專利名稱：一種檢測禽流感病毒通用亞型的液相芯片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用液相芯片的方法檢測禽流感病毒通用亞型的方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza, Al)是由流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類感染疾病的總稱。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染。候鳥、觀賞鳥、 散禽攜帶病毒迂徙可能是禽流感世界性流行的主要原因。禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)亞型眾多、變異性強(qiáng)，存在抗原飄移和抗原轉(zhuǎn)變，不同亞型、不同分離株病毒的差異很大。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將高致病性禽流感(HPAI)規(guī)定為法定上報的動物疫病之一。禽流感的爆發(fā)一直是困擾全球養(yǎng)禽業(yè)的一個難題，尤其是HPAI可導(dǎo)致高達(dá)100% 的發(fā)病率和死亡率，并可感染人并致人死亡。禽流感檢測方法包括傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法，前者如病毒分離和血清學(xué)診斷等方法，其缺點是操作繁瑣、診斷時間長等，而分子生物學(xué)方法如RT-PCR等具有特異、敏感、簡便快捷等特點，克服了傳統(tǒng)方法的局限性，但不能進(jìn)行高通量檢測，不能滿足高通量檢疫的要求，更不利于大量通關(guān)樣品的檢疫和疫情暴發(fā)時大批量樣品的緊急篩查，因而需要建立一套簡便、快速、準(zhǔn)確的禽流感病毒篩查和檢驗技術(shù)，以滿足日常檢測的要求。液相芯片稱為微球體懸浮芯片(suspension array, liquid chip)，是基于 xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺，它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原抗體、酶、底物、配體、受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、 綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺。液相芯片技術(shù)平臺是既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺，這個技術(shù)平臺整合了生物檢測，乳膠微球熒光編碼，微液體傳送系統(tǒng)，激光實時記錄，先進(jìn)電腦軟件和數(shù)據(jù)處理模式等多種先進(jìn)技術(shù)。液相芯片的核心技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色(固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼)。應(yīng)用時，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入微量待檢測或分析標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合。結(jié)合的結(jié)果可以在瞬間經(jīng)激光判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來。因為分子雜交是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。液相芯片技術(shù)平臺具有高效性因為上百種顏色的乳膠微球可以在同一個反應(yīng)體系內(nèi)，所以一小份標(biāo)本(血，或其它體液，組織)可以被用來同時檢測上百個生理或病理指標(biāo)。液相芯片技術(shù)平臺具有高敏感性每個乳膠微球上都可以滿滿地(以共價鍵牢固結(jié)合的方式)包被上抗原、抗體、或核酸。因為探針密度高，產(chǎn)生的信號強(qiáng)，加上使用熒光檢測， 所以敏感性大大高于任何現(xiàn)有分析、診斷方法，也高于其它芯片法。液相芯片技術(shù)平臺是一種快速檢測方法因為雜交在懸浮的液相中進(jìn)行，所以反應(yīng)需要時間短雜交后常不用清洗就可以直接讀數(shù)，且檢測效率大大高于固相雜交，所用時間從幾小時縮短到十幾分鐘。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測禽流感病毒通用亞型的液相芯片方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測禽流感病毒通用亞型的液相芯片試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，通過從GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中收集禽流感病毒M基因序列，利用Bioedit分子生物學(xué)分析軟件對大量收集的序列進(jìn)行分析比較，篩選禽流感病毒M基因特異性保守序列。在對序列分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)篩選的保守序列，參照GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中發(fā)表的禽流感病毒M基因組序列(登錄號 FJ966954)，應(yīng)用DNAMar、Bioedit、Primer5. O和OMIGA軟件分別對其進(jìn)行初步分析篩選， 設(shè)計了禽流感病毒通用亞型的特異性引物和探針，分別對引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，對探針進(jìn)行氨基修飾。本發(fā)明提供的用液相芯片檢測禽流感病毒通用亞型的引物，其核苷酸序列為M-FP 5 ’ -CAAGACCAATCCTGTCACCT-3’，M-RP 5，-GGGTCTCCATTCCCATTTAG-3，，在 M-RP 引物的 5，端用生物素標(biāo)記。本發(fā)明提供了一種用液相芯片檢測禽流感病毒通用亞型的探針，其核苷酸序列為5，-GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3，，在其 5，端用氨基修飾。本發(fā)明提供了一種液相芯片，是特異性檢測探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)制成的特異性檢測微球，該特異性檢測探針為5’ -GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3’，在其5’端用氨基修飾。本發(fā)明提供了一種用液相芯片檢測禽流感病毒通用亞型的方法，用上述引物 (M-FP和M-RP)，對樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將帶生物素標(biāo)記的RT-PCR產(chǎn)物與本發(fā)明提供的偶聯(lián)在熒光微球上的探針進(jìn)行分子雜交后，檢測微球的熒光值，確定樣品中是否含有禽流感病毒。本發(fā)明提供一種用液相芯片檢測禽流感病毒通用亞型的方法，包括下列步驟1)提取樣本中禽流感病毒RNA ；2)以步驟1)提取的樣本RNA為模板，以本發(fā)明提供的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；3)將本發(fā)明提供的探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)；4)雜交將帶有生物素標(biāo)記的步驟2)中的RT-PCR產(chǎn)物與步驟3)中的偶聯(lián)到熒光微球上的探針在PCR儀上雜交；5)檢測熒光值，以平均熒光值大于100且為陰性對照3倍以上熒光值所對應(yīng)的檢測標(biāo)本為陽性。其中步驟2)的RT-PCR反應(yīng)50 μ L反應(yīng)體系為一步法 RT-PCR buffer(5 χ) dNTP ( 10mmol/L) 酶混合物 RNA酶抑制劑 RNA模板 M-FP (ΙΟμιηοΙ/L) M-RP (ΙΟμιηοΙ/L)
ddH20(不含 RNA 酶)RT-PCR反應(yīng)條件為
權(quán)利要求
1.一種用液相芯片方法檢測禽流感病毒通用亞型的引物，其核苷酸序列為M-FP :5’ -CAAGACCAATCCTGTCACCT-3’，M-RP :5，-GGGTCTCCATTCCCATTTAG-3，，在 M-RP 引物的 5，端用生物素標(biāo)記。
2.一種用液相芯片方法檢測禽流感病毒通用亞型的探針，其核苷酸序列為 5，-GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3，，在其 5，端用氨基修飾。
3.一種液相芯片，其特征在于，是權(quán)利要求2所述的特異性檢測探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)制成的特異性檢測微球。
4.一種用液相芯片檢測禽流感病毒通用亞型的方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的引物，對樣品RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將帶生物素標(biāo)記的RT-PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求3所述的液相芯片進(jìn)行分子雜交后，檢測熒光值，確定樣品中是否含有禽流感病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括下列步驟1)提取樣本中禽流感病毒RNA；2)以步驟1)提取的樣本RNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；3)將權(quán)利要求2所述的探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)；4)雜交將帶有生物素標(biāo)記的步驟2)中的RT-PCR產(chǎn)物與步驟3)中的偶聯(lián)到熒光微球上的探針在PCR儀上雜交；5)檢測熒光值，以平均熒光值大于100且為空白對照3倍以上熒光值所對應(yīng)的檢測標(biāo)本為陽性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)的RT-PCR反應(yīng)50μ L反應(yīng)體系為 一步法 RT-PCR 5 X buffer 10. 0 μ L, lOmmol/LdNTP 2. 0 μ L，酶混合物 2. 0 μ L，RNA 酶抑制劑 0. 5μ L，RNA模板 5. 0μ L，10ymol/L 上游引物 0. 5μ L，10ymol/L 下游引物 1. 0μ L，不含 RNA 酶的 ddH20 29. 0 μ L ；RT-PCR 反應(yīng)條件為50°C 30min ；95°C 15min, 94°C 30s, 52°C 40s, 72°C lmin，共；35 個循環(huán)；72°C IOmin0
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中步驟3)中每1.25X106個熒光微球加入濃度為0. Inmol/μ L的特異性探針4 μ L。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中步驟4)采用以下方法進(jìn)行雜交雜交體系為50 μ L，其中微球33 μ L，步驟2)中的PCR產(chǎn)物為5 μ L，加入TE補(bǔ)充體積至50 μ L ； 雜交條件為95°C變性5min后，50°C雜交30min。
9.一種試劑盒，其特征在于，含有特異性檢測探針，其序列為 5，-GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3，，在其 5，端用氨基修飾。
10.權(quán)利要求3所述的液相芯片和權(quán)利要求9所述的試劑盒在檢測禽流感病毒通用亞型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測禽流感病毒通用亞型的液相芯片方法，通過對禽流感病毒M基因組序列的比對和分析，找出保守區(qū)域，設(shè)計了禽流感病毒通用亞型的特異性引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物對禽流感病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時將探針與微球偶聯(lián)；RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和偶聯(lián)到微球上的探針進(jìn)行雜交，通過檢測熒光值，建立了檢測禽流感病毒通用亞型的液相芯片方法。本發(fā)明的檢測方法具有檢測準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡便快速的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/93GK102433395SQ201110445020
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者林祥梅, 梅琳, 王慧煜, 韓雪清 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院