的一個堿基突變引起的(DriigemUller C, Reichart U, Seuberlich T, et al. An unusual splice defect in the mitofusin 2 gene(MFN2)is associated with degenerative axonopathy in Tyrolean Grey cattle. PLoS One, 2011,6 (4) :el8931)。MFN2基因編碼線粒體融合素2蛋白，屬于一種線粒體膜蛋白。野生型的MFN2編碼757個氨基酸，它是錨定橫跨在線粒體膜外的一種蛋白，蛋白的絕大部分位于細胞質內，包括N末端和C末端。該蛋白可以形成同源和異源二聚體。線粒體是一個非常有活力的細胞器，能夠持續(xù)的融合和裂變。而MFN2介導的二聚化是線粒體的圈合和融合過程中一個必不可少的步驟。此外，MFN2也存在于內質網，并且在線粒體和內質網膜圈合過程中也是必需的。有報道認為，人的軸突神經病進行性神經性腓骨肌萎縮2A2 [Charcot-Marie-Tooth disease_2A2 (CMT2A2)是由于 MFN2 基因突變引起的(Verhoeven
3K, Claeys KG, Ziichner S,et al. MFN2 mutation distribution and genotype/phenotype correlation in Charcot-Marie-Tooth type 2. Brain,2006,129 :2093-2102 ；Calvo J, Funalot B,Ouvrier RA,Lazaro L,Toutain A,et al. Genotype-phenotype correlations in Charcot-Marie-Tooth disease type 2 caused by mitofusin 2 mutations. Arch Neurol, 2009,66 :1511-1516)。在具有軸突神經病進行性神經性腓骨肌萎縮2A2的病人中， 已報道大約有60種由于MFN2突變可引起蛋白質改變，病人表現(xiàn)軸突退化的特征，進而影響到了具有長軸突的外周神經元。在小鼠模型中，MFN2突變引起運動神經嚴重的軸突退化和損害線粒體的融合，進而導致神經元突起中線粒體分布不均勻。然而，線粒體的融合怎樣影響神經元融合和軸突生存的機理仍然是不清楚的。一種假說是線粒體融合缺陷導致了線粒體DNA在細胞器間分布不規(guī)律進而導致了線粒體DNA損失和氧化磷酸化的破壞。損傷的線粒體變得形狀不規(guī)則并且出現(xiàn)運動失調，從而導致了軸突內線粒體積聚。牛退化性軸突病是常染色體單基因突變控制的隱性遺傳病，所以僅僅通過系譜分析來判定是否為退化性軸突病攜帶者是不準確的，而且只是群體上的推斷，對單頭牛而言， 其可靠性不強。因此，通過分子手段并且結合系譜分析開發(fā)一個簡單、快速、可靠性強的檢測攜帶者試劑盒，對于牛分子育種來說具有重要的實踐意義，可以大大減少養(yǎng)牛業(yè)的經濟損失。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術，是利用特異設計的PCR引物擴增目的模板，對PCR擴增片段進行酶切處理，以檢測特定位點堿基突變、插入或缺失等多態(tài)性。其基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶酶切成不同大小片段的DNA，然后進行凝膠電泳檢測。由于不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶，直接可以從凝膠圖上分辨出來。方法簡便，分型時間短。

發(fā)明內容
本發(fā)明的技術任務是解決現(xiàn)有技術的不足，提供一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法及其試劑盒。本發(fā)明的技術方案是按以下方式實現(xiàn)的，該一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法及其試劑盒本發(fā)明目的一是利用PCR-RFLP技術，解決現(xiàn)有技術的不足，設計一對篩查牛退化性軸突病攜帶者的專用引物。篩查退化性軸突病攜帶者的專用引物對命名為MFN2F和 MF職。本發(fā)明目的二是提供一種篩查退化性軸突病攜帶者的方法。其方法是利用待測牛的DNA為模板，用發(fā)明的專用引物對MFN2F和MFN2R進行PCR擴增，然后對PCR產物進行回收，用特異性限制性內切酶TspRI進行酶切，對酶切后的產物進行凝膠檢測，根據(jù)凝膠結果進行判定。如果酶切后凝膠DNA樣品片段大小為307bp的為正常牛；DNA片段為307bp、 225bp和82bp的檢測牛為退化性軸突病攜帶者；DNA片段為225bp和82bp的檢測牛為患有退化性軸突病牛。待測牛DNA樣品來源豐富且操作簡單，可以從牛新鮮或冷凍的血液、精液、組織樣品中提取。一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法，以待測牛的基因組DNA為模板，設計上游引物和下游引物對其進行PCR擴增反應，然后回收PCR擴增片段，用!^stDigest限制酶 TspRI進行酶切，在酶切反應體系酶切后進行凝膠檢測，酶切后凝膠檢測酶切DNA片段為 307bp的待測牛為正常牛；酶切后DNA片段為307bp、225bp和82bp的檢測測牛為退化性軸突病攜帶者；酶切后DNA片段為225bp和82bp的檢測牛為患退化性軸突病牛。一種篩查牛退化性軸突病攜帶者所設計的PCR擴增引物，根據(jù)NCBI中MFN2基因序列設計上游引物MFN2F序列為=SEQ ID NO. 1，下游引物MFN2R序列為=SEQ ID NO. 2。PCR擴增反應采用25 μ 1 PCR擴增反應體系為模板DNA(100ng/μ 1) 1 μ 1，上游引物 MFN2F、下游引物 MFN2R 各(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，2 X Taq PCRMasterMix 12. 5μ1，用雙蒸水(ddH20)補至 25 μ 1。PCR擴增反應條件為94°C變性^iin ；然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 30s，這一步共35個循環(huán)；72°C保持IOmin ；4°C保存。酶切反應體系采用15 μ 1 TspRI酶切反應體系為PCR擴增產物5 μ 1 ； IOXFastDigest 緩沖液 1 μ 1 ；FastDigest 限制酶 iTspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1，酶切反應條件為65°C消化30min。酶切片段用質量濃度為3. 0 4. 0%瓊脂糖凝膠電泳。一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的試劑盒，該試劑盒是上、下游引物(ΙΟμπιοΙ/ L) ；2XTaq PCR MasterMix ；IOXFastDigest 緩沖液；FastDigest 限制酶 TspRI ；雙蒸水 (ddH20) ；50bp DNA Ladder Marker中的一種以上數(shù)量的試劑。25 μ 1 PCR 反應體系包括DNA(100ng/y 1)1μ 1，上，下游引物(10ymol/L)各 0. 5 μ 1，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，雙蒸水(ddH20)補至 25 μ 1。25 μ 1反應體系的PCR程序94°C變性^iin ；然后94°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，這一步共35個循環(huán)；72°C保持IOmin ；4°C保存。15 μ 1酶切反應體系PCR擴增產物5 μ 1 ； 10 X FastDigest緩沖液1 μ 1 ； FastDigest 限制酶 TspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1，酶切反應條件為65°C消化 30min。本發(fā)明目的三是提供一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的試劑盒。試劑盒包括以下試劑其中ZXiTaq PCR MasterMix (含染料)是由 Taq DNA Polymerase (0. 05units/ μ 1)、MgCl2 (4mM)、dNTPs (0. 4mM)構成。(1) 一對篩查牛退化性軸突病攜帶者的專用引物上下游引物MFN2F和下游引物 MFN2R(10ymol/L)；(2)2XTaq PCR MasterMix ；(3)IU/μ L FastDigest TspRI ；(4) IOXFastDigest 緩沖液；(5) ddH20 ；(6) 10 % SDS (十二烷基磺酸鈉)；(6)50bp DNA Ladder Marker。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比所產生的有益效果是本發(fā)明提供了篩查牛退化性軸突病攜帶者所用的一對專用弓丨物及方法。本發(fā)明是根據(jù)退化性軸突病患病牛MFN2基因(NCBI參考序列NC_007314. 3) g. 24029C > T突變，產生了 TspRI限制性酶切位點的原理，從而建立起篩查牛退化性軸突病攜帶者的PCR-RFLP方法。通過分析后設計針對含有突變位點的引物，特異性擴增出307bp的牛MFN2基因含有上述位點的片段(擴增片段中只含有突變位點處的一個TspRI酶切位點)，再經限制性內切酶TspRI酶切后，凝膠電泳后產生307bp的DNA條帶為正常牛；DNA片段為307bp、225bp和 82bp的檢測牛為退化性軸突病攜帶者；DNA片段為225bp和82bp的檢測牛為退化性軸突病牛。本發(fā)明篩查方法操作簡單、快捷、費用低廉、可靠性高。同時根據(jù)篩查方法開發(fā)出相應地檢測試劑盒，使操作更加簡單化、快速、靈敏、可靠性強，一般生產中常規(guī)實驗室都有條件完成，這一發(fā)明可以早期淘汰退化性軸突病攜帶牛，可以大大減少養(yǎng)牛業(yè)的損失，在牛的分子育種中應用前景廣闊，能夠產生可觀的經濟效益和良好的社會效益。


附圖1是本發(fā)明的PCR產物擴增的1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳圖；附圖2是本發(fā)明的MFN2基因分型的3 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中Maker 1 空白對照；Maker 2 正常牛；Maker 3 攜帶牛；Maker 4 患病牛。附圖3是本發(fā)明的實施例二的正常牛MFN2基因測序圖；附圖4是本發(fā)明的實施例二的攜帶牛MFN2基因測序圖；附圖5是本發(fā)明的實施例二的患病牛MFN2基因測序圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明的一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法及其試劑盒作以下詳細說明。實施例11.采用酚-氯仿抽提法從牛血液中提取基因組DNA，包括荷斯坦奶牛DNA80頭，魯西黃牛63頭，瑞士褐牛18頭。設計特異性引物用于擴增牛MFN2基因片段，所用的引物序列為上游引物MFN2F 序列為=SEQ ID NO. 1 5 ‘ -AAGCCCGAGTTTATTTCC-3‘下游引物MFN2R 序列為=SEQ ID NO. 2 5 ‘ -GCACTGTCCTCCCCACA-3‘2.根據(jù)上述檢測牛退化性軸突病攜帶者的試劑盒，利用以下步驟擴增牛MFN2基因片段，擴增的片段用質量濃度為1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。(I)PCR 反應體系:DNA(100ng/y 1)1μ 1,上，下游引物(10ymol/L)各 0· 5μ 1， 2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，用雙蒸水(ddH20)補至 25 μ 1。Q)PCR 反應條件94°C變性 ^iin ；94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，這一步共35個循環(huán)；72°C保持IOmin ；4°C保存。(3)擴增產物的電泳檢測5 μ IPCR擴增產物，加上上樣緩沖液1 μ 1。電泳檢測。 檢測結果為，1個泳道為空白對照，無擴增產物；2-6個泳道為牛DNA樣品檢測結果，均擴增出單一的條帶，大小為307bp，與預期的片段大小一致。
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3. PCR產物的酶切與產物檢測(1) 15 μ 1酶切反應體系PCR擴增產物5 μ 1 ； 10 X FastDigest緩沖液1 μ 1 ； FastDigest 限制酶 iTspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ L· 65°C，酶切 30min。(2)在酶切產物中加入SDS (十二烷基磺酸鈉)，在反應體系中的終濃度為0. 1%， 65 °C，酶切 IOmin。(3)凝膠電泳檢測用質量濃度為3%凝膠對酶切后DNA 15 μ 1進行電泳檢測；電壓 100V ；時間 50min。4.基因分型與結果分析正常個體和攜帶者個體的基因分型結果如下表所示。表1.牛MFN2基因分型結果
權利要求
1.一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法，其特征在于以待測牛的基因組DNA為模板，設計上游引物和下游引物對其進行PCR擴增反應，然后回收PCR擴增片段，用 FastDigest限制酶TspRI進行酶切，在酶切反應體系酶切后進行凝膠檢測，酶切后凝膠檢測酶切DNA片段為307bp的待測牛為正常牛；酶切后DNA片段為307bp、225bp和82bp的檢測測牛為退化性軸突病攜帶者；酶切后DNA片段為225bp和82bp的檢測牛為患退化性軸突病牛。
2.—種篩查牛退化性軸突病攜帶者所設計的PCR擴增引物，其特征在于根據(jù)NCBI中 MFN2基因序列設計上游引物MFN2F序列為SEQ ID NO. 1，下游引物MFN2R序列為SEQ ID NO. 2。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法，其特征在于PCR擴增反應采用25 μ 1 PCR擴增反應體系為模板DNAdOOng/ μ 1) 1 μ 1，上游引物MFN2F、下游引物 MFN2R 各(10ymol/L)0. 5μ 1，2 X Taq PCRMasterMix 12. 5 μ 1，用雙蒸水(ddH20)補至 25 μ 1。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法，其特征在于PCR擴增反應條件為94°C變性^iin ；然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，這一步共 35個循環(huán)；72°C保持IOmin ；4°C保存。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法，其特征在于酶切反應體系采用15 μ 1 TspRI酶切反應體系為PCR擴增產物5μ 1 ；IOXFastDigest緩沖液 1 μ 1 ；FastDigest 限制酶 iTspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1，酶切反應條件為:65°C消化 30min。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法，其特征在于酶切片段用質量濃度為3. 0 4. 0%瓊脂糖凝膠電泳。
7.—種篩查牛退化性軸突病攜帶者的試劑盒，其特征在于該試劑盒是上、下游引物 (10ymol/L) ；2XTaq PCR MasterMix ;10XFastDigest緩沖液；FastDigest 限制醇TspRI ； 雙蒸水(ddH20) ；50bp DNA Ladder Marker中的一種以上數(shù)量的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種篩查牛退化性軸突病攜帶者的方法及其試劑盒，屬于畜牧業(yè)技術領域，該方法以待測牛的基因組DNA為模板，設計上游引物和下游引物對其進行PCR擴增反應，然后回收PCR擴增片段，用FastDigest限制酶TspRI進行酶切，在酶切反應體系酶切后進行凝膠檢測，酶切后凝膠檢測酶切DNA片段為307bp的待測牛為正常牛；酶切后DNA片段為307bp、225bp和82bp的檢測測牛為退化性軸突病攜帶者；酶切后DNA片段為225bp和82bp的檢測牛為患退化性軸突病牛。該篩查方法操作簡單、快捷、費用低廉、可靠性高，這一發(fā)明可以早期淘汰退化性軸突病攜帶牛，可以大大減少養(yǎng)牛業(yè)的損失。
文檔編號C12N15/11GK102424847SQ201110440150
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權日2011年12月26日
發(fā)明者仲躋峰, 張燕, 李建斌, 李秋玲, 李榮嶺, 楊宏軍, 王玲玲, 王秀革, 王長法, 趙秀新, 鞠志花, 黃金明, 齊超 申請人:山東省農業(yè)科學院奶牛研究中心