專利名稱：：利用光合作用生產(chǎn)替代能源的基因工程藍(lán)藻的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可再生能源和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體的，本發(fā)明涉及通過對野生藍(lán)藻的基因工程改造制備具有通過光合作用高效生產(chǎn)替代能源的能力的藍(lán)藻，以及使用所述藍(lán)藻生產(chǎn)替代能源的方法。
背景技術(shù)：
：石化能源為國民經(jīng)濟(jì)與社會發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，隨著時間的推移，其價格必將因儲量的減少和開采量的下降而上漲。中國為能源消費大國，對石化能源的高度依賴所帶來的環(huán)境、氣候變化問題以及能源供給矛盾長期制約著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。2008年，中國能源消費結(jié)構(gòu)中煤炭占近70%。根據(jù)海關(guān)總署的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2008年中國石油凈進(jìn)口量已超過2億噸，占石油消費總量的52%。據(jù)專家預(yù)測，未來中國的石油和天然氣供應(yīng)將出現(xiàn)更大的供需缺口。此外，中國的電力行業(yè)高度依賴煤炭資源，是造成威脅著電力供應(yīng)的“煤炭矛盾”長期存在的根本原因之一。因此，可再生能源在中國具有長遠(yuǎn)的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景，其使用不僅可為中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供有力的保障，也可成為中國經(jīng)濟(jì)的新的增長點。國內(nèi)市場對于可再生能源投資和消費的增加是我國擴(kuò)大內(nèi)需的新動力。此外，可再生能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必然對相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到帶動作用，這將使我國的國民經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)更加合理。進(jìn)入21世紀(jì)以來，國際原油價格居高不下，太陽能、風(fēng)能、潮汐能等開發(fā)利用成本居高不下，而各國對環(huán)境保護(hù)的要求在不斷的提高，因此，如何開發(fā)替代能源的問題受到各國普遍關(guān)注。許多國家將加快發(fā)展可再生能源作為發(fā)展替代能源的重要戰(zhàn)略，生物能源是其中發(fā)展最快的領(lǐng)域。目前的液體生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。在我國人多地少的特殊背景下，生物燃料的快速發(fā)展面臨著糧食安全和土地淡水資源緊缺問題?，F(xiàn)有技術(shù)通過燃料乙醇產(chǎn)業(yè)作為替代能源，但是，隨著燃料乙醇產(chǎn)量增加，糧食供給短缺和價格上漲導(dǎo)致以糧食為原料的生物能源產(chǎn)業(yè)不能持續(xù)性發(fā)展。近幾年大力發(fā)展的非糧燃料乙醇和生物質(zhì)發(fā)電產(chǎn)業(yè)同樣受到我國客觀條件的制約，難以滿足大規(guī)模替代化石燃料的規(guī)模和成本要求。以木薯、甜高粱、纖維素為原料的燃料乙醇產(chǎn)業(yè)從本質(zhì)上說是以種植業(yè)為基礎(chǔ)的，需要大規(guī)模投入可耕地、淡水、化肥以獲得較高產(chǎn)量，而這些資源在我國均為稀缺資源，用于替代化石能源將對我國整體資源環(huán)境造成巨大壓力。因此，迫切需要開發(fā)不占用可耕地、淡水、化肥資源的新型生物能源技術(shù)，為我國可再生能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供具備現(xiàn)實可行性的手段，切實有效減少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促進(jìn)基于化石能源的傳統(tǒng)工業(yè)體系向基于可再生能源的綠色工業(yè)體系轉(zhuǎn)化。對微生物進(jìn)行基因工程改造來生產(chǎn)能源是能源產(chǎn)業(yè)中的一個發(fā)展方向。但現(xiàn)有技術(shù)中，工業(yè)上主要是利用具有乙醇代謝途徑的異養(yǎng)微生物，例如酵母和大腸桿菌等。發(fā)明名稱為“突變酵母的乙醇產(chǎn)生”的中國專利98808832.0公開了培養(yǎng)呼吸缺陷型酵母細(xì)胞，通過基因工程方法令其具有至少一種呼吸所需的在生長培養(yǎng)基中無功能和/或被抑制的核基因或其產(chǎn)物。該方法可用于燃料乙醇的生產(chǎn)或用于酒精飲料的生產(chǎn)。發(fā)明名稱為“基因修飾酵母物種和使用基因修飾酵母的發(fā)酵方法”的中國專利200480019052.8公開了用外源木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。額外的基因修飾增強(qiáng)了所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將木糖發(fā)酵成乙醇或者其產(chǎn)物的能力。那些修飾包括缺失非特異或特異的醛糖還原酶基因、缺失木糖醇脫氫酶基因和/或超表達(dá)木酮糖激酶。該方法可用于燃料乙醇的生產(chǎn)或用于酒精飲料的生產(chǎn)。發(fā)明名稱為“大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌及其應(yīng)用”的中國專利200710177003.2公開了一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。經(jīng)多代的定向篩選得到了高耐乙醇的大腸桿菌突變株，并在所述突變株中轉(zhuǎn)入了運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因，得到了一種新型耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。該工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時，在高濃度乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率，而且有較高的乙醇轉(zhuǎn)化率。然而現(xiàn)有技術(shù)都是利用本身具有乙醇代謝途徑的異養(yǎng)微生物來生產(chǎn)乙醇。藍(lán)藻是一種自養(yǎng)微生物，是目前地球上最廣泛的生物體。藍(lán)藻的細(xì)胞質(zhì)中都有內(nèi)膜系統(tǒng)。藍(lán)藻的細(xì)胞質(zhì)中具原始的片層結(jié)構(gòu)，片層上分布有光合色素葉綠素a和藻膽素(包括藻藍(lán)素和藻紅素兩種)及類胡蘿卜素。藍(lán)藻的葉綠素可以進(jìn)行光合作用，并且其細(xì)胞可以提供光合作用所需的能量，所以藍(lán)藻可以進(jìn)行光合作用，產(chǎn)生自己所需要的物質(zhì)，即可以自養(yǎng)。但是，自然存在的光合細(xì)菌藍(lán)藻通常不能利用陽光和二氧化碳合成乙醇，僅在避光和無氧條件下通過發(fā)酵產(chǎn)生少量乙醇。因此，工業(yè)上需要一種簡單、廉價、能夠充分利用自然的陽光、水、工廠排放氣中的二氧化碳和不能種植農(nóng)作物的土地來大量生產(chǎn)乙醇的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以藍(lán)藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑的丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因?qū)胨{(lán)藻的染色體，形成具有穩(wěn)定遺傳性狀和較高乙醇產(chǎn)率的基因工程菌株，使得改造的藍(lán)藻菌株能夠利用陽光、水和二氧化碳生產(chǎn)替代能源產(chǎn)品。本發(fā)明還對基因工程菌株進(jìn)行適應(yīng)咸水的定向誘導(dǎo)進(jìn)化，從而使得改造的藍(lán)藻菌株能夠利用陽光、水和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明還提供了制備基因工程藍(lán)藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，并整合到藍(lán)藻染色體上。本發(fā)明還提供了基因工程藍(lán)藻通過光合作用利用陽光、水和二氧化碳制備乙醇的方法。本發(fā)明提供了一種基因工程藍(lán)藻，其含有能夠利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因修飾。通過基因修飾，令不能通過光合作用合成乙醇的藍(lán)藻具備能夠通過光合作用，利用陽光、水和二氧化碳大量生產(chǎn)乙醇的能力。本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因。外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)分別編碼具有丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶活性的蛋白。本發(fā)明使用的宿主是藍(lán)藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隱球藻屬(Aphanocaps)、魚腥藻屬(Anobaena)、念珠藻屬(Nostoc)、顫藻屬(Oscillatoria)、聚球藻屬(Synechococcus)、球藻屬(Gloeocapsa)、阿格藻屬(Agmmenellumm)、雙歧藻屬(Scytonema)或鞭枝藻屬(Mastigocladus)。本發(fā)明的藍(lán)藻優(yōu)選為集胞藻(Synechocystissp.)。在本發(fā)明的一個方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻含有整合到染色體上的編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的核酸。丙酮酸脫羧酶廣泛存在于豆質(zhì)植物、麻黃等植物、釀酒酵母屬(Saccharomycesspecies)、曲霉屬等真菌中，另外運動單胞菌(Zymomonasmobilis)、醋桿菌屬(Acetobacterspecies)中也都含有丙酮酸脫羧酶。不同來源的丙酮酸脫羧酶,性質(zhì)略有不同。本領(lǐng)域已知丙酮酸脫羧酶是一種四聚體，分子量約為250kD左右，其亞基有兩種(a、￠),^亞基的分子量比a亞基的分子量高約5%。PDC的兩個亞基首先形成緊密的二聚體，再由兩個二聚體形成松散的四聚體。其催化機(jī)理為，丙酮酸脫羧酶的催化中心為一個ylide域(ylide-ThDP)，yIide-ThDP攻擊丙酮酸的羧基，生成C2a-乳酸-ThDP，此時ThDP上的噻唑環(huán)在脫羧后作為電子受體而轉(zhuǎn)化為共振穩(wěn)定的烯胺，當(dāng)加入電子給體C2-羥乙基-ThDP時，生成ylide-ThDP并同時釋放乙醛。當(dāng)?shù)孜锱c酶混合時，底物首先是通過氫鍵形式結(jié)合到ThDP中噻唑環(huán)的下面，然后底物旋轉(zhuǎn)至適當(dāng)角度使得底物離催化中心ylide-ThDP一定距離(3.81±0.19)A，甲基基團(tuán)離ylide-ThDP為(3.93±0.33)A時，ThDP的S端的N上的質(zhì)子就會進(jìn)攻底物生成乳酸-ThDP，而與此同時，Asp27就會去質(zhì)子化。不同來源的丙酮酸脫羧酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對各種來源的丙酮酸脫羧酶進(jìn)行了測序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但也具有很多保守的區(qū)域和活性位點。其中，如Genebank報道的，運動單胞菌的丙酮酸脫羧酶具有如SEQIDNO.I的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQIDNO.2的核酸序列。不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但都具有對應(yīng)于SEQIDNO.I的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點。乙醇脫氫酶(Alcoholdehydrogenase,簡稱ADH)大量存在于人和動物肝臟、植物及微生物細(xì)胞之中，是一種含鋅金屬酶，具有廣泛的底物特異性，其分子由兩個亞基組成，其中一個位于酶的活性中心，另一個起穩(wěn)定四級結(jié)構(gòu)的作用。乙醇脫氫酶夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)CH3CH20H+NAD+—CH3CH0+NADH+H+。在人和哺乳動物體內(nèi)，乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶(ALDH)構(gòu)成了乙醇脫氫酶系，參與體內(nèi)乙醇代謝。作為生物體內(nèi)主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，它在很多生理過程中起著重要作用。它是一種廣泛專一性的含鋅金屬酶。乙醇脫氫酶乙醇氧化體系是在肝臟中代謝酒精的一條主要途徑。不同來源的乙醇脫氫酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對各種來源的乙醇脫氫酶進(jìn)行了測序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的乙醇脫氫酶的序列和活性有所區(qū)別。其中，如Genebank報道的，念珠藻屬的其中一種乙醇脫氫酶ADHB具有如SEQIDNO.3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQIDNO.4的核酸序列。不同來源的乙醇脫氫酶的序列有所區(qū)別，但可具有對應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點。本發(fā)明中使用的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶包括不同生物中篩選和基因工程修飾得到的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶。篩選或經(jīng)過基因工程修飾的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶在藍(lán)藻中進(jìn)行活性測試和確認(rèn)。對丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的基因工程修飾包括對該蛋白或基因的氨基酸或核苷酸進(jìn)行突變、刪除或增加。本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因為丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應(yīng)于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應(yīng)于SEQIDN0.3的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻染色體整合的丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有(I)對應(yīng)于SEQIDNO.I的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻染色體整合的乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有(I)對應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻中所述丙酮酸脫羧酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌、酵母、藍(lán)藻和大腸桿菌的丙酮酸脫羧酶基因，優(yōu)選來源于運動發(fā)酵單胞菌。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻中所述乙醇脫氫酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌、酵母、藍(lán)藻、嗜熱醋酸菌、綠屈撓菌、聚球藻的乙醇脫氫酶基因，優(yōu)選來源于念珠藻屬。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻中含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶基因，所述外源丙酮酸脫羧酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌，并且所述外源乙醇脫氫酶來源于念珠藻屬。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.2的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述外源乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.4的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻產(chǎn)生的乙醇由細(xì)胞中擴(kuò)散到培養(yǎng)液中。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻的培養(yǎng)液中溶液乙醇濃度達(dá)到0.5g/L以上，優(yōu)選的，達(dá)到I.5到5g/L。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCNo.5347。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻可以在淡水中或鹽水中培養(yǎng)和生產(chǎn)乙醇，生產(chǎn)乙醇的效率達(dá)到0.5g/L，優(yōu)選的，達(dá)到I.5到5g/L。淡水是指含鹽量小于0.5g/L的水。另外，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻也可以進(jìn)行適應(yīng)咸水的定向誘導(dǎo)進(jìn)化，培育能利用鹽水生產(chǎn)乙醇的菌株。咸水是指溶解有較多氯化鈉(NaCl)(通常同時還有其它鹽類物質(zhì))的水，主要包括海水、湖泊(咸水湖)或人工培養(yǎng)系統(tǒng)的水。本發(fā)明中，咸水中鹽濃度為為1%，優(yōu)選3%，最優(yōu)選5%重量或以下。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻經(jīng)過適應(yīng)咸水的定向誘導(dǎo)，可以在淡水或鹽濃度為1%，優(yōu)選3%，最優(yōu)選5%重量或以下的咸水水體進(jìn)行培養(yǎng)生產(chǎn)乙醇，因此可以在近?；虿糠窒趟M(jìn)行培養(yǎng)和生產(chǎn)。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻可以利用低濃度二氧化碳?xì)怏w或其水溶液為碳源生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻可以直接利用空氣中的二氧化碳。另外，傳統(tǒng)的二氧化碳應(yīng)用領(lǐng)域例如飲料、焊接、制冷、強(qiáng)化石油開采等要求二氧化碳濃度在80-90%以上，而以煤為主要燃料的火力發(fā)電廠排放的煙道氣中二氧化碳濃度較低(8-15%)，不能直接用于傳統(tǒng)二氧化碳應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻可以直接利用和消耗低濃度二氧化碳的氣體，例如來自發(fā)電廠的煙道氣。本發(fā)明的藍(lán)藻利用的二氧化碳?xì)怏w或其水溶液中二氧化碳濃度大于0.5。本發(fā)明還提供了制備基因工程藍(lán)藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，以及表達(dá)丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因所需啟動子導(dǎo)入藍(lán)藻，并整合到染色體上?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)中存在把外源基因轉(zhuǎn)化到藍(lán)藻和整合到染色體上的技術(shù)。藍(lán)藻外源基因表達(dá)載體是其中一種有效的方法。為使外源目的基因的有效轉(zhuǎn)化及表達(dá)，已構(gòu)建了一系列穿棱質(zhì)粒表達(dá)載體和基因整合平臺系統(tǒng)，如pZL、pPKE2、pPKET等。在這些表達(dá)載體上組裝了多種含有不同啟動子的基因表達(dá)盒。應(yīng)用較多的有噬菌體PL和PR啟動子及藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白cpcB2A2操縱子啟動子和熱休克基因groESL等。常用的包括松馳質(zhì)粒復(fù)制起始點的穿梭質(zhì)粒，在監(jiān)操細(xì)胞中有較聞的基因拷貝數(shù)，提聞了目的基因聞效表達(dá)的可能性。外源基因進(jìn)入到藍(lán)藻可能發(fā)生以下情況1.與表達(dá)載體一起游離于染色體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；2、外源基因整合到染色體上并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；3、外源基因整合到染色體上后不轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為基因沉默。因此，需要對外源基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。外源基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個階段。因此，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測過程就是對特異性mRNA和蛋白質(zhì)的檢測。對mRNA檢測的主要方法為Northern雜交法，檢測特異性蛋白質(zhì)的方法包括生化反應(yīng)檢測法、免疫學(xué)檢測法和生物學(xué)活性檢測法等。本發(fā)明的制備基因工程藻類包括以下主要步驟。通過PCT或合成的方法獲得目的基因或目的核苷酸片段，包外源丙酮酸脫羧酶基因、外源乙醇脫氫酶基因，啟動子和/或抗性標(biāo)記基因等核苷酸片段。將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠獨立復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體上，如質(zhì)粒、噬菌體和病毒等，以形成重組DNA分子。DNA片斷與載體的連接方式主要有同聚末端連接、粘性末端連接、平齊末端連接及人工接頭分子連接。重組DNA必須進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中，才能得到擴(kuò)增和表達(dá)。根據(jù)載體的性質(zhì)不同，可采用轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并使其大量繁殖。應(yīng)用于藍(lán)藻遺傳轉(zhuǎn)化的供體DNA大體可分為三類第一類是直接利用未修飾的外源質(zhì)粒，可將外源DNA導(dǎo)入藍(lán)藻。第二類是利用自身染色體或基因組，通過同源重組作為插入突變的有效方法。第三類是使用穿梭載體。穿梭質(zhì)?？梢院兴{(lán)藻質(zhì)粒復(fù)制起點，能夠以復(fù)制子形式獨立存在。穿梭質(zhì)粒還可以帶有與藍(lán)藻基因組相同的序列，從而在進(jìn)入藍(lán)藻后與發(fā)生染色體同源重組，從而穩(wěn)定存在和表達(dá)。本發(fā)明中的外源基因是通過載體導(dǎo)入藍(lán)藻的，載體中包括整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶的核酸部分和啟動子。其中所述外源丙酮酸脫羧酶基因編碼的蛋白具有對應(yīng)于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及其中所述外源乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.2的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述外源乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.4的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，所述載體帶有的其中啟動子為來源于藍(lán)藻的Prbc啟動子、光誘導(dǎo)啟動子、硝酸鹽誘導(dǎo)啟動子或溫度誘導(dǎo)啟動子，優(yōu)選為Prbc啟動子。在本發(fā)明的一個方面，提供了一種具有上述特征的載體，所述載體包括抗生素標(biāo)記(優(yōu)選抗性基因Q片段)，啟動子(例如Prbc啟動子)，丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB片段。本發(fā)明提供的另一種具有上述特征的載體是用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻的穿梭質(zhì)粒，所述載體帶有抗生素標(biāo)記(優(yōu)選抗性基因Q片段)、啟動子(例如Prbc啟動子)、丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB。所述載體還可包括藍(lán)藻基因組片段，從而使得所述丙酮酸脫羧酶和所述啟動子在轉(zhuǎn)換藍(lán)藻后可重組到藍(lán)藻的染色體上。圖I為構(gòu)建本發(fā)明基因工程藍(lán)藻的示意圖。圖2為本發(fā)明基因工程藍(lán)藻在培養(yǎng)液中的生物量、乙醇含量和時間的關(guān)系圖。具體實施例方式本發(fā)明將在下面的實施例中進(jìn)一步說明。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明做出多種改變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實施例I帶有抗生素標(biāo)記、啟動子和運動單胞菌丙酮酸脫羧酶pdc基因的載體PXT117的獲得采用商購的pET28b(Novagen,美國)做為構(gòu)建的載體。rbc啟動子(即Prbc)核酸序列是根據(jù)已報道的集胞藻屬的序列信息(如Genebank的BA000022.2，X65960.I)合成，其序列如SEQIDNo.5所示。丙酮酸脫羧酶pdc基因的核酸序列是根據(jù)已報道的運動單胞菌的pdc基因的核酸序列(如Genebank的X59558.I)合成，其序列如SEQIDNo.2所示。為了克隆到pET28b以及后期的構(gòu)建需要，合成時在Pdc基因序列的3’端增加SpeI位點，NotI位點。另外采用帶有抗壯觀霉素和抗鏈霉素的抗性基因的omegainterposon,即Q片段(參見Prentki,P.,andH.M.Krisch；1984；InvitroinsertionalmutagenesiswithaselectableDNAfragment；Gene29:303-313；以及XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169-176)作為抗性標(biāo)記。合成的Q片段的序列如SEQIDNo.6所示。將Q片段，啟動子Prbc和pdc基因順次連接克隆到pET28b載體上，通過抗性篩選得到質(zhì)粒PXT117。pXT117結(jié)構(gòu)參見圖I。通過PCR核查，確認(rèn)得到帶有Q-Prbc-pdc的插入片段的質(zhì)粒。質(zhì)粒pXT117轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(大腸埃希氏菌，Escherichiacoli),該含有質(zhì)粒PXT117的大腸桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年10月14日，保藏號為CGMCCNo.5348。實施例2念珠藻的乙醇脫氫酶adhB序列的獲得根據(jù)已報道的念珠藻的adhB序列的DNA序列(如Genebank的BA000019)，合成SEQIDNo.4的核酸序列。為了克隆到PXT117，在合成時在該序列的5’和3’端分別添加SpeI位點和NotI位點。實施例3載體的獲得對實施例I獲得的pXTl17和實施例2得到的adhB片段分別用SpeI和NotI進(jìn)行雙酶切，連接后得到PXT125。pXT125結(jié)構(gòu)參見圖I。通過凝膠電泳和測序，確認(rèn)得到帶有Q-Prbc-pdc-adhB插入片段的質(zhì)粒。實施例4帶有抗生素標(biāo)記、啟動子、運動單胞菌pdc基因和念珠藻adhB基因的用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻的穿梭質(zhì)粒的獲得用SphI和NotI雙酶切pXT125，補平粘性接口，回收約5.8kb的片段(即Q-Prbc-pdc-adhB的片段)。用EcoRI酶切質(zhì)粒pKWl188SL，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(大腸埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年10月14日，保藏號為CGMCCNo.5349。其構(gòu)建和結(jié)構(gòu)參見XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13，169-176)，T4DNAPolymerase補平，回收約5.4kb的片段。將上述獲得的Q-Prbc-pdc-adhB的片段與pKW1188SL經(jīng)EcoRI酶切后得到的片段連接，經(jīng)篩選得到如圖I所示的質(zhì)粒PXT127。以上步驟中PCR、酶切、補平、連接等分子克隆技術(shù)操作按照常規(guī)方法進(jìn)行，其中典型操作包括以下方法。PCR:反應(yīng)條件為94°C先變性5min;然后94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延伸2min，共25個循環(huán)；最后72°C反應(yīng)lOmin。大腸桿菌細(xì)胞的化學(xué)轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備LB固體培養(yǎng)基(含抗生素)，使用前室溫下放置2-3小時；-80°C冰柜中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰浴中融化5min;向融化的感受態(tài)細(xì)胞中加入I-IOul連接產(chǎn)物(或質(zhì)粒)，輕輕混勻，冰水浴中放置30分鐘；同時向另一管中加入等體積滅菌水作為對照；42°C熱激90秒，然后立即冰水浴2分鐘；加入ImlSOC液體培養(yǎng)基，37°C、250rpm振蕩復(fù)壯45min_lh；IOOOOrpm離心Imin,沉淀重懸于100_200ulSOC液體培養(yǎng)基；取適量(約IOOul)重懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含抗生素)上，37°C倒置培養(yǎng)，12-20小時后長出菌落。實施例5藍(lán)藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以野生型集胞藻PCC6803為宿主，將實施例4中獲得的帶Q-Prbc-pdc-adhB的質(zhì)粒PXT127轉(zhuǎn)化到集胞藻中。按照以下條件培養(yǎng)野生型集胞藻PCC6803:培養(yǎng)溫度30°C;光照強(qiáng)度50UE.m_2.s—1;培養(yǎng)方式500ml三角瓶培養(yǎng)，通5%C02，接種濃度OD730=0.5;培養(yǎng)基配制BG-Il培養(yǎng)基300ml，高壓蒸汽滅菌后，溫度降低到室溫，加入壯觀霉素，濃度20ug.mL'然后把質(zhì)粒pXT127通過以下步驟轉(zhuǎn)化到PCC6803。5000g離心5分鐘收集藻細(xì)胞；用新鮮BG-Il液體培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次后，按IXIO9Cells.mr1(0D730=2.5)的濃度將細(xì)胞重懸于BG-Il培養(yǎng)基中；溫育，取0.4mL濃縮后的藻液到新的無菌EP管，加入質(zhì)粒pXT127(終濃度10ug.mL-1)混勻，30uE.m_2.s-1光照30°C溫育45hr;涂膜將藻-DNA混合物涂在含有硝酸纖維素膜的BG-Il平板上，光照條件下，30iiE.HT2.S-1JOt:溫育1824hr;轉(zhuǎn)膜將NC膜轉(zhuǎn)移到含有抗生素的BG-Il平板上，于30iiEm_2.培養(yǎng)約一周左右即有轉(zhuǎn)化子長出。挑取轉(zhuǎn)化子在帶壯觀霉素的BG-Il平板上劃線，待藻落富集后再接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步分離篩選。得到帶有pXT127的集胞藻(Synechocystissp.)，命名為PCC6803_pXT127。其中一個菌株(送保藏名QCC003)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年10月14日，保藏號為CGMCCNo.5347。實施例6轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的活性檢測和比較在如實施例5中描述的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)實施例5中獲得的上述PCC6803-pXT127菌株，以PCC6803為空白對照。每兩天取樣一次，每次500ul，使用可見光分光光度計測量培養(yǎng)液的OD73tl,以獲得藍(lán)藻的生物量數(shù)據(jù)。使用山東省科學(xué)院生物研究所生物傳感分析儀SBA-40D測定藍(lán)藻培養(yǎng)液中的乙醇濃度。SBA-40D型生物傳感分析儀利用酶促反應(yīng)來進(jìn)行定量分析，測定的關(guān)鍵傳感器是固定化酶和H202電極復(fù)合傳感器，分析過程基于以下生化反應(yīng)底物+O2+H2O-固趙七_(dá)莫——^產(chǎn)物+H2Q2谷氨酸谷氨酸氧化酶a-酮戊二酸十NH4+葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖酸乳酸乳酸氧化酶丙酮酸乙醇乙醇氧化酶乙酸把轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻培養(yǎng)液12000rpm離心2min，取上清液測量乙醇濃度。按生物傳感分析儀操作指南清洗儀器、定標(biāo)后，使用生物傳感分析儀配套的取樣針取上清液25ul，注入進(jìn)樣孔，儀器給出乙醇濃度讀數(shù)。實施例5中獲得的上述PCC6803-pXT127菌株的生長和生產(chǎn)乙醇與時間的關(guān)系如圖2所示。實施例7對基因工稈藍(lán)藻講行適應(yīng)咸水的定向誘導(dǎo)講化實施例5中獲得的上述PCC6803-pXT127菌株用淡水培養(yǎng)2_3天后，以200目網(wǎng)篩篩選個體較大的健康個體，轉(zhuǎn)移至鹽濃度逐漸增加的培養(yǎng)液中，依次培養(yǎng)2-5天后選擇較大的健康個體。培養(yǎng)液鹽濃度從I%重量開始，按0.5%重量的濃度差逐步增加到5%重量，鹽組分與海水鹽組分相同，即氯化鈉、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣分別占總鹽分的78.4%、9.5%、6.6%、2.I%、3.4%。篩選出的所述菌株在3-3.5%重量保持乙醇連續(xù)生產(chǎn)，基本與淡水產(chǎn)量相當(dāng)。本發(fā)明以藍(lán)藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑基因?qū)肴旧w，形成具有穩(wěn)定遺傳性狀和較高乙醇產(chǎn)率的基因工程菌株。本發(fā)明的基因工程菌株能夠利用陽光、二氧化碳生產(chǎn)乙醇這種替代能源產(chǎn)品。本發(fā)明為解決傳統(tǒng)生物能源技術(shù)的規(guī)模、產(chǎn)量和成本瓶頸提供了新的方法，有助于達(dá)到節(jié)能減排目標(biāo)。本申請中提到的論文或?qū)＠暾埖娜幕虿糠滞ㄟ^引用到本申請中而公開，但不形成對本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化涵括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。此夕卜，顯然“包括”一詞不排除其他單元或步驟，單數(shù)不排除復(fù)數(shù)。權(quán)利要求1.一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因為丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應(yīng)于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列。2.權(quán)利要求I的基因工程藍(lán)藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌，以及乙醇脫氫酶來源于念珠藻屬。3.權(quán)利要求1-2中任一項的基因工程藍(lán)藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的核酸序列，其中所述乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的核酸序列。4.權(quán)利要求中1-3任一項的基因工程藍(lán)藻，其選自集胞藻屬、隱球藻屬、魚腥藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、聚球藻屬、球藻屬、阿格藻屬、雙歧藻屬和鞭枝藻屬，優(yōu)選為集胞藻屬，最優(yōu)選為集胞藻PCC6803。5.權(quán)利要求1-4任一項的所述的基因工程藍(lán)藻，其生產(chǎn)的乙醇由細(xì)胞中擴(kuò)散到培養(yǎng)液中，溶液中乙醇濃度達(dá)到0.5g/L，優(yōu)選的，達(dá)到I.5到5g/L。6.權(quán)利要求1-5任一項的基因工程藍(lán)藻，其在淡水或鹽濃度為1%，優(yōu)選3%，最優(yōu)選5%重量或以下的咸水水體進(jìn)行培養(yǎng)。7.權(quán)利要求1-6任一項的基因工程藍(lán)藻，其保藏號為CGMCCNo.5347。8.制備權(quán)利要求1-7中任一項的基因工程藍(lán)藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，以及表達(dá)丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因所需啟動子導(dǎo)入藍(lán)藻，并整合到藍(lán)藻染色體上。9.用權(quán)利要求1-7中任一項的基因工程藍(lán)藻制備乙醇的方法。10.一種載體，其包括(a)核酸，其包含丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應(yīng)于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及，其中所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列；和(b)啟動子，所述啟動子與所述丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因可操作地連接，優(yōu)選的，其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的核酸序列，其中所述乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的核酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶。本發(fā)明還提供了制備所述基因工程藍(lán)藻的載體和制備方法，以及使用所述基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的方法。文檔編號C12N15/53GK102732426SQ201110443658公開日2012年10月17日申請日期2011年12月27日優(yōu)先權(quán)日2011年1月19日發(fā)明者范文俊,鄭曉光申請人:浙江齊成碳能科技有限公司