專利名稱：一種黑曲霉及其發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)岣咧参镧薮己康姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種黑曲霉及其發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)岣咧参锪舸己康姆椒ā?br> 背景技術(shù)：
竹筍，別名筍或閩筍，為多年生常綠草本植物，食用部分為初生、嫩肥、短壯的芽或鞭。竹輿，在我國(guó)自古被當(dāng)作“菜中珍品”，制作出的菜肴風(fēng)味獨(dú)特，煙筍燒肉、煙筍燒鴨、油燜煙筍、煙筍火鍋等菜深受廣大食客朋友的喜愛(ài)和青睞。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為竹筍味甘、微寒，無(wú)毒，具有清熱化痰、益氣和胃、治消渴、利水道、利膈爽胃等功效?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究也表明，竹筍富含蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、多種維生素及鐵、磷、鎂等無(wú)機(jī)鹽和有益健康的18種氨基酸。竹筍還具有低脂肪、低糖、多纖維的特點(diǎn)，食用竹筍不僅能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，幫助消化，去積食， 防便秘，并有預(yù)防大腸癌的功效，竹筍還可以減少人體對(duì)脂肪的吸收，減少與高血脂有關(guān)疾病的發(fā)病率。此外，竹筍含脂肪、淀粉很少，屬天然低脂、低熱量食品，是肥胖者減肥的佳品。近年來(lái)隨著人們物質(zhì)生活水平的日益提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，竹筍的需求量越來(lái)越大，同時(shí)產(chǎn)生了大量竹筍殘?jiān)Ｖ窆S殘?jiān)侵窆S加工過(guò)程產(chǎn)生的剩余物，包括筍頭和筍衣，占竹筍的50 70%。2010年我國(guó)產(chǎn)生的竹筍殘?jiān)鼮?50 200萬(wàn)噸，其中僅重慶地區(qū)就高達(dá)30萬(wàn)噸，大量的竹筍殘?jiān)唇?jīng)充分利用便遭丟棄，不僅造成資源的浪費(fèi)，而且對(duì)環(huán)境和生態(tài)造成嚴(yán)重影響，其所帶來(lái)的環(huán)境生態(tài)問(wèn)題亟待解決?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明竹筍殘?jiān)⒉皇呛翢o(wú)益處的廢棄物，其含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，其中以植物留醇含量最高。植物留醇是一種存在于植物中的天然活性物質(zhì)，具備無(wú)毒無(wú)害、乳化、穩(wěn)定等特性，不僅可直接用于消炎、降血脂、抗?jié)兒头乐伟┌Y等，也是生產(chǎn)甾體藥物的重要原料，隨著生命科學(xué)、油脂科學(xué)與工程技術(shù)的迅速發(fā)展，植物留醇在醫(yī)藥、食品、化工和飼料等領(lǐng)域得到了關(guān)注和重視。竹筍中的植物留醇含量隨竹筍品種及部位的不同存在明顯差異，其中谷甾醇、豆留醇及膽留醇占95%以上。藥理藥效研究結(jié)果表明，竹筍中的植物留醇能顯著降低高脂血癥大鼠血清總TC、TG、LDL-C含量和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，而對(duì)HDL-C含量沒(méi)有影響；能有效降低大鼠肝臟TC、TG水平，減輕脂肪肝和降低肝指數(shù)，對(duì)肝臟的色澤、質(zhì)地、體積有顯著改善作用；同時(shí)，還具有顯著的抗炎作用；并且對(duì)白血病細(xì)胞有明顯的抑制功能。我國(guó)有著豐富竹筍資源及竹筍加工下腳料-竹筍殘?jiān)?，可作為制取植物留醇開(kāi)發(fā)研究的理想資源。因此，隨著植物留醇制取方法研究的深入，竹筍及其殘?jiān)懈吆恐参镧薮嫉乃幱脙r(jià)值將越來(lái)越受到人們的重視，特別是當(dāng)前天然功能性制品深受消費(fèi)者青睞，所以利用竹筍及竹筍殘?jiān)_(kāi)發(fā)制取植物留醇及其功能性制品的前景非常廣闊。目前，在竹筍植物留醇的制取方法方面，主要有溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、 短分子蒸餾法、發(fā)酵法等。超臨界ω2流體萃取竹筍中植物留醇的工藝研究表明，無(wú)論在萃取率還是制劑精度上均優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑(正己烷)提取。國(guó)外研究者KanarAala Sarangthem等采用從發(fā)酵的竹筍汁中分離鑒定的B. subtilis菌種進(jìn)行發(fā)酵，最終留醇含量可達(dá)發(fā)酵前的2倍，但由于其發(fā)酵周期較長(zhǎng)，無(wú)法滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要，未得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明目的是提供一種發(fā)酵時(shí)間短、發(fā)酵制取植物留醇能力高的黑曲
毒ο本發(fā)明所述黑曲霉，是從腐爛的方竹筍殘?jiān)蟹蛛x篩選出發(fā)酵竹筍殘?jiān)笾参镧薮己扛叩暮谇?，然后通過(guò)對(duì)所得黑曲霉進(jìn)行馴化，獲得的一株新型的高產(chǎn)竹筍留醇的
漂曲毒。本發(fā)明所述經(jīng)馴化獲得的黑曲霉菌株已于2011年11月29日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行了保藏，保藏中心地址為武漢省武昌市珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號(hào)為 CCTCC No. M2011428。試驗(yàn)表明，未經(jīng)馴化的黑曲霉菌液的活菌數(shù)量為6. 2X IO3個(gè)/mL時(shí)，發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参镧薮己繛?16.6mg/100g.干重，發(fā)酵所需時(shí)間為8天。而經(jīng)馴化的保藏編號(hào)為CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌液的活菌數(shù)量為5. OX IO3個(gè)/mL時(shí)，發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参镧薮己繛?011.4mg/100g.干重，發(fā)酵所需時(shí)間為5天。經(jīng)馴化的保藏編號(hào)為CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌株與未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株在制取植物甾醇能力及所需發(fā)酵時(shí)間上均具有顯著差異(P < 0. 05)，表明經(jīng)馴化獲得的保藏編號(hào)為CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌株制取植物留醇能力顯著提高。同時(shí)，按照上述實(shí)驗(yàn)方法分別采用未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株的菌液和經(jīng)馴化的保藏編號(hào)為CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌株的菌液發(fā)酵竹筍制取植物留醇，結(jié)果顯示，經(jīng)馴化的保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉菌株發(fā)酵竹筍制取植物留醇的含量明顯高于未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株，并且發(fā)酵時(shí)間也較未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株短。因此，本發(fā)明提供了所述經(jīng)馴化的保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉在提高竹筍及竹筍殘?jiān)兄参锪舸己恐械膽?yīng)用。本發(fā)明還提供了一種提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，即取預(yù)處理的竹筍或竹筍殘?jiān)尤氡２鼐幪?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液發(fā)酵即得。本發(fā)明所述竹筍為可供食用的任一竹筍品種，包括毛竹筍、淡竹筍、麻竹筍、方竹筍、慈竹筍、綠竹筍、大頭典竹筍、幼葉甜竹筍等多個(gè)品種。本發(fā)明所述竹筍殘?jiān)鼮樯鲜隹晒┦秤玫娜我黄贩N竹筍加工過(guò)程產(chǎn)生的所有剩余物，包括筍頭和筍衣。作為優(yōu)選，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌數(shù)量為5. OX IO3 1.0 X IO4個(gè)/mL，更優(yōu)選的，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌數(shù)量為1. 0 X IO4個(gè)/mL。本發(fā)明所述提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，所述發(fā)酵可以為固態(tài)好氧、固態(tài)厭氧、液態(tài)好氧或液態(tài)厭氧，優(yōu)選的，所述發(fā)酵為固態(tài)好氧發(fā)酵。優(yōu)選的，本發(fā)明所述提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒ǎ龊谇咕杭尤肓繛槊縄OOg竹筍或竹筍殘?jiān)尤牒谇咕?. 0 5. OmL,更優(yōu)選的，所述黑曲霉菌液加入量為每IOOg竹筍或竹筍殘?jiān)尤牒谇咕?. OmL。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，所述發(fā)酵的溫度為30. O 36. 0°C，更優(yōu)選為33. 0°C。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，所述發(fā)酵的時(shí)間為4 6天，更優(yōu)選為5天。優(yōu)選的，本發(fā)明所述提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，在發(fā)酵前還添加了氮源，所述氮源為尿素。作為優(yōu)選，所述尿素的添加量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為3. 0 5. 0%，更優(yōu)選為4. 0%。本發(fā)明所述提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒ㄟ€包括干燥、封裝和滅菌的步驟。具體地，本發(fā)明提供一種提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒ǎ▽?duì)新鮮的竹筍或竹筍殘?jiān)M(jìn)行預(yù)處理，粉碎成竹筍顆?；蛑窆S殘?jiān)w粒；在竹筍顆?；蛑窆S殘?jiān)w粒中按每IOOg竹筍顆?；蛑窆S殘?jiān)w粒加入保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉菌液3.0 5. OmL，添加3.0 5. O %的尿素作為氮源，在30. O 36.0°C的發(fā)酵溫度下，進(jìn)行固態(tài)好氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為4 6天；其中，所述黑曲霉菌液的活菌數(shù)量為 5. O X IO3 1. OX IO4個(gè)/mL。發(fā)酵后，測(cè)得發(fā)酵樣品中植物甾醇含量由發(fā)酵前的412. 5 523. 4mg/100g.干重提高到 701. 2 1184. 5mg/100g.干重。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明從腐爛竹筍殘?jiān)蟹蛛x篩選出一種黑曲霉，通過(guò)馴化該黑曲霉，獲得保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428的一株高產(chǎn)植物留醇的新型黑曲霉菌株。本發(fā)明還提供了利用保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)岣咧窆S或竹筍殘?jiān)兄参锪舸嫉姆椒?，該方法能使植物留醇從發(fā)酵前的412. 5 523. 4mg/100g.干重，提高至701. 2 1184. 5mg/100g.干重，同時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間。既減少了竹筍殘?jiān)鼘?duì)環(huán)境的污染，又提高了竹筍經(jīng)濟(jì)效益，有效推進(jìn)竹筍及竹筍殘?jiān)疃乳_(kāi)發(fā)制取植物留醇的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。生物保藏說(shuō)明菌株黑曲霉分類命名為黑曲霉，Aspergillus niger于2011年11月四日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址為武漢省武昌市珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)， 保藏編號(hào)為 CCTCC NO.M2011428。


圖1示黑曲霉發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)墓に嚒?
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種黑曲霉及其發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)岣咧参锪舸己康姆椒?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。 本發(fā)明的產(chǎn)品和方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明利用方竹筍殘?jiān)O(shè)計(jì)幾組不同堆積方式進(jìn)行腐爛，對(duì)不同堆積方式產(chǎn)生的腐爛樣品進(jìn)行植物留醇含量測(cè)定，選擇植物留醇含量最高的那組作為菌種源；然后分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基進(jìn)行多次分類傳代培養(yǎng)，所得菌液分別采用上述特異性瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離、繼續(xù)培養(yǎng)、分離，直至分離到單菌落菌種；通過(guò)對(duì)分離得到的單菌落菌種進(jìn)行發(fā)酵竹筍殘?jiān)鼘?shí)驗(yàn)，比較發(fā)酵樣品中的植物留醇含量，從中篩選出植物留醇含量最高的那組作為最佳菌種；最后通過(guò)種屬鑒定，鑒定為黑曲
毒ο本發(fā)明將分離篩選所得黑曲霉接種于改良馬丁斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后制成菌液發(fā)酵竹筍殘?jiān)窆S殘?jiān)祥L(zhǎng)滿黑曲霉孢子后，挑取上述所得黑曲霉孢子，再次制備成菌液重復(fù)發(fā)酵竹筍殘?jiān)M(jìn)行多次馴化，結(jié)果表明，黑曲霉發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参锪舸紩r(shí)，隨馴化次數(shù)的增加，植物留醇含量也隨之增加，當(dāng)馴化次數(shù)超過(guò)3次后，隨馴化次數(shù)的增加， 植物留醇含量趨于平穩(wěn)，基本保持不變。因此，本發(fā)明從腐爛方竹筍殘?jiān)蟹蛛x篩選出一種發(fā)酵竹筍殘?jiān)笾参锪舸己扛叩暮谇?，通過(guò)馴化該黑曲霉，獲得了一株新型的高產(chǎn)竹筍植物留醇的黑曲霉，該黑曲霉菌株已于2011年11月四日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)保藏。試驗(yàn)表明，未經(jīng)馴化的黑曲霉菌液的活菌數(shù)量為6. 2X103f/mL時(shí)，發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参镧薮己繛?16. 6mg/100g.干重，發(fā)酵所需時(shí)間為8天；本發(fā)明提供的經(jīng)馴化、 保藏編號(hào)為CCTCC No. M2011428的黑曲霉菌液的活菌數(shù)量為5. OX IO3個(gè)/mL時(shí)，發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参镧薮己繛?011.%ig/100g.干重，發(fā)酵所需時(shí)間為5天。經(jīng)馴化、保藏編號(hào)為CCTCC No. 1120114 的黑曲霉菌株與未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株在制取植物留醇能力及所需發(fā)酵時(shí)間上均具有顯著差異(P < 0. 05)，表明本發(fā)明提供的經(jīng)馴化的黑曲霉菌株制取植物甾醇能力顯著提高。同時(shí)，經(jīng)馴化的保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉菌株發(fā)酵竹筍制取植物留醇的含量也明顯高于未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株，并且發(fā)酵時(shí)間也較未經(jīng)馴化的黑曲霉菌株短。因此，本發(fā)明提供了所述經(jīng)馴化的、保藏編號(hào)為CCTCC No. 1120114 的黑曲霉在提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己恐械膽?yīng)用。本發(fā)明同時(shí)還提供了一種提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，為取預(yù)處理的竹筍或竹筍殘?jiān)?，加入保藏編?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液發(fā)酵即得。作為優(yōu)選，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌數(shù)量為5. OX IO3 1.0 X IO4個(gè)/mL，更優(yōu)選的，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌數(shù)量為1. 0 X IO4個(gè)/mL。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明通過(guò)在IOOg經(jīng)預(yù)處理的竹筍殘?jiān)尤氩煌勘２鼐幪?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的條件下，33°C下固態(tài)好氧發(fā)酵5天，分析發(fā)酵后的竹筍殘?jiān)鼧悠分兄参锪舸己浚Y(jié)果表明隨接種量的增加，植物甾醇含量也隨之增加，當(dāng)接種量超過(guò)5mL后，隨接種量的增加，含量反而減少。因此，所述黑曲霉菌液加入量?jī)?yōu)選為每IOOg竹筍殘?jiān)尤牒谇咕?. 0 5. OmL,更優(yōu)選為每IOOg竹筍殘?jiān)尤牒谇咕?. OmL。發(fā)酵是指生物體對(duì)于有機(jī)物的某種分解過(guò)程，根據(jù)發(fā)酵的特點(diǎn)和微生物對(duì)氧的不同需要，可以將發(fā)酵分成若干類型，如按發(fā)酵形式來(lái)區(qū)分，則有固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵；按發(fā)酵過(guò)程中對(duì)氧的不同需求來(lái)分，一般可分為厭氧發(fā)酵和好氧發(fā)酵兩大類型。其中固態(tài)發(fā)酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固體支持物，其體系無(wú)水或接近于無(wú)水的任何發(fā)酵過(guò)程。液態(tài)發(fā)酵是指在生化反應(yīng)器中，模仿自然界將微生物在生育過(guò)程中所必需的糖類、有機(jī)和無(wú)機(jī)含有氮素的化合物、無(wú)機(jī)鹽等一些微量元素以及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中作為培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，通入無(wú)菌空氣并加以攪拌，提供微生物菌體呼吸代謝所需要的氧氣，并控制適宜的外界條件，進(jìn)行菌絲大量培養(yǎng)繁殖的過(guò)程。厭氧發(fā)酵是復(fù)雜有機(jī)物在無(wú)氧條件下利用厭氧微生物發(fā)酵性細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫耗乙酸菌、食氫產(chǎn)甲烷菌、食乙酸產(chǎn)甲烷菌等降解生成N、P等無(wú)機(jī)化合物和甲烷、二氧化碳等氣體的過(guò)程。而好氧發(fā)酵則是在有氧的條件下進(jìn)行有機(jī)物降解的過(guò)程。本發(fā)明通過(guò)在IOOg經(jīng)預(yù)處理的竹筍殘?jiān)尤胍欢勘２鼐幪?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的條件下，分別采用固態(tài)好氧、固態(tài)厭氧、液態(tài)好氧和液態(tài)厭氧的發(fā)酵方式，在33°C下發(fā)酵5天，分析發(fā)酵后的竹筍殘?jiān)鼧悠分兄参锪舸己?，結(jié)果表明無(wú)論采取哪種發(fā)酵方式均能有效提高植物留醇含量，由發(fā)酵前的 523. 4mg/100g.干重提高到876. 2 1184. 5mg/100g.干重，其中，采用固態(tài)好氧發(fā)酵方式后植物甾醇含量提高最多，為1184. 5mg/100g.干重。因此，本發(fā)明所述提高竹筍殘?jiān)兄参镧薮己康姆椒?，所述發(fā)酵可以為固態(tài)好氧、固態(tài)厭氧、液態(tài)好氧或液態(tài)厭氧，優(yōu)選為固態(tài)好氧發(fā)酵。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明通過(guò)在IOOg經(jīng)預(yù)處理的竹筍殘?jiān)尤胍欢勘２鼐幪?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的條件下，采用固態(tài)好氧的發(fā)酵方式，在不同的溫度下發(fā)酵5天，分析發(fā)酵后的竹筍殘?jiān)鼧悠分兄参锪舸己?，結(jié)果表明隨發(fā)酵溫度的增加，植物留醇含量也隨之增加，當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)33°C后，隨發(fā)酵溫度的增加，植物留醇含量反而減少。因此，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述提高竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒ǎ霭l(fā)酵的溫度為30. 0 36. 0°C，更優(yōu)選為33. 0°C。本發(fā)明通過(guò)在IOOg經(jīng)預(yù)處理的竹筍殘?jiān)尤胍欢勘２鼐幪?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液，在附加4%尿素氮源的條件下，采用固態(tài)好氧發(fā)酵方式，在 33°C下分別發(fā)酵不同時(shí)間，分析發(fā)酵后的竹筍殘?jiān)鼧悠分兄参锪舸己浚Y(jié)果表明隨發(fā)酵時(shí)間的增加，植物留醇含量也隨之增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)5天后，隨發(fā)酵溫度的增加植物甾醇含量趨于平穩(wěn)，變化不明顯。因此，本發(fā)明所述提高竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒ǎ霭l(fā)酵的時(shí)間優(yōu)選為4 6天，更優(yōu)選為5天。在一具體實(shí)施例中本發(fā)明通過(guò)在IOOg經(jīng)預(yù)處理的竹筍殘?jiān)尤胍欢勘２鼐幪?hào)為CCTCC No. M2011428的黑曲霉的菌液，然后分別在不含氮源和附加不同氮源的條件下，采用固態(tài)好氧發(fā)酵方式，在33°C下發(fā)酵5天，分析發(fā)酵后的竹筍殘?jiān)鼧悠分兄参锪舸己浚Y(jié)果表明以尿素或氯化銨作為氮源能提高植物留醇含量，其中以尿素作為氮源時(shí)，植物甾醇含量提高最大。而以硫酸銨或硝酸鉀作為氮源反而使植物留醇含量減少，植物留醇含量低于不含氮源的情況。因此，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述提高竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒?，在發(fā)酵前還添加氮源，所述氮源優(yōu)選為尿素。在另一具體實(shí)施例中本發(fā)明還通過(guò)按照上述方法采用不同尿素添加量分析發(fā)酵后的竹筍殘?jiān)鼧悠分兄参锪舸己?，結(jié)果表明隨尿素添加量的增加，植物留醇含量也隨之增加，當(dāng)尿素添加量超過(guò)4%后，隨尿素添加量的增加，植物留醇含量反而有所減少。因此， 所述尿素的添加量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)優(yōu)選為3. 0 5. 0%，更優(yōu)選為4. 0%。具體地，本發(fā)明提供的一種提高竹筍或竹筍殘?jiān)兄参锪舸己康姆椒ò▽?duì)新鮮的竹筍或竹筍殘?jiān)M(jìn)行預(yù)處理，粉碎成竹筍顆?；蛑窆S殘?jiān)w粒；在竹筍顆?；蛑窆S殘?jiān)w粒中按每IOOg加入菌液3. 0 5. OmL的接種量加入保藏編號(hào)為CCTCC No. M2011428 的黑曲霉菌液，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)添加3. 0 5. 0%的尿素作為氮源，在30. 0 36. 0°C的發(fā)酵溫度下，進(jìn)行固態(tài)好氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為4 6天；其中，所述黑曲霉菌液的活菌數(shù)量為 5. OX IO3 1. OX IO4個(gè)/mL。發(fā)酵后，測(cè)得發(fā)酵樣品中植物甾醇含量由發(fā)酵前的412. 5 523. 4mg/100g.干重提高到 701. 2 1184. 5mg/100g.干重。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 分離篩選發(fā)酵竹筍殘?jiān)笾参锪舸己扛叩暮谇?1)菌種源的選擇通過(guò)利用方竹筍殘?jiān)O(shè)計(jì)8組不同堆積方式進(jìn)行腐爛，待一段時(shí)間后，各取出部分腐爛樣品進(jìn)行植物留醇含量測(cè)定，選擇植物留醇含量最高的那組作為菌種源。(2)特異性培養(yǎng)基的配制①牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水 IOOOmL,調(diào)節(jié)PH至7. 3左右，在121°C滅菌30min，用于篩選細(xì)菌類微生物。②高氏一號(hào)培養(yǎng)基取可溶性淀粉20g、氯化鈉0. 5g、硝酸鉀lg、磷酸氫二鉀0. 5g、 硫酸亞鐵0. Olg、瓊脂20g、蒸餾水lOOOmL，121°C滅菌30min，用于篩選放線菌類微生物。③改良馬丁培養(yǎng)基取蛋白胨5g、酵母粉2g、葡萄糖20g、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂 0. 5g、瓊脂20g、蒸餾水lOOOmL，121°C高壓滅菌30min，用于篩選真菌類微生物。(3)菌種的分離將所得菌種源分別用上述3種特異性液體培養(yǎng)基進(jìn)行多次分類傳代培養(yǎng)，所得菌液分別采用特異性瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離、繼續(xù)培養(yǎng)、分離，直至分離到單菌落菌種。(4)最佳菌種的選擇通過(guò)對(duì)分離得到的單菌落菌種進(jìn)行發(fā)酵竹筍殘?jiān)鼘?shí)驗(yàn)，比較發(fā)酵樣品中得植物留醇含量，從中篩選出植物留醇含量最高的那組作為最佳菌種。(5)最佳菌種送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行種屬鑒定，鑒定結(jié)果為
漂曲毒。實(shí)施例2 本發(fā)明分離篩選所得黑曲霉的馴化次數(shù)對(duì)發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参镧薮寄芰Φ臋z測(cè)(1)活化菌種挑取上述分離篩選所得黑曲霉接種于改良馬丁斜面培養(yǎng)基中，于 33 °C培養(yǎng)箱下培養(yǎng)3 4d。(2)配制菌液用無(wú)菌水將斜面上的黑曲霉孢子洗下，震蕩制成黑曲霉菌液，活菌數(shù)量為 5. 0 X IO3 1. 0 X IO4 個(gè) /mL。(3)發(fā)酵竹筍殘?jiān)OOg竹筍殘?jiān)?，加入上述菌?mL，混勻后，于33°C恒溫箱中培養(yǎng)，待竹筍殘?jiān)祥L(zhǎng)滿黑曲霉孢子后，停止培養(yǎng)。(4)黑曲霉馴化挑取上述所得黑曲霉孢子，用無(wú)菌水配制成約活菌數(shù)量為 5. OX IO3 1.0 X IO4個(gè)/mL的菌液，按照上述( 發(fā)酵竹筍殘?jiān)痉椒?，直接將菌液與竹筍殘?jiān)靹?，進(jìn)行發(fā)酵，待竹筍殘?jiān)祥L(zhǎng)滿黑曲霉孢子后，停止培養(yǎng)；重復(fù)操作進(jìn)行多次馴化，將每次馴化的黑曲霉進(jìn)行發(fā)酵竹筍殘?jiān)?，測(cè)定發(fā)酵后的樣品中植物留醇含量，結(jié)果見(jiàn)表1。表1不同馴化次數(shù)的黑曲霉發(fā)酵竹筍殘?jiān)迫≈参锪舸记闆r
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉，其保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2011428。
2.權(quán)利要求1所述黑曲霉在提高竹筍中植物留醇含量中的應(yīng)用。
3.一種提高竹筍中植物留醇含量的方法，其特征在于，取預(yù)處理的竹筍或竹筍殘?jiān)?，加入保藏編?hào)為CCTCC NO.M2011428的黑曲霉的菌液發(fā)酵即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述黑曲霉菌液中黑曲霉活菌數(shù)量為 5. OXlO3 ~ LOX IO4 個(gè)/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述發(fā)酵為固態(tài)好氧發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述黑曲霉菌液加入量為每IOOg竹筍殘?jiān)尤牒谇咕?. 0 5. OmL。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述發(fā)酵的溫度為30.0 36. 0°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述發(fā)酵的時(shí)間為4 6天。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述發(fā)酵前還添加了氮源，所述氮源為尿ο
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述尿素添加量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為3.0 5. 0%。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種黑曲霉及其發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)岣咧参镧薮己康姆椒?。本發(fā)明從腐爛竹筍殘?jiān)蟹蛛x篩選出一種黑曲霉，通過(guò)馴化該黑曲霉，獲得保藏編號(hào)為CCTCC No.M2011428的一株高產(chǎn)植物甾醇的新型黑曲霉菌株。本發(fā)明還提供了利用保藏編號(hào)為CCTCC No.M2011428的黑曲霉發(fā)酵竹筍或竹筍殘?jiān)岣咧参镧薮己康姆椒ǎ摲椒苁怪参镧薮紡陌l(fā)酵前的412.5～523.4mg/100g.干重，提高至701.2～1184.5mg/100g.干重，同時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間。既減少了竹筍殘?jiān)鼘?duì)環(huán)境的污染，又提高了竹筍經(jīng)濟(jì)效益，有效的推進(jìn)竹筍殘?jiān)疃乳_(kāi)發(fā)制取植物甾醇的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12P33/00GK102492632SQ201110444909
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者殷鐘意, 申渝, 鄭旭煦, 陳如壽 申請(qǐng)人:重慶工商大學(xué)