專利名稱：一種檢測禽流感病毒h7亞型的液相芯片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用液相芯片的方法檢測禽流感病毒H7 亞型的方法。
背景技術(shù)：
高致病性禽流感(HPAI)是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列出的必報(bào)疾病，也是《中國進(jìn)出境動(dòng)物檢疫規(guī)范》中規(guī)定的必檢疾病。在英國、德國、澳大利亞、維多利亞、巴基斯坦、意大利、荷蘭、比利時(shí)和美國等許多國家都有H7亞型禽流感暴發(fā)的報(bào)道。20世紀(jì)確定的高致病性禽流感的大暴發(fā)主要有12次，其中由H7亞型AIV引起的就有5次，H7亞型AIV不僅能侵襲雞、鴨等家禽，還能使籠養(yǎng)寵物鳥致病(如H7W型)，甚至能感染人類。2003年荷蘭暴發(fā)H7N7禽流感病毒感染人事件，波及比利時(shí)和德國，約1000多人的H7抗體出現(xiàn)陽性，89 人確診感染了 H7N7病毒，并且首次出現(xiàn)H7N7禽流感病毒致人死亡事件。禽流感H7亞型檢測方法包括傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法，前者如病毒分離和血清學(xué)診斷等方法，其缺點(diǎn)是操作繁瑣、診斷時(shí)間長等，而分子生物學(xué)方法如RT-PCR等具有特異、敏感、簡便快捷等特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)方法的局限性，但不能進(jìn)行高通量檢測，不能滿足高通量檢疫的要求，更不利于大量通關(guān)樣品的檢疫和疫情暴發(fā)時(shí)大批量樣品的緊急篩查， 因而需要建立一套簡便、快速、準(zhǔn)確的禽流感病毒篩查和檢驗(yàn)技術(shù)，以滿足日常檢測的要求。液相芯片稱為微球體懸浮芯片(suspension array, liquid chip)，是基于 xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái)，它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原抗體、酶、底物、配體、受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、 綠兩束激光分別檢測微球編碼和報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺(tái)。液相芯片技術(shù)平臺(tái)是既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對(duì)高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺(tái)，這個(gè)技術(shù)平臺(tái)整合了生物檢測，乳膠微球熒光編碼，微液體傳送系統(tǒng)，激光實(shí)時(shí)記錄，先進(jìn)電腦軟件和數(shù)據(jù)處理模式等多種先進(jìn)技術(shù)。液相芯片的核心技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色(固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼)。應(yīng)用時(shí)，把針對(duì)不同檢測物的乳膠微球混合后再加入微量待檢測標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合。結(jié)合的結(jié)果可以在瞬間經(jīng)激光判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來。因?yàn)榉肿与s交是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。液相芯片技術(shù)平臺(tái)具有高效性因?yàn)樯习俜N顏色的乳膠微球可以在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)，所以一小份標(biāo)本(血，或其它體液，組織)可以被用來同時(shí)檢測上百個(gè)生理或病理指標(biāo)。液相芯片技術(shù)平臺(tái)具有高敏感性每個(gè)乳膠微球上都可以滿滿地(以共價(jià)鍵牢固結(jié)合的方式)包被上抗原、抗體、或核酸。因?yàn)樘结樏芏雀?，產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)，加上使用熒光檢測，所以敏感性大大高于任何現(xiàn)有分析、診斷方法，也高于其它芯片法。液相芯片技術(shù)平臺(tái)是一種快速檢測方法因?yàn)殡s交在懸浮的液相中進(jìn)行，所以反應(yīng)需要時(shí)間短雜交后常不用清洗就可以直接讀數(shù)，且檢測效率大大高于固相雜交，所用時(shí)間從幾小時(shí)縮短到十幾分鐘。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測禽流感病毒H7亞型的液相芯片方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測禽流感病毒H7亞型的液相芯片試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過從GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中收集禽流感病毒H7亞型的HA基因序列，利用Bioedit分子生物學(xué)分析軟件對(duì)大量收集的序列進(jìn)行分析比較，篩選禽流感病毒H7亞型特異性保守序列。在對(duì)序列分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)篩選的 H7亞型的保守序列，參照GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中發(fā)表的禽流感病毒 H7 亞型 HA 基因組序列(登錄號(hào)AY831668)，應(yīng)用 DNAStar、Bioedit、Primer5. O 和 OMIGA 軟件分別對(duì)其進(jìn)行初步分析篩選，設(shè)計(jì)了禽流感病毒H7亞型的特異性引物和探針，分別對(duì)弓I物進(jìn)行生物素標(biāo)記，對(duì)探針進(jìn)行氨基修飾。本發(fā)明提供的用液相芯片檢測禽流感病毒H7亞型的引物，其核苷酸序列為H7-FP 5’ -ATCAACAGTCCTTTGTACCGAGTC-3’，H7-RP 5，-CTTGCACGGTCTGGAGCT-3，，在 H7-RP 引物的 5，端用生物素標(biāo)記。本發(fā)明提供了一種用液相芯片檢測禽流感病毒H7亞型的探針，其核苷酸序列為 5’ -CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其 5’ 端用氨基修飾。本發(fā)明提供了一種液相芯片，是特異性檢測探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)制成的特異性檢測微球，該特異性檢測探針為5，-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3，，在其 5，端用氨基修飾。本發(fā)明提供了一種用液相芯片檢測禽流感病毒H7亞型的方法，其特征在于，用上述引物，對(duì)樣品RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，RT-PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)在熒光微球上的探針分子雜交后， 檢測熒光值，確定樣品中是否含有禽流感病毒H7亞型。具體地，包括下列步驟1)提取樣本中禽流感病毒RNA ；2)以步驟1)提取的樣本RNA為模板，以上述引物(H7-FP和H7-RP)進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)；3)將上述氨基修飾的探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)；4)雜交將帶有生物素標(biāo)記的步驟2)中的RT-PCR產(chǎn)物與步驟3)中偶聯(lián)到熒光微球上的探針在PCR儀上雜交；5)檢測熒光值，以平均熒光值大于100且為陰性對(duì)照3倍以上熒光值所對(duì)應(yīng)的檢測標(biāo)本為陽性。其中，步驟2)的RT-PCR反應(yīng)50yL反應(yīng)體系為一步法 RT-PCR buffer(5 χ) dNTP ( 10mmol/L) 酶混合物 RNA酶抑制劑 RNA模板 Pl(10pmol/L) P2(10pmol/L)
ddH20(不含 RNA 酶)RT-PCR反應(yīng)條件為
50"C30 min
95 "C15 min
940C30 s
52 0C40 s
72 "C1 min
72 "C10 min其中步驟3)中每1. 25 X IO6個(gè)熒光微球加入濃度為0. Inmol/μ L的特異性探針 4μ L0其中步驟4)采用以下方法進(jìn)行雜交雜交體系為50 μ L，其中微球33 μ L，步驟2) 中的RT-PCR產(chǎn)物為5 μ L，加入TE補(bǔ)充體積至50 μ L ；雜交條件為95°C變性5min后，50°C 雜交30min。本發(fā)明提供了一種試劑盒，含有特異性檢測探針，其為5，-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3，，在其 5，端用氨基修飾。本發(fā)明提供了一種試劑盒，含有生物素修飾的特異性引物、偶聯(lián)到熒光微球上的特異性檢測探針，該特異性檢測探針為 nh2-caatagcagagcagtaggaaaatgt。本發(fā)明提供了上述液相芯片及試劑盒在檢測禽流感病毒H7亞型上的應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于檢測禽流感病毒H7亞型的生物素標(biāo)記引物和特異性探針，利用該引物和探針建立一種檢測禽流感病毒H7亞型的液相芯片方法，該方法具有速度快，操作簡單、敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床標(biāo)本中禽流感病毒H7亞型的檢測。


圖1為H7亞型HA基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，其中泳道1_3分別為禽流感病毒H7亞型陽性對(duì)照，陽性樣品和陰性對(duì)照，M為DL2000DNA Marker ；圖2為樣品檢測柱狀圖，其中X1-5分別代表感染H7亞型禽流感病毒樣品RNA ；圖3為普通RT-PCR方法對(duì)禽流感病毒H7亞型不同濃度模板的HA基因敏感性電泳圖，其中M為DL2000 DNA Marker,泳道1_9分別為禽流感病毒H7亞型模板濃度Ing/ μ L， 10_1ng/ μ L, 10_1ng/ μ L, l(T2ng/ μ L, l(T2ng/ μ L, l(T3ng/ μ L, l(T3ng/ μ L, l(T4ng/ μ L, l(T4ng/
10.0 μL 2.0 μ 2.0 μL 0.5 μL 5.0 μL 0.5 μL 1.0 μ 29.0μ
35個(gè)循環(huán)μ L，10為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段； 若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。實(shí)施例1探針和引物的設(shè)計(jì)與修飾從 GenBank (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)中收集禽流感病毒 H7 亞型 HA 基因序列，利用Bioedit分子生物學(xué)分析軟件對(duì)大量收集的序列進(jìn)行分析比較，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮Y選禽流感病毒H7亞型特異性保守序列。在對(duì)序列分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)篩選的每個(gè)亞型的保守序列，參照GenBank中發(fā)表的禽流感病毒H7亞型的HA基因組序列(登錄號(hào)AY831668)，應(yīng)用DNAMar、Bioedit、 ft~imer5. 0和OMIGA軟件分別對(duì)其進(jìn)行初步分析篩選，寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則是(1)探針序列應(yīng)為特異性強(qiáng)和靈敏度高的寡核苷酸，一般25bp左右。( 探針堿基組成中G+C含量應(yīng)在40% 60%，超過此范圍，非特異性雜交將增加。( 探針內(nèi)部應(yīng)無互補(bǔ)序列區(qū)域存在， 即不應(yīng)有遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4的堿基反向互補(bǔ)配對(duì)序列，否則會(huì)形成探針內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)。(4)探針最好應(yīng)避免同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)，大于4bp，如-GGGGG-。(5)探針與其它已知的各種基因序列進(jìn)行同源性的比較，若與非靶基因序列有70%以上的同源性或連續(xù)8個(gè)以上的堿基序列相同，則最好不用。(6)各探針的Tm值最好保持一致，Tm值相差越小越好，最好是最小Tm 值與最大Tm值的差值不要超過5°C。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)研究，多次試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)禽流感病毒H7亞型的特異性引物以及特異性探針，分別對(duì)引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，對(duì)探針進(jìn)行氨基(NH2)修飾。引物和探針的序列如下表所示表1禽流感病毒H7亞型液相芯片引物和探針
權(quán)利要求
1.一種用液相芯片檢測禽流感病毒H7亞型的引物，其核苷酸序列為H7-FP :5’ -ATCAACAGTCCTTTGTACCGAGTC-3’，H7-RP :5，-CTTGCA CGGTCTGGAGCT-3，，在 H7-RP 引物的 5，端用生物素標(biāo)記。
2.一種用液相芯片檢測禽流感病毒H7亞型的探針，其核苷酸序列為 5’ -CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其 5’ 端用氨基修飾。
3.一種液相芯片，其特征在于，是權(quán)利要求2所述的特異性檢測探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)制成的特異性檢測微球。
4.一種用液相芯片檢測禽流感病毒H7亞型的方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的引物，對(duì)樣品RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將帶生物素標(biāo)記的RT-PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求3所述的液相芯片進(jìn)行分子雜交后，檢測熒光值，確定樣品中是否含有禽流感病毒H7亞型。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括下列步驟1)提取樣本中禽流感病毒RNA；2)以步驟1)提取的樣本RNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；3)將權(quán)利要求2所述的探針與熒光標(biāo)記微球偶聯(lián)；4)雜交將帶有生物素標(biāo)記的步驟2)中的RT-PCR產(chǎn)物與步驟3)中的偶聯(lián)到熒光微球上的探針在PCR儀上雜交；5)檢測熒光值，以平均熒光值大于100且為陰性對(duì)照3倍以上熒光值所對(duì)應(yīng)的檢測標(biāo)本為陽性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)的RT-PCR反應(yīng)50μ L反應(yīng)體系為 一步法 RT-PCR 5 X buffer 10. 0 μ L, lOmmol/LdNTP 2. 0 μ L，酶混合物 2. 0 μ L，RNA 酶抑制劑 0. 5μ L，RNA模板 5. 0μ L，10ymol/L 上游引物 0. 5μ L，10ymol/L 下游引物 1. 0μ L，不含 RNA酶的 d dH20 29. 0 μ L ;RT_PCR 反應(yīng)條件為50°C 30min ;95°C 15min，94°C 30s，52°C 40s， 72°C lmin，共；35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中步驟3)中每1.25X106個(gè)熒光微球加入濃度為0. Inmol/μ L的特異性探針4 μ L。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中步驟4)采用以下方法進(jìn)行雜交雜交體系為50 μ L，其中微球33 μ L，步驟2)中的RT-PCR產(chǎn)物為5 μ L，加入TE補(bǔ)充體積至 50 μ L ；雜交條件為95°C變性5min后，50°C雜交30min。
9.一種試劑盒，其特征在于，含有特異性檢測探針，其為5' -CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其 5’ 端用氨基修飾。
10.權(quán)利要求3所述的液相芯片和權(quán)利要求9所述的試劑盒在檢測禽流感病毒H7亞型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測禽流感病毒H7亞型的液相芯片方法，通過對(duì)禽流感病毒H7亞型的HA基因組序列的比對(duì)和分析，找出保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了禽流感病毒H7亞型的特異性引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物對(duì)禽流感病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)將探針與微球偶聯(lián)；RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和偶聯(lián)到熒光微球上的探針進(jìn)行分子雜交，通過檢測熒光值，建立了檢測禽流感病毒H7亞型的液相芯片方法。本發(fā)明的檢測方法具有檢測準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡便快速的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102433396SQ20111044516
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者張曉娜, 林祥梅, 梅琳, 王慧煜, 韓雪清 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院