專利名稱：一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于油料作物種子篩選與鑒定領(lǐng)域，尤其是一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
蓖麻(Ricinus communis L.)為大戟科蓖麻屬雙子葉一年生或多年生草本植物， 是世界十大油料作物之一，具有顯著的種植價(jià)值與工業(yè)價(jià)值。蓖麻種植遍布世界各地，其中以印度、中國及巴西等國家種植面積最為廣泛。蓖麻品種繁多，截止到2011年11月，我國蓖麻種植資源數(shù)據(jù)庫保存有1430個(gè)蓖麻品種，隨著育種技術(shù)的進(jìn)步，新蓖麻品種也不斷涌現(xiàn)。品種的繁多給品種鑒定工作帶來一定困難。目前，常用來進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶標(biāo)記與分子標(biāo)記技術(shù)，其中種子形態(tài)鑒定是根據(jù)種子的外部形態(tài)特征，借助放大鏡、解剖鏡等進(jìn)行觀察，與標(biāo)準(zhǔn)樣品或鑒定圖片及有關(guān)資料進(jìn)行比較，判別真假種子。該法簡單、快速、方便、直觀，但準(zhǔn)確性不高。同工酶標(biāo)記是利用品種之間同工酶的進(jìn)化差異而對品種進(jìn)行鑒定，但其鑒別效果在某些作物尤其是在蓖麻品種鑒定上并不顯著，存在蓖麻品種間親緣較近及傳統(tǒng)鑒定方法中分級標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、準(zhǔn)確性低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺陷。常規(guī)的田間種植鑒定，培養(yǎng)幼苗需3w左右，在此期間，影響因素較多，因而結(jié)果準(zhǔn)確性低。分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境條件、發(fā)育時(shí)期、器官種類等的限制，從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度，可在早期進(jìn)行新品種的鑒定。但目前常用的分子標(biāo)記具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，因此，如何根據(jù)研究材料和研究目標(biāo)選擇最佳分子標(biāo)記種類至關(guān)重要。目前，已有國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用AFLP、SSR、ISSR、SNP、RAPD, SRAP等分子標(biāo)記對來自世界各地不同品種的蓖麻進(jìn)行了基因多樣性的研究，并獲得了一系列的遺傳指紋圖譜。但這些分子標(biāo)記遇到的共同問題都是基因組多樣性較低，一方面是蓖麻本身基因型較少，另一方面與各種分子標(biāo)記各自的缺陷有關(guān)。AP-PCR是通過隨意設(shè)計(jì)或選擇一個(gè)非特異性引物，在不嚴(yán)格條件下，使引物與模板DNA中許多序列產(chǎn)生錯(cuò)配與復(fù)性，再以嚴(yán)格條件進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后通過凝膠電泳分離，比較不同來源基因指紋圖譜，反映出待分析基因組的特征。AP-PCR預(yù)先不需要知道模板具體情況，模板需求量少，質(zhì)量要求低，具有快速、靈敏、通用性好等特點(diǎn)，目前，該技術(shù)已成功用于遺傳指紋作圖、基因定位、系統(tǒng)進(jìn)化以及動(dòng)植物、微生物種類及中藥材鑒別等各領(lǐng)域。隨機(jī)微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)DNA (RMAPD)是2005年藍(lán)賢勇等在RAPD與微衛(wèi)星(SSR)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法。RMAPD是一種新型的分子標(biāo)記，是RAPD 的延伸，經(jīng)證明，該技術(shù)與RAPD并不相同，其在擴(kuò)增程序、擴(kuò)增引物以及重復(fù)性方面都有別于RAPD與SSR。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，微衛(wèi)星標(biāo)記的重復(fù)性最好；RMAPD標(biāo)記次之；RAPD標(biāo)記最差。目前，國內(nèi)已經(jīng)將其運(yùn)用在花生、水稻、蘭花等作物的種質(zhì)資源鑒定上，并取得了良好的鑒定效果?？梢姡@種方法在群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析以及標(biāo)記輔助選擇等動(dòng)植物遺傳育種領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種快速、準(zhǔn)確、低成本、適于小型種子工作站及相關(guān)檢驗(yàn)部門操作的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法及試劑盒。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，步驟如下(1)提取蓖麻種子基因組DNA (2)以步驟(1)獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行AP-PCR擴(kuò)增，引物見序列1 ；(3)對步驟⑵獲得的AP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；(4)以步驟(1)獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行RMAPD擴(kuò)增，引物見序列2和序列 3 ；(5)對步驟(4)獲得的RMAPD擴(kuò)增進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(6)將未知品種的電泳條帶與已知品種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，判斷蓖麻種子品種的真實(shí)性。而且，所述AP-PCR擴(kuò)增的體系和程序如下體系在25μL擴(kuò)增體系中，含2XEasy Tap PCR Super Mix 12. 5μ L,50mM MgCl2 1 μ L，IOmM引物序列1 1 μ L，模板DNA 20ng,用超純水補(bǔ)足剩余體積至25 μ L ；擴(kuò)增程序兩個(gè)循環(huán)94°C 5min,35°C 5min,72°C 5min,40 個(gè)循環(huán) 94°C lmin，50°C lmin，72°C 2min,72°C 2min，最后 72°C IOmin0而且，所述RMAPD擴(kuò)增的體系和程序如下在25μ L RMAPD體系中含2XEasy Tap PCR Super Mix 12. 5 μ L，IOmM引物序列 1和IOmM引物序列3各1 μ L，模板DNA 20ng,超純水補(bǔ)足至總體積25. 0 μ L ；PCR 程序95°C預(yù)變性 ％iin，40 個(gè)循環(huán)，94°C變性 30s — 55°C退火 30s — 72°C延伸 45s — 94°C變性 30s — 36°C退火 60s — 72°C延伸 90s — 72°C延伸 IOmin ；而且，所述聚丙烯酰胺凝膠的配置方法為按分離膠、濃縮膠配方配膠；安裝灌制凝膠的玻璃板，取分離膠，將各成分混勻，灌膠至適宜高度，上部立即加滿去離子水隔離空氣，待分離膠聚合后，除去去離子水；混勻濃縮膠各成分，加至分離膠上，插入齒梳，待濃縮膠聚合；所述分離膠配方為30%丙烯酰胺^mLUOXTBE 10mL、超純水71. 7mL、40%過硫酸銨 200 μ L、TEMED100 μ L,總體積 IOOmL ；所述濃縮膠配方為30%丙烯酰胺4mL、10XTBE 0. 8mL、超純水34. 96mL、40%過硫酸銨 160 μ L、TEMED 80 μ L,總體積 IOOmL ；而且，所述分離膠聚合的時(shí)間為20min ；濃縮膠的聚合時(shí)間為30min。而且，所述步驟(6)的步驟為根據(jù)AP-PCR與RMAPD的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為O ；將得到的數(shù)值進(jìn)行記錄并合并；將已知品種記錄至已建立的數(shù)據(jù)庫。一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的試劑盒，包括盒體、3個(gè)塑料瓶子與7個(gè)1. 5mL離心管，其中3個(gè)瓶子中分別含有2XEasy Tap PCR SuperMix 5mL、10XTBE 緩沖液200mL、TEMED 15mL, 7個(gè)1. 5mL離心管中分別含有40%過硫酸銨lmL、MgCl2lmL、顯色劑、GoldView I 100 μ L、IOmM 引物序列 1 300 μ L、IOmM 引物序列 2 300 μ L、IOmM 引物序列 3 300 μ L0本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1.本發(fā)明采用AP-PCR及RMAPD雙分子標(biāo)記法篩選與鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性與純度，本方法將實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的PCR技術(shù)與電泳技術(shù)相結(jié)合，從取樣到檢測完成只需左右， 且周年都可以進(jìn)行，簡單易行、快速靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確。2.本發(fā)明利用AP-PCR及RMAP D分子標(biāo)記法篩選與鑒定蓖麻種子品種，僅對蓖麻遺傳物質(zhì)DNA進(jìn)行檢測，無需大田鑒定，與其他實(shí)驗(yàn)室技術(shù)相比，可大大提高鑒定準(zhǔn)確性， 節(jié)約成本，僅為傳統(tǒng)表型鑒定成本的十分之一左右，檢測方便、重復(fù)性好。3.本發(fā)明所提供的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的試劑盒，將檢測引物與相關(guān)試劑組合在一起，操作方便，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，結(jié)合常規(guī)的分子生物學(xué)設(shè)備，按提供的操作程序進(jìn)行實(shí)際檢測，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，對幾十份樣品進(jìn)行檢測，其檢測時(shí)間僅需 7_8h，提高了檢測效率與標(biāo)準(zhǔn)化程度。


圖1為本發(fā)明的蓖麻DNA的提取結(jié)果；圖2為本發(fā)明的AP-PCR分子標(biāo)記擴(kuò)增圖譜，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 31為蓖麻測試品種，其中10為待測品種，其他品種為國內(nèi)已知的30個(gè)蓖麻品種；圖3為本發(fā)明的RMAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增圖譜；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 31為蓖麻測試品種，其中10為待測品種，其他品種為國內(nèi)外已知的30個(gè)蓖麻品種。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本實(shí)用新型的實(shí)施例做進(jìn)一步詳述；需要說明的是本實(shí)施例是描述性的，不是限定性的，不能以此來限定本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。本發(fā)明的主要原理是通過對20個(gè)AP-PCR引物及84對RMAPD引物進(jìn)行篩選，得到條帶清晰、多態(tài)性高的最佳引物組合，并由相關(guān)生物技術(shù)公司進(jìn)行合成。經(jīng)AP-PCR及RMAPD 對分別蓖麻品種基因組的不同部位進(jìn)行標(biāo)記，再進(jìn)行聯(lián)合分析得到已知品種圖譜，進(jìn)而對未知品種進(jìn)行真實(shí)性與純度鑒定。本例所述的蓖麻品種均為國內(nèi)外常見商業(yè)品種，編號(hào)依次為1 31，其中編號(hào)10 為待測品種。一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，步驟如下1. 30個(gè)已知蓖麻品種及待測品種基因組DNA提取提取蓖麻種子DNA，采用CTAB法或者其他提取方法提取均可，要求的DNA純度較高，完整性較好，將所有品種DNA的濃度統(tǒng)一稀釋到50ng/ μ L。2. AP-PCR 實(shí)驗(yàn)
在25μ L 的擴(kuò)增體系中，含 2XEasy Tap PCR Super Mix 12. 5μ L,50mM MgCl2 1 μ L, IOmM 引物 1 -TACGGTGGCGGAGCGCAGCA-3“) 1 μ L,模板 DNA 20ng,用超純水補(bǔ)足剩余體積。擴(kuò)增程序兩個(gè)循環(huán)(94 V 5min, 35 V 5min, 72 V 5min)預(yù)變性，40個(gè)循環(huán) (940C lmin，50°C lmin，72°C 2min)，72°C 2min，最后 72°C IOmin03. AP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析配制3%的瓊脂糖凝膠，使用微波爐將凝膠融化至清澈透明時(shí)，冷卻至60°C，按 5yL/100mL 加入 GoldView I，混勻，室溫冷卻凝固。取 IyL DNA 與 5 μ L 6 X Loading buffer (30mM EDTA，0. 05%溴酚藍(lán)、36%甘油，0. 05%二甲苯藍(lán))混合后進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的三分之二位置處停止電泳，用凝膠系統(tǒng)進(jìn)行觀察、照相；4. RMAPD 實(shí)驗(yàn)在25 μ L RMAPD 體系中，含 2XEasy Tap PCR Super Mix 12. 5 μ L，IOmM 引物 2 -ATAATAATAATAATAATA-3“) 1 μ L，IOmM 弓丨物 3 -CAGCACCCAC-3") 1 μ L,模板 DNA 20ng，超純水補(bǔ)足至總體積25. 0 μ L。PCR 程序95°C預(yù)變性 4min — 40 個(gè)循環(huán)(94°C變性 30s — 55°C退火 30s — 72°C 延伸45s — 94°C變性30s — 36°C退火60s — 72°C延伸90s) — 72°C延伸IOmin ；程序結(jié)束后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳按照分離膠的配方(30%丙烯酰胺2anL、10XTBE 10mL、超純水71. 7mL、40%過硫酸銨200 μ L、TEMED100 μ L，總體積IOOmL)配制分離膠，聚合時(shí)間為20min左右；按照濃縮膠配方(30%丙烯酰胺4mL、10XTBE 0. 8mL、超純水34. 96mL、40%過硫酸銨160 μ L、TEMED 80 μ L，總體積IOOmL)配制濃縮膠，聚合時(shí)間為30min左右。安裝灌制凝膠的玻璃板，將分離膠各組分混勻，灌膠至膠板五分之四高度處，上部立即加ImL正丁醇隔離空氣，待分離膠聚合后，除去正丁醇?；靹驖饪s膠各成分，加至分離膠上，插入齒梳，待30min后濃縮膠即可聚合。拔除齒梳，備用；取10 μ L樣品點(diǎn)樣，30mA電流恒流電泳。用5u/100mL的Goldview I染色30min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，照相。6.條帶處理與數(shù)據(jù)分析根據(jù)AP-PCR與RMAPD的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0。將得到的數(shù)值進(jìn)行記錄并合并。7.已知品種數(shù)據(jù)庫的建立及待測品種圖譜根據(jù)凝膠電泳結(jié)果(見圖2與圖3)，建立除待測蓖麻品種之外的已知蓖麻品種數(shù)據(jù)庫(見表1)，將待測品種(編號(hào)10)與其進(jìn)行比對，可準(zhǔn)確檢測出待測品種數(shù)據(jù)與編號(hào)9 一致，進(jìn)而確定該未知品種為與編號(hào)9的品種一致。結(jié)果表明，本鑒定方法準(zhǔn)確，而且具有快速、不受外界干擾等特點(diǎn)。一種利用AP-PCR及RMAPD分子標(biāo)記篩選與檢測蓖麻種子真實(shí)性與純度的試劑盒， 包括盒體、3個(gè)塑料瓶與7個(gè)1.5mL離心管，其中3個(gè)瓶子中分別含有2Xfesy Tap PCR SuperMix 5mL、10XTBE 緩沖液 200mL、TEMED 15mL，7 個(gè) 1. 5mL 離心管中分別包括 40%過硫酸銨 lmL、MgCl2 lmL、顯色劑、GoldView I 100 μ L、IOmM 引物序列 1 300 μ L、IOmM 引物序列 2 300 μ L、10mM 引物序列 3 300 μ L。
試劑盒的使用方法及步驟為(1)已知蓖麻品種及待測蓖麻品種基因組DNA提取采用CTAB法或者其他提取方法提取DNA均可，要求的DNA純度較高，完整性較好，將所有品種DNA的濃度統(tǒng)一稀釋到 50ng/μ L0(2) AP-PCR實(shí)驗(yàn)在 25 μ L擴(kuò)增體系中，含 2XEasy Tap PCR Super Mix 12. 5μ L, 50mM MgCl2 1 μ L, IOmM 引物序列 1 -TACGGTGGCGGAGCGCAGCA-3“) 1 μ L,模板DNA 20ng,用超純水(需自備)補(bǔ)足剩余體積。擴(kuò)增程序兩個(gè)循環(huán)(94°C 5min,35°C 5min,72°C 5min) 預(yù)變性，40 個(gè)循環(huán)(94°C lmin，50°C lmin，72°C 2min)，72°C 2min，最后 72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物用3%瓊脂糖(需自備)檢測，用試劑盒所配的Goldview I進(jìn)行染色。凝膠成像系統(tǒng)下觀察，照相。(3) RMAPD 實(shí)驗(yàn)在 25 μ L RMAPD 體系中，含 2 X Easy Tap PCR Super Mix 12. 5 μ L，IOmM 弓I 物序列 2_ATAATAATAATAATAATA_3~)1 μ L，IOmM 弓| 物序列 3 -CAGCACCCAC-3") 1 μ L,模板 DNA 20ng,超純水補(bǔ)足至總體積 25 μ L。PCR 程序:95°C 預(yù)變性4min — 40個(gè)循環(huán)(94°C變性30s — 55°C退火30s — 72°C延伸4 — 94°C變性 30s — 36°C退火60s — 72°C延伸90s) — 72°C延伸IOmin ；程序結(jié)束后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠配方為30%丙烯酰胺(需自備，其中丙烯酰胺N， N'-甲叉雙丙烯酰胺為四l)28mLU0XTBE 10mL、超純水71. 7mL、40 %過硫酸銨 200 μ L、TEMED100 μ L，總體積lOOmL，聚合時(shí)間為20min ；濃縮膠配方為30%丙烯酰胺％iL、 IOXTBE 0. 8mL、超純水 34. 96mL、40%過硫酸銨 160 μ L、TEMED 80 μ L,總體積 lOOmL，聚合時(shí)間為30min。安裝灌制凝膠的玻璃板，將分離膠各成分混勻，灌膠至膠板五分之四高度處， 上部立即加ImL正丁醇隔離空氣，待分離膠聚合后，除去正丁醇?；靹驖饪s膠各成分，加至分離膠上，插入齒梳。待濃縮膠聚合，拔除齒梳，備用；取10 μ L樣品點(diǎn)樣，30mA電流恒流電泳。用5u/100mL的Goldview I染色30min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，照相。(4)條帶處理與數(shù)據(jù)分析根據(jù)AP-PCR與RMAPD的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶有無分別賦值， 有帶記為1，無帶記為O。將得到的數(shù)值進(jìn)行記錄并合并。(5)已知蓖麻品種數(shù)據(jù)庫的建立及待測蓖麻品種圖譜根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，建立除待測品種之外的已知蓖麻品種數(shù)據(jù)庫，將待測蓖麻品種與其進(jìn)行比對，確定待測蓖麻品種。若比對結(jié)果與已知蓖麻品種數(shù)據(jù)庫不一致，則需增加已知蓖麻品種數(shù)據(jù)庫的品種數(shù)量， 重新建立一個(gè)比已知蓖麻品種數(shù)據(jù)更大的圖譜庫，再按照本專利中的方法進(jìn)行檢測。(6)真實(shí)性及純度檢測任意選取所需檢驗(yàn)蓖麻種子100粒，采用試劑盒及相同方法進(jìn)行聯(lián)合PCR反應(yīng)，計(jì)算相似條帶個(gè)數(shù)，計(jì)算公式為品種純度=(相似條帶蓖麻品種個(gè)數(shù)/100) X 100%。表1利用AP-PCR及RMAPD分子標(biāo)記篩選與鑒定蓖麻種子真實(shí)性與純度的方法的
聯(lián)合數(shù)據(jù)庫
權(quán)利要求
1.一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，其特征在于步驟如下(1)提取蓖麻種子基因組DNA:(2)以步驟(1)獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行AP-PCR擴(kuò)增，引物見序列1；(3)對步驟( 獲得的AP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；(4)以步驟⑴獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行RMAPD擴(kuò)增，引物見序列2和序列3；(5)對步驟(4)獲得的RMAPD擴(kuò)增進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(6)將未知品種的電泳條帶與已知品種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，判斷蓖麻種子品種的真實(shí)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，其特征在于所述AP-PCR擴(kuò)增的體系和程序如下體系在 25μL擴(kuò)增體系中，含2XEasy Tap PCR Super Mix 12. 5μ L,50mM MgCl2 1 μ L，IOmM引物序列1 1 μ L，模板DNA 20ng,用超純水補(bǔ)足剩余體積至25 μ L ；擴(kuò)增程序兩個(gè)循環(huán) 94°C 5min,35°C 5min,72°C 5min,40 個(gè)循環(huán) 94°C lmin,50°C lmin，72°C 2min,72°C 2min，最后 72°C IOmin0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，其特征在于所述RMAPD擴(kuò)增的體系和程序如下在 25 μ L RMAPD 體系中含 2 X Easy Tap PCR Super Mix 12. 5 μ L，IOmM 引物序列 1 和 IOmM引物序列3各1 μ L，模板DNA 20ng,超純水補(bǔ)足至總體積25. 0 μ L ；PCR程序95°C預(yù)變性％iin，40個(gè)循環(huán)，94 °C變性30s — 55°C退火30s — 72°C延伸 45s — 94°C變性 30s — 36°C退火 60s — 72°C延伸 90s — 72°C延伸 IOmin ；
4 .根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，其特征在于所述聚丙烯酰胺凝膠的配制方法為按分離膠、濃縮膠配方配膠；安裝灌制凝膠的玻璃板，取分離膠各成分混勻，灌膠至適宜高度，上部立即加滿去離子水隔離空氣，待分離膠聚合后，除去去離子水；混勻濃縮膠各成分，加至分離膠上，插入齒梳，待濃縮膠聚合；所述分離膠配方為30%丙烯酰胺^mLUOXTBE 10mL、超純水71. 7mL、40%過硫酸銨 200 μ L、TEMED100 μ L,總體積 IOOmL ；所述濃縮膠配方為30%丙烯酰胺4mL、10XTBE 0. 8mL、超純水34. 96mL、40%過硫酸銨 160 μ L、TEMED 80 μ L,總體積 100mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，其特征在于所述分離膠聚合的時(shí)間為20min ；濃縮膠的聚合時(shí)間為30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法，其特征在于所述步驟(6)的步驟為根據(jù)AP-PCR與RMAPD的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶有無分別賦值，有帶記為 1，無帶記為0 ；將得到的數(shù)值進(jìn)行記錄并合并；將已知品種記錄至已建立的數(shù)據(jù)庫。
7.一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的試劑盒，其特征在于包括盒體、 3個(gè)塑料瓶子與7個(gè)1. 5mL離心管，其中3個(gè)瓶子中分別含有2Xfesy Tap PCR SuperMix 5mL、10XTBE緩沖液200mL、TEMED 15mL，7個(gè)1. 5mL離心管中分別含有40%過硫酸銨lmL、 MgCl2lmL、顯色劑、GoldView I 100 μ L、IOmM 引物序列 1 300 μ L、IOmM 引物序列 2 300 μ L、 IOmM引物序列3 300 μ L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用雙分子標(biāo)記鑒定蓖麻種子品種真實(shí)性的方法及試劑盒，步驟如下(1)提取蓖麻種子基因組DNA(2)以步驟(1)獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行AP-PCR擴(kuò)增，引物見序列1；(3)對步驟(2)獲得的AP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；(4)以步驟(1)獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行RMAPD擴(kuò)增，引物見序列2和序列3；(5)對步驟(4)獲得的RMAPD擴(kuò)增進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(6)將未知品種的條帶與已知品種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，判斷蓖麻種子的品種。本方法采用自主開發(fā)的試劑盒和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的PCR技術(shù)與電泳技術(shù)，從取樣到檢測完成只需7h左右，且周年都可以進(jìn)行。簡單易行、快速靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424850SQ201110440718
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者何東, 葉鋒, 李偉, 李貞景, 李風(fēng)娟, 楊朝暉, 王昌祿, 王玉榮, 陳勉華 申請人:天津科技大學(xué)