專利名稱：胰腺癌變前期KLOTHO基因的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與癌前變的mRNA表達改變(病理演變過程)的相關(guān)檢測技木。
背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國毎年癌癥的新增人數(shù)260萬，死亡人數(shù)近210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是ー組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達地區(qū)可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，毎年的花費是I. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有I萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點是提前做到預(yù)防性篩查，然后及時介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家単位做了ー個年度報告，對1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進行回顧，報告認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是1.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細(xì)胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計思路不完善(動物模型設(shè)計不科學(xué))等。同吋，該報告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子、細(xì)胞流式技木)指標(biāo)來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認(rèn)真討論，2公分以下癌塊屬早期這ー界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度來分析，I公分的腫塊約有一億個腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠不止2億個腫瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和単獨的病灶，可能癌細(xì)胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶吋，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實這時已經(jīng)是晚期診斷和晩期治療，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長足進歩。至今，我們已有可能、在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(癌癥病人、高危人群、家屬史人群、正常對照)，對KLOTHO基因與胰腺癌的早期預(yù)警進行檢測分析?？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，ー種可以延緩衰老的蛋白質(zhì)或許能防治胰腺癌。這種稱為Klotho (克羅托)的蛋白質(zhì)是大腦和腎臟產(chǎn)生的ー種天然激素。通過實驗發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白質(zhì)具有阻止乳腺癌分化的作用，該蛋白質(zhì)出現(xiàn)變異，會大大增加婦女患乳腺癌的幾率。其他ー些國家的研究表明，這種蛋白質(zhì)還具有阻止肝癌和子宮癌細(xì)胞擴散的能力。胰腺癌是ー種侵入性強、擴散迅速、高度惡性腫瘤，近幾年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。患者年齡多在4 0 — 6 0歲。在美國，胰腺癌已被列為第二大消化道腫瘤的死因。在我國的ー些城市，發(fā)病率近2 0年増加了 4倍。無疼痛的阻塞性黃疸和膽囊腫大是胰腺癌的臨床診斷依據(jù)，因此，早期診斷和早期治療是提高和改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵，早期徹底根治腫瘤，5年生存率大于2 0%。然而，早期胰腺癌在臨床上缺乏特異性表現(xiàn)，在黃疸未出現(xiàn)前，胰腺癌常被忽視，容易造成漏診或誤診。有些患者早期雖有些上腹悶脹感或不適，但多未引起重視。由于胰腺癌惡性程度高，極易轉(zhuǎn)移，待出現(xiàn)黃疸就診時，約3 / 4的病人已屬晚期，目前對這種癌還沒有有效的治療方法。實驗顯示胰腺癌病人的體內(nèi)klotho基因表達量降低，癌癥會很·快轉(zhuǎn)移。使用合成的klotho蛋白，注射動物ー兩周后，癌細(xì)胞停止了擴散，腫瘤也逐漸縮小。將KLOTHO的mRNA作為早期篩查胰腺癌變前期有非常重要的臨床診斷意義。KLOTHO的mRNA在胰腺癌變前期及癌變過程中表達量降低的指標(biāo)，作于前列癌變前期篩查、及胰腺癌術(shù)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中，得出了ー種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病,只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此,發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的ー貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的mRNA水平，與癌癥早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預(yù)防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預(yù)防癌癥。目前對KLOTHO基因的研究都采用高通量基因芯片技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料KLOTHO基因mRNA水平的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計了不同數(shù)據(jù)例組(胰腺癌患者、高危人群、正常對照人)例組，用原位雜交技術(shù)進行檢測，結(jié)果表明以上胰腺癌癥病人KLOTHO基因低表達，高危人群有不同程度表達，正常人都是高表達。表明KLOTHO基因胰腺癌變前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技木。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進行探測，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125 I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪ー種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果沒有影響(因為，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上)。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標(biāo)物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晩期治療，導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技木，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先是提供ー種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用干與胰腺細(xì)胞癌變前期篩查及治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供ー種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針如SEQ ID NO. I所示序列，是KLOTHO基因序列中間一段，從1000到1800bp，KLOTHO基因的序列如SEQ ID NO. 2所示，基因的核苷酸序列長度是5102bp，CDS:9……3047bp,位于號染色體13ql2”。(在探針標(biāo)記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp以上，我們會用⑶S的序列來設(shè)計探針，如果CDS的序列也超過IOOObp以上，會采用基因的中間一段堿基序列來合成探針，堿基序列不少于500bp，探針合成后要做序列檢測，并對功能進行臨床意義的分析)。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。
本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的癌變前期KLOTHO基因篩查試劑盒應(yīng)用價值在干，能在mRNA水平，對胰腺癌變前期篩查，及癌變后或術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴散發(fā)生預(yù)警，進一歩配合臨床治療。本發(fā)明還提供ー種KLOTHO基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和
(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 — 24小吋。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或·其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來自胰腺癌患者、胰腺癌高危人群、健康人。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的癌癥高危人群、胰腺癌患者及乳腺癌、肝癌等其它癌癥。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以KLOTHO基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA為檢測對象，合成探針是KLOTHO基因的mRNA序列，檢測的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的RNA的表達量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供KLOTHO基因的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常人KLOTHO基因低表達，即小量顯色，KLOTHO基因在癌癥病人和正常人有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都高。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以KLOTHO基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA合成的核酸探針用地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技木，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的KLOTHO基因表達量，用來確定癌變前期的mRNA變化量，預(yù)警胰腺癌變是否發(fā)生及胰腺癌患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的預(yù)測。因為KLOTHO基因在正常人中高表達，如果KLOTHO基因表達量高，說明患胰腺癌的風(fēng)險低，如何KLOTHO基因表達量降低說明癌變已發(fā)生，或癌癥病人術(shù)后已經(jīng)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，從而獲得癌癥病理演變過程中的早期診斷信息，幫助醫(yī)生及早介入診治。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，當(dāng)檢測到KLOTHO基因的表達量降低或零表達，則可預(yù)測受試者為胰腺癌變病理過程已發(fā)生。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測胰腺癌變發(fā)生和病理演變過程中KLOTHO基因 mRNA表達量的變化，預(yù)警胰腺癌發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標(biāo)志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因轉(zhuǎn)錄的ー級功能產(chǎn)物mRNA水平檢測KLOTHO基因異常表達，在影像醫(yī)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶復(fù)發(fā)之前，癌癥生化 指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患ー個真正的早期診斷以及治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及早預(yù)測。這樣才有可能實施癌癥的早期篩查、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治胰腺癌惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖I是本發(fā)明KLOTHO基因原位雜交技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明實施例中胰腺癌癥病人KLOTHO表達降低圖片。圖3是高危人群圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人KLOTHO表達圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例I
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以KLOTHO基因為檢測目的基因設(shè)計的雜交探針、標(biāo)記物、說明書，其中
本實施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成___
消化液100u L/管I管/盒無色透明液體
保護液100u L/管I管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 u L/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液IOu L/管I管/盒無色透明液體
反義雜交液IOu L/管I管/盒無色透明液體
封閉液1000u L/管I管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體I u L/管I管/盒無色透明液體
顯色劑A175 u L/管I管/盒黃色液體
顯色劑B320 u L/管I管/盒無色透明液體
緩沖液I_|90mL/瓶[!瓶/盒1 黃色或無色透明液體
權(quán)利要求
1.ー種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所不的序列。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.ー種KLOTHO基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權(quán)利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在干，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 — 24小吋。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細(xì)胞標(biāo)本選自癌癥、高危人群、正常人標(biāo)本。
10.KLOTHO基因在制備檢測胰腺癌原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與胰腺癌早期病理演變有密切相關(guān)的生命女神基因(Klotho)的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測Klotho基因的表達量，比影像醫(yī)學(xué)和現(xiàn)有的臨床生化檢測指標(biāo)更早期，能實現(xiàn)真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102660634SQ20111044389
公開日2012年9月12日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司