專利名稱：一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
自從人類基因組核苷酸序列草圖和許多其他基因組草圖問世，以及人類和許多其他生物體基因組草圖中大量單核苷酸多態(tài)性(SNP)和小的插入/缺失多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)，人們開始對(duì)核酸測(cè)定產(chǎn)生興趣。研究表明，某些特定位置的核酸序列變異包含了大量的生物學(xué)信息，可能與人類或動(dòng)植物的某些性狀相關(guān)，這些信息將對(duì)醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等的方方面面產(chǎn)生廣泛的影響。舉例來說，可以預(yù)期的是，這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展有可能實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。易瑞沙適用性基因是指和易瑞沙的適用性具有一定關(guān)聯(lián)的基因或等位基因。對(duì)易瑞沙適用性基因進(jìn)行檢測(cè)，得到其具體的序列信息，然后結(jié)合后續(xù)進(jìn)一步的研究，包括分子生物學(xué)試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)、臨床觀察以及綜合數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析等，從而建立一定的模型，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定個(gè)體的易瑞沙適用性評(píng)估，從而提高易瑞沙的療效，減少毒副作用，減輕病人的痛苦；也能用于易瑞沙適用性基因的大規(guī)模人群篩查，確定易瑞沙適用性基因的各種基因型的比例。目前，檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法中，最常見的是Sanger測(cè)序法，該方法能夠?qū)σ兹鹕尺m用性基因進(jìn)行區(qū)域檢測(cè)，但是Sanger測(cè)序法每次只能對(duì)一個(gè)樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)效率低，測(cè)序成本高，且由于sanger測(cè)序原理的限制，在檢測(cè)帶有雜合子的樣品的信號(hào)時(shí)會(huì)出現(xiàn)雙峰乃至多峰，導(dǎo)致測(cè)序所得的測(cè)序峰圖紊亂，甚至無(wú)法分析得到的序列信息，測(cè)序失敗。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法僅能于混合模板中檢測(cè)出比例> 20%的模板，且無(wú)法得出發(fā)生突變位點(diǎn)的精確變異比例。而現(xiàn)有技術(shù)中基于 Sanger測(cè)序法的試劑盒存在同樣的缺陷。因此，需要一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的新方法和新試劑盒，能同時(shí)對(duì)易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行區(qū)域檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，并能進(jìn)一步同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法及試劑盒，能同時(shí)對(duì)易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行區(qū)域檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，并能進(jìn)一步同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，包括以下步驟A.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增， 并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；B.對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；
C.同時(shí)對(duì)所述多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測(cè)序，得到所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的序列信息。其中，所述步驟A包括以下步驟Al.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增， 得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；A2.利用接頭元件，與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到測(cè)序文庫(kù)；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。其中，所述步驟A2包括以下步驟A21.對(duì)與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化，得片段化產(chǎn)物；A22.利用接頭元件，與所述片段化產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。進(jìn)一步的，步驟A所述的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序文庫(kù)的長(zhǎng)度無(wú)特殊限制，優(yōu)選為25bp 500bp。更優(yōu)選為50bp 200bp，更優(yōu)選為70bp 130bp。其中，所述步驟A22包括以下步驟A221.利用第一接頭與片段化產(chǎn)物的兩端連接，得第一連接產(chǎn)物；A222.環(huán)化第一連接產(chǎn)物，得環(huán)化產(chǎn)物；A223. II s型限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)化產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物；A224.在酶切產(chǎn)物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測(cè)序文庫(kù)。其中，所述步驟A22包括以下步驟Α22Γ .利用第四接頭與片段化產(chǎn)物連接，得第二連接產(chǎn)物；A222’ . II s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得帶有第四接頭的酶切片段；A223’ .帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測(cè)序文庫(kù)。其中，步驟A2所述接頭元件中的至少一個(gè)接頭含有第一標(biāo)簽序列，該第一標(biāo)簽序列，用于在文庫(kù)構(gòu)建過程中對(duì)不同待測(cè)樣品的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記。該第一標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。進(jìn)一步的，該第一標(biāo)簽序列堿基數(shù)優(yōu)選為3 20，更優(yōu)選為4 10。其中，步驟A中，所述易瑞沙適用性基因特異性引物與易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。進(jìn)一步的，與每個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的易瑞沙適用性基因特異性引物中，至少有一條引物與該目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端含有第二標(biāo)簽序列，該第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中對(duì)不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。該第二標(biāo)簽序列優(yōu)選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限，該第二標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為3 20，更優(yōu)選為4 10。其中，所述易瑞沙適用性基因包括EGFR、KRAS、BRAF中的至少一個(gè)。進(jìn)一步的，所述EFGR特異性引物包括 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中的至少一對(duì)；所述KRAS特異性引物包括 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、SEQ IDN0:23 和 SEQ ID NO :24、SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO :26 中的至少一對(duì)；所述 BRAF 特異性引物包括 SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33 和 SEQ ID NO 34 中的至少一對(duì)。其中，所述步驟A中同一樣品的各目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行或部分同時(shí)進(jìn)行或分別獨(dú)立進(jìn)行。其中，步驟B所述的單分子擴(kuò)增的方法為乳液PCR、橋式PCR中的至少一種。其中，步驟C所述的高通量測(cè)序技術(shù)為基于聚合酶的合成測(cè)序法或基于連接酶的連接測(cè)序法。本發(fā)明的還提供了一種能夠用于本發(fā)明的任一種測(cè)序方法的試劑盒，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種易瑞沙適用性基因檢測(cè)試劑盒，包括易瑞沙適用性基因特異性引物，用于對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；接頭元件，用于與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。其中，所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。 其中，所述接頭元件中的至少一個(gè)接頭包含有第一標(biāo)簽序列，該第一標(biāo)簽序列，用于在文庫(kù)構(gòu)建過程中，對(duì)不同待測(cè)樣品的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記。該第一標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限，該第一標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為3 20。其中，所述易瑞沙適用性基因特異性引物與目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。進(jìn)一步的，與每個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的易瑞沙適用性基因特異性引物中，至少有一條引物與該目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端含有第二標(biāo)簽序列，該第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中對(duì)不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。該第二標(biāo)簽序列優(yōu)選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限，該第二標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為3 20。其中，所述易瑞沙適用性基因包括EGFR、KRAS、BRAF中的至少一個(gè)。其中，每個(gè)易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域有多個(gè)。進(jìn)一步的，所述EFGR特異性引物包括 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中的至少一對(duì)；所述KRAS特異性引物包括 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、SEQ ID N0:23 和 SEQ ID NO :24、SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO :26 中的至少一對(duì)；所述 BRAF 特異性引物包括 SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33 和 SEQ ID NO 34 中的至少一對(duì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法和試劑盒通過高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)待測(cè)樣品的易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域同時(shí)進(jìn)行深度測(cè)序，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，并能進(jìn)一步對(duì)大量樣品同時(shí)進(jìn)行多區(qū)域測(cè)序。


圖I是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法流程圖；圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的單突出末端接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的雙突出末端接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的T末端分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖7是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中的分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖8是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的雙脫氧分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖9是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法流程圖；圖10是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用片段化產(chǎn)物和接頭元件連接，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法流程圖；圖11是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中利用片段化產(chǎn)物和接頭元件連接，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明所述的易瑞沙適用性基因是指與易瑞沙的適用性具有一定關(guān)聯(lián)的基因或等位基因。本發(fā)明所述的目標(biāo)區(qū)域，為易瑞沙適用性基因上的任意序列，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，包括但不限于基因的內(nèi)部序列、基因的外部調(diào)控區(qū)域，所述基因的內(nèi)部序列，包括但不限于基因的內(nèi)含子區(qū)域、外顯子區(qū)域、同時(shí)含有內(nèi)含子與外顯子的區(qū)域。圖I示出了本發(fā)明的一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法流程，該方法包括以下步驟SI.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增， 并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；S2.對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；S3.同時(shí)對(duì)所述多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測(cè)序，得到所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的序列信息。本方法利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)待測(cè)樣品的易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域同時(shí)進(jìn)行深度測(cè)序，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息，包括已知突變和未知突變的各突變位點(diǎn)的變異情況，以及各突變位點(diǎn)發(fā)生變異的頻率。此外，通過控制各目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，可免去了片段化步驟，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了實(shí)驗(yàn)效率，降低了成本。通過本方法所得的序列信息，然后結(jié)合后續(xù)進(jìn)一步的研究，包括分子生物學(xué)試驗(yàn)、 臨床試驗(yàn)、臨床觀察以及綜合數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析等，從而建立一定的模型，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定個(gè)體的易瑞沙適用性評(píng)估，從而提高易瑞沙的療效，減少毒副作用，減輕病人的痛苦；也能用于易瑞沙適用性基因的大規(guī)模人群篩查，確定易瑞沙適用性基因的各種基因型的比例。
需要說明的是步驟SI所述的待測(cè)樣品為能提取核酸的任意形式的樣品，包括但不限于全血、 血清、血漿、組織樣品。該組織樣品包括但不限于石蠟包埋組織、新鮮組織。步驟SI所述的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域，它們可來源與同一個(gè)易瑞沙適用性基因，也可來源于不同的易瑞沙適用性基因。步驟SI所得測(cè)序文庫(kù)中，存在多種測(cè)序文庫(kù)分子，對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行單分子擴(kuò)增， 即是指，將測(cè)序文庫(kù)中的多種文庫(kù)分子，以極微量(甚至單分子)的形式在空間上隔離(但這些文庫(kù)分子整體上還是屬于同一個(gè)反應(yīng)體系)，并且在各自的空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，以提升各種分子在后續(xù)測(cè)序反應(yīng)中的信號(hào)?，F(xiàn)有技術(shù)中，Sanger測(cè)序技術(shù)每次只能對(duì)一個(gè)樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，要實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序，只能是通過多次反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。而在本發(fā)明中，測(cè)序文庫(kù)中的各個(gè)分子經(jīng)過單分子擴(kuò)增后，每個(gè)測(cè)序文庫(kù)分子均形成單分子拷貝陣列，各單分子拷貝陣列在進(jìn)行高通量基因測(cè)序時(shí)處于不同的位置，使得測(cè)序引物與單分子拷貝陣列之間的雜交，以及在酶作用下的延伸反應(yīng)可同時(shí)進(jìn)行，相互之間互不干擾。因此，可以同時(shí)對(duì)大量的(成百萬(wàn)上千萬(wàn)，甚至上億、數(shù)十億)單分子拷貝陣列同時(shí)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，然后通過采集相應(yīng)的信號(hào)，進(jìn)而獲得所需的序列信息，且測(cè)序的靈敏度較Sanger更高。其中，步驟SI所述的易瑞沙適用性基因特異性引物與易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。進(jìn)一步的，與每個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的引物中，至少有一條引物與目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)， 且該引物的5’端帶有第二標(biāo)簽序列。該第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中，對(duì)不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。該第二標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限，該第二標(biāo)簽的堿基數(shù)優(yōu)選為3 20，更優(yōu)選為4 10。此外，所述特異性引物還可帶有其它標(biāo)記物，包括但不限于生物素標(biāo)記，從而使得易瑞沙適用性基因擴(kuò)增產(chǎn)物的純化極為方便。另外，對(duì)同一待測(cè)樣品的易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增可同時(shí)進(jìn)行或分別獨(dú)立進(jìn)行或部分同時(shí)進(jìn)行。在具體的實(shí)驗(yàn)過程中，可根據(jù)需要選用上述任一種方案進(jìn)行。如果分別對(duì)各易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分別擴(kuò)增的話，能夠通過測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的量來確保步驟SI中用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的易瑞沙適用性基因擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)保持一致，不會(huì)因?yàn)閿U(kuò)增步驟而導(dǎo)致同一待測(cè)樣品的不同易瑞沙適用性基因拷貝數(shù)不同，進(jìn)而影響后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)結(jié)果。當(dāng)然，當(dāng)各易瑞沙適用性基因的各目標(biāo)區(qū)域大小相近，GC含量也相近的時(shí)候，通過合理的設(shè)計(jì)引物，利用多重PCR技術(shù)，步驟SI可對(duì)多個(gè)易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，且保證各易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域之間的擴(kuò)增效率保持基本一致，這樣就能夠有效的提聞實(shí)驗(yàn)效率，降低反應(yīng)的成本。當(dāng)待測(cè)樣品有多個(gè)時(shí)，不同樣品的易瑞沙適用性基因的擴(kuò)增必須分別進(jìn)行。其中，步驟SI所述易瑞沙適用性基因包括EGFR、KRAS, BRAF中的至少一個(gè)。進(jìn)一步的，所述EFGR特異性引物包括 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO
89和SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中的至少一對(duì)；所述KRAS特異性引物包括 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 中的至少一對(duì)；所述 BRAF 特異性引物包括 SEQ ID NO :27 和 SEQ ID NO 28,SEQ ID NO :29 和 SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33 和 SEQ ID NO 34 中的至少一對(duì)。在一個(gè)實(shí)施例中，步驟SI的具體實(shí)現(xiàn)過程是Sll.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；S12.利用接頭元件，與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到測(cè)序文庫(kù)；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。需要說明的是在步驟Sll中，對(duì)同一待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增，可同時(shí)進(jìn)行或分別獨(dú)立進(jìn)行或部分同時(shí)進(jìn)行?？筛鶕?jù)實(shí)際情況，如擴(kuò)增特異性引物的退火溫度，擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域的大小、GC含量，擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域的數(shù)量等，進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增必須分別進(jìn)行。在步驟S12中，所述接頭元件與擴(kuò)增產(chǎn)物的連接方式，可以采用多種方式實(shí)現(xiàn)，包括接頭元件與擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接，或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理之后再進(jìn)行連接。步驟S12所述接頭元件，用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，可包括一種或多種接頭。其中，步驟S12所述接頭元件中的至少一個(gè)接頭包含有第一標(biāo)簽序列，該第一標(biāo)簽序列，用于在文庫(kù)構(gòu)建過程中，對(duì)不同待測(cè)樣品的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記。這樣，在分別獲得目標(biāo)區(qū)域測(cè)序文庫(kù)后，不同的待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序文庫(kù)可以混合在同一個(gè)反應(yīng)體系中，進(jìn)行單分子擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)而同時(shí)進(jìn)行高通量測(cè)序。提高測(cè)序反應(yīng)的效率，降低了樣品檢測(cè)的成本。該第一標(biāo)簽序列優(yōu)選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。進(jìn)一步的，該第一標(biāo)簽序列的堿基數(shù)為3 20，這樣，每次至少能夠?qū)?3個(gè)樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。在綜合考慮各種情況后，如標(biāo)簽的特異性、接頭的成本、接頭的長(zhǎng)度等，第一標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為4 10。通過第二標(biāo)簽和第一標(biāo)簽的結(jié)合，本發(fā)明的發(fā)明每次能夠檢測(cè)至少43X43個(gè)樣品，即4096個(gè)樣品。接頭的修飾方式有多種，包括但不限于被生物素化或甲基化，或同時(shí)被生物素化和甲基化。在一個(gè)實(shí)施例中，該接頭被生物素化，并與未生物素化的片段化產(chǎn)物連接，生物素的存在有利于構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)的分離純化。在另一個(gè)實(shí)施例中，該接頭被甲基化，并與未甲基化的片段化產(chǎn)物連接，然后用僅切割甲基化DNA的限制性內(nèi)切酶消化連接產(chǎn)物，因?yàn)橹挥谐晒B接的連接產(chǎn)物才能被切割，所以只有成功連接的連接物被切割，從而確保酶切產(chǎn)物的單一性。接頭的結(jié)構(gòu)形式也有多種，平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭。構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)過程中可以使用一種或多種接頭。其中，突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭均能夠有效防止在連接過程中，多個(gè)接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生。針對(duì)接頭的上述結(jié)構(gòu)形式，以下將提供多個(gè)實(shí)施例。在第一實(shí)施例中，該接頭元件采用平末端接頭，該接頭是雙鏈完全互補(bǔ)的核酸分子。在第二實(shí)施例中，接頭元件采用突出末端接頭，該接頭是雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子至少包括一突出末端。該突出末端的堿基數(shù)無(wú)具體限制，優(yōu)選為I 10個(gè)堿基。根據(jù)該雙鏈核酸分子的結(jié)構(gòu)，突出末端接頭可分成兩類，分別是單突出末端接頭、雙突出末端接頭。如圖2所示的單突出末端接頭，其一端為平末端，另一端為突出末端。其中帶有分叉接頭的單突出末端接頭能夠防止接頭自連。為了防止一端為平末端的單突出末端接頭自連，可對(duì)平末端上的3’ OH進(jìn)行修飾(包括但不限于用氨基封閉羥基)，或?qū)⑵侥┒松系?’ 磷酸基團(tuán)去除。如圖3所示的雙突出末端接頭，其含有兩個(gè)突出末端，這兩個(gè)突出末端可在一條核苷酸鏈上(圖3a)或在不同的核苷酸鏈上(圖3b)。當(dāng)這兩個(gè)突出末端在不同的核酸鏈上時(shí)，他們相互之間不互補(bǔ)，以防在連接時(shí)出現(xiàn)接頭自連。在第三實(shí)施例中，接頭元件采用帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，如圖4所示，該接頭為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子包括第一互補(bǔ)配對(duì)區(qū)I、莖環(huán)區(qū)2和第二互補(bǔ)配對(duì)區(qū)3 (圖4a)，第一互補(bǔ)配對(duì)區(qū)I能夠與第二互補(bǔ)配對(duì)區(qū)3互補(bǔ)配對(duì)，且它們形成的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)包括至少一個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，而通過該酶切識(shí)別位點(diǎn)，特定的酶能夠?qū)⑶o環(huán)區(qū)切開或切除，從而將單鏈核酸分子變成雙鏈核酸分子，以便于后續(xù)的操作。優(yōu)選的，如圖4b所示，帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭還可帶有突出末端4，該突出末端可位于單鏈核酸分子的5’端或3’端。突出末端 4的存在能夠進(jìn)一步的防止接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生。該突出末端優(yōu)選為T。在第四實(shí)施例中，接頭元件采用分叉接頭是雙鏈核酸分子，如圖5所示，包括互補(bǔ)區(qū)和分叉區(qū)，所述分叉區(qū)的兩條單鏈各包含至少一個(gè)擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述分叉接頭的互補(bǔ)區(qū)包括至少一個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，該酶切識(shí)別位點(diǎn)可以在建庫(kù)過程中酶切形成末端，以便于進(jìn)行后續(xù)的操作。該分叉接頭的分叉設(shè)計(jì)能夠在建庫(kù)過程避免多個(gè)接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)；所述分叉區(qū)上包含的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，可以直接用于結(jié)合擴(kuò)增引物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)其中，所述分叉接頭的分叉區(qū)的每條鏈各含有N個(gè)核苷酸；優(yōu)選的，9 < N < 30。 其中，所述分叉接頭的配對(duì)區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸對(duì)數(shù)不限；優(yōu)選的，互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸對(duì)數(shù)為7 15，更優(yōu)選的，互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸對(duì)數(shù)為9 13。其中，所述分叉接頭的配對(duì)區(qū)的3’末端為突出末端或平末端。優(yōu)選的，所述分叉接頭的配對(duì)區(qū)的3’末端為突出末端，該突出末端可與所述片段化產(chǎn)物的粘性末端互補(bǔ)配對(duì)， 提聞了連接效率，以利于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)反應(yīng)的順利進(jìn)行。優(yōu)選的，所述分叉接頭為T末端分叉接頭，該接頭的配對(duì)區(qū)的3’末端為突出末端， 且突出末端最后一個(gè)堿基為T ;例如圖6所示的T末端分叉接頭，圖中N為A、T、C、G堿基中的任一種。優(yōu)選的，所述分叉接頭的配對(duì)區(qū)的3’末端為突出末端，且突出末端的核苷酸包括通用堿基。其中，突出末端的堿基數(shù)無(wú)特殊限制，優(yōu)選為I 4。例如圖7所示的分叉接頭，圖中N為A、T、C、G堿基中的任一種，X為通用堿基。優(yōu)選的，所述分叉接頭為雙脫氧接頭，該接頭的配對(duì)區(qū)的3’末端為平末端，且3’ 末端最后一個(gè)核苷酸為帶有雙脫氧堿基的核苷酸；例如圖8所示的雙脫氧分叉接頭，圖中N 為A、T、C、G堿基中的任一種，dd表示該3’末端最后一個(gè)核苷酸為帶有雙脫氧堿基的胞嘧啶核苷酸。應(yīng)當(dāng)說明的是，上述接頭元件只是部分實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。關(guān)于步驟S12的實(shí)現(xiàn)方式在一個(gè)實(shí)施例中，步驟S12采用接頭元件與擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接的方式，構(gòu)建出測(cè)序文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物較大時(shí)或者需要構(gòu)建的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序文庫(kù)的大小較小時(shí)，則對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物先進(jìn)行片段化處理，然后片段化產(chǎn)物再與接頭元件進(jìn)行連接，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，如圖9所示，步驟S12包括以下步驟S121.對(duì)與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化，得片段化產(chǎn)物；S122.利用接頭元件，與所述片段化產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。通過片段化步驟S31將易瑞沙適用性基因擴(kuò)增產(chǎn)物變成較小的片段化產(chǎn)物，從而有助于對(duì)易瑞沙適用性基因的進(jìn)一步深度測(cè)序。此外，還可以通過片段化處理，將不同的擴(kuò)增產(chǎn)物變成長(zhǎng)短相似的片段化產(chǎn)物，能夠有助于后續(xù)的統(tǒng)一測(cè)序。需要說明的是步驟S121所述的片段化易瑞沙適用性基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法有多種，包括但不限于超聲法、噴霧法、化學(xué)剪切法和酶切法?？筛鶕?jù)實(shí)際情況，采用相適應(yīng)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在得到步驟S121所述的片段化產(chǎn)物后，往往還需進(jìn)行末端修飾，以便于接頭元件的連接。所述末端修飾包括但不限于末端補(bǔ)平、磷酸化或去磷酸化、末端加A。所述片段化處理之后還可包括片段化產(chǎn)物的分離純化以及末端修飾的步驟。根據(jù)測(cè)序的片段長(zhǎng)度需要，對(duì)于片段化得到的核酸片段，進(jìn)行目的核酸片段的分離純化，分離方法可以采用常用方法，如凝膠電泳、蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離等。根據(jù)所使用的片段化方法，對(duì)所得的目的核酸片段進(jìn)一步的末端修飾，包括但不限于磷酸化或去磷酸化、末端補(bǔ)平和末端加A，以便于后續(xù)的接頭元件連接。其中，步驟S121所述目的核酸片段的長(zhǎng)度不限，優(yōu)選為25bp 500bp，更優(yōu)選為 30bp 200bp,更優(yōu)選為40bp lOObp。在實(shí)現(xiàn)對(duì)易瑞沙適用性基因的測(cè)序的前提下，隨著測(cè)序文庫(kù)分子中含有的易瑞沙適用性基因片段長(zhǎng)度的減短，高通量測(cè)序技術(shù)的對(duì)易瑞沙適用性基因的測(cè)序深度加深；而測(cè)序深度越深，即對(duì)易瑞沙適用性基因的每一個(gè)堿基位置的測(cè)序次數(shù)越多，測(cè)序結(jié)果越準(zhǔn)確，對(duì)樣品中的少量突變的檢測(cè)就越靈敏；這樣就能夠有效防止因?yàn)闃悠分袔в型蛔兊囊兹鹕尺m用性基因的比例偏低，而導(dǎo)致該突變的測(cè)序信號(hào)的絕對(duì)值偏低，發(fā)生測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)序文庫(kù)大小的限制，可在步驟S121或S122之后，對(duì)片段化產(chǎn)物或測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行分離純化。分離純化的方法有多種，包括但不限于凝膠方法、蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降和柱層析分離?？筛鶕?jù)實(shí)際情況，采用相適應(yīng)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所選用接頭元件的不同，步驟S122可采用不同的方法，下面將通過多個(gè)實(shí)施例和附圖對(duì)本步驟進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，直接在片段化產(chǎn)物的兩端接上接頭形成測(cè)序文庫(kù)。所述接頭可采用上述的平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，，如圖10所示，步驟S122包括以下步驟S1221.利用第一接頭與片段化產(chǎn)物的兩端連接，得第一連接產(chǎn)物；S1222.環(huán)化第一連接產(chǎn)物，得環(huán)化產(chǎn)物；S1223. II s型限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)化產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物；S1224.在酶切產(chǎn)物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測(cè)序文庫(kù)。在步驟S1221中，所述弟一接頭可米用平末〗而接頭、關(guān)出末〗而接頭、帶環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，所述第一接頭包含有II S型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)；所述 II s型限制性內(nèi)切酶為切割位點(diǎn)在識(shí)別序列之外的限制性內(nèi)切酶，包括但不限于Acu I、 Alw I、Bbs I、BbV I、Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM
II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I、Hph I、HpyAV、Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、NmeAIII、 Ple I、Sap I、SfaN I 和 TspDT I，優(yōu)選為 Acu I、Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I。當(dāng)所述第一接頭為分叉接頭時(shí)，該II s型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)位于互補(bǔ)區(qū)；當(dāng)所述第一接頭為帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭時(shí)，限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離，較II S型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離近。若片段化產(chǎn)物經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，以及末端加A反應(yīng)，所述第一接頭優(yōu)選為帶T 末端的分叉接頭。若片段化產(chǎn)物只是經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，將片段化產(chǎn)物的末端補(bǔ)平，則所述第一接頭優(yōu)選雙脫氧接頭。在步驟S1222中，環(huán)化第一連接產(chǎn)物有多種實(shí)現(xiàn)方式。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，步驟S1222包括以下步驟S12221.利用酶切引物對(duì)第一連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；S12222.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，使得擴(kuò)增產(chǎn)物形成粘性末端，并自身環(huán)化成環(huán)化產(chǎn)物。所述酶切引物的3’端分別與第一連接產(chǎn)物的兩個(gè)末端部分互補(bǔ)，5’端均含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。經(jīng)過步驟S12221的擴(kuò)增形成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其兩個(gè)末端均含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，然后在相應(yīng)的酶的作用下，使擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端形成粘性末端，且這兩個(gè)粘性末端互補(bǔ)，能夠進(jìn)行自身環(huán)化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述第一接頭包含有2個(gè)酶切識(shí)別位點(diǎn)，其中一個(gè)為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用于使步驟S1222形成的第一連接產(chǎn)物的兩端在相應(yīng)的酶的作用下，形成粘性末端，且它們之間互補(bǔ)，能夠進(jìn)行自身環(huán)化。另一個(gè)為II s型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)，用于在步驟S1223中，利用識(shí)別該酶切位點(diǎn)的酶識(shí)別環(huán)化產(chǎn)物，進(jìn)行酶切， 進(jìn)而得到酶切產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)說明，以上兩個(gè)實(shí)施例僅為本發(fā)明中的兩種實(shí)現(xiàn)環(huán)化第一連接產(chǎn)物的實(shí)施方案，對(duì)于本發(fā)明的保護(hù)范圍不做任何具體的限制。在步驟S1223中，利用能夠識(shí)別第一接頭上的酶切識(shí)別位點(diǎn)，并切割環(huán)化產(chǎn)物 (DNA)但不切割第一接頭的酶進(jìn)行酶切。所述第一接頭上的酶切識(shí)別位點(diǎn)包括但不限于Mme I酶切識(shí)別位點(diǎn)、Acu I酶切識(shí)別位點(diǎn)、Bsg I酶切識(shí)別位點(diǎn)。在步驟S1224中，所述弟_■接頭可為平末〗而接頭、關(guān)出末〗而接頭、帶環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，可帶有生物素標(biāo)記。所述第三接頭可為平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種。第二接頭與第三接頭可相同或不同。優(yōu)選的， 所述第二接頭和第三接頭相同，均為分叉接頭。更優(yōu)選的，所述分叉接頭為T末端分叉接頭或雙脫氧分叉接頭。需要特別說明的是步驟S1222與S1223之間還可包括步驟S1222A :滾環(huán)擴(kuò)增環(huán)化產(chǎn)物，得滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物。通過步驟S1222A，能夠保證后續(xù)的酶切步驟S1223有足夠的原材料。又或者，在步驟S1221與S1222之間還可包括步驟S1221A :利用擴(kuò)增引物對(duì)第一連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物。所述擴(kuò)增引物分別與第一連接產(chǎn)物兩端的接頭序列互補(bǔ)。 通過步驟S1221A，能夠保證后續(xù)的環(huán)化步驟有足夠的原材料。本方案可避免在步驟S1222之后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，而用步驟S1222之前的步驟 S1221A進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增代替，可有效減少后續(xù)酶切步驟中，II s型限制性內(nèi)切酶的用量。其中，所述第一接頭優(yōu)選為分叉接頭。其中，所述分叉接頭的互補(bǔ)區(qū)可包含至少一個(gè)酶切識(shí)別位點(diǎn)。所述酶切識(shí)別位點(diǎn)可為普通的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，也可為II S型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中，步驟S122IA所述擴(kuò)增弓I物優(yōu)選為生物素化引物，有利于擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化。其中，步驟S1221A所述擴(kuò)增引物帶有至少一個(gè)特異性酶切識(shí)別位點(diǎn)。若擴(kuò)增引物上所帶的特異性酶切識(shí)別位點(diǎn)是尿嘧啶堿基，則步驟S1222中利用尿嘧啶特異性切除試劑進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行連接環(huán)化；若擴(kuò)增引物所帶特異性酶切識(shí)別位點(diǎn)為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，則步驟S1222中利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行連接環(huán)化。針對(duì)步驟S122，本發(fā)明提出另一個(gè)實(shí)施例，如圖11所示，包括以下步驟S1221’ .利用第四接頭與片段化產(chǎn)物連接，得第二連接產(chǎn)物；S1222’ . II s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得帶有第四接頭的酶切片段；S1223’ .帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測(cè)序文庫(kù)。需要說明的是在步驟S1221’中，所述第四接頭可采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，所述第四接頭包含有II S型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)；當(dāng)所述第四接頭為分叉接頭時(shí)，該II s型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)位于互補(bǔ)區(qū)；當(dāng)所述第四接頭為帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭時(shí)，限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離，較II s型限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離近。在步驟S1222’中，利用能夠識(shí)別第四接頭上的酶切識(shí)別位點(diǎn)，并切割環(huán)化產(chǎn)物 (DNA)但不切割第四接頭的酶進(jìn)行酶切。所述第四接頭上的酶切識(shí)別位點(diǎn)包括但不限于 Mme I酶切識(shí)別位點(diǎn)、Acu I酶切識(shí)別位點(diǎn)、Bsg I酶切識(shí)別位點(diǎn)。若片段化產(chǎn)物經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，以及末端加A反應(yīng)，所述第四接頭優(yōu)選為帶T末端的分叉接頭。若片段化產(chǎn)物只是經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，則所述第一四接頭優(yōu)選雙脫氧接頭。在步驟S1223’中，所述弟五接頭可為平末纟而接頭、關(guān)出末纟而接頭、帶環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，可帶有生物素標(biāo)記。針對(duì)步驟S122，本發(fā)明提出另一實(shí)施例，具體包括以下步驟S1221”.直接在片段化產(chǎn)物的兩端接上帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，形成帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的片段化產(chǎn)物；S1222”.利用限制性內(nèi)切酶，將帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的片段化產(chǎn)物的莖環(huán)區(qū)切開或切除，從而形成測(cè)序文庫(kù)。本技術(shù)方案利用帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，防止了多個(gè)接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生。當(dāng)通過上述幾個(gè)方案形成的測(cè)序文庫(kù)的數(shù)量過少，不利于后續(xù)的單分子擴(kuò)增步驟時(shí)，還可以進(jìn)行以下步驟利用與目標(biāo)區(qū)域測(cè)序文庫(kù)兩端的接頭部分互補(bǔ)的引物，以所得的測(cè)序文庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增后的測(cè)序文庫(kù)。該步驟可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)目標(biāo)測(cè)序文庫(kù)的量的要求。其中，步驟S2所述的單分子擴(kuò)增是指對(duì)測(cè)序文庫(kù)中的分子，以極微量(甚至單分子)的形式在空間上隔離(但這些文庫(kù)分子整體上還是屬于同一個(gè)反應(yīng)體系)，并且在各自的空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，以提升各種分子在后續(xù)測(cè)序反應(yīng)中的信號(hào)。所述單分子擴(kuò)增的方法包括但不限于乳液PCR(Emulsion PCR, EPCR)、橋式PCR。所述EPCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無(wú)數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。 理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板(測(cè)序文庫(kù)分子)和一個(gè)磁珠，磁珠上含有與測(cè)序文庫(kù)分子的共有序列(由接頭元件引入)互補(bǔ)的引物，在PCR反應(yīng)后，磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源的DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。EPCR的具體步驟可參考PCR amplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion !application for high-throughput screening of transcription factor targets, Takaaki Kojima, Yoshiaki Takei, Miharu Ohtsuka et al, Nucleic Acids Research,2005, Vol.33, No. 17 ；Dual primer emulsion PCR for nextgeneration DNA sequencing, Ming Yan Xu, Anthony D. Aragon,Monica R. Mascarenas et al,BioTechniques 48 :409-412(May 2010)； BEAMing :single_molecule PCR on microparticles in water—in—oil emulsions, Frank Diehl, Meng Li, Yiping He, nature methods, Vol. 3, No. 7, July 2006 等。所述橋式PCR的基本原理是，橋式PCR的引物被固定在固相載體上，PCR過程中 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)被固定在固相載體上，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠與固相載體上的引物互補(bǔ)配對(duì)，成橋狀，然后互補(bǔ)配對(duì)的引物以與其成橋的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。通過控制初始模板加入的量，橋式PCR反應(yīng)完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物在固相載體上以一簇簇的形式存在，且每一簇的擴(kuò)增產(chǎn)物為同來源的DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。其具體的原理和實(shí)施方案可參考以下文獻(xiàn) CN20061009879. X、US6227604。如前所述,現(xiàn)有技術(shù)中，Sanger測(cè)序技術(shù)由于自身的技術(shù)限制,每次只能對(duì)一個(gè)樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。為了一次性實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中多個(gè)區(qū)域的同時(shí)檢測(cè)，本發(fā)明在測(cè)序方法上采取高通量基因測(cè)序方法。高通量基因測(cè)序相對(duì)Sanger測(cè)序法檢測(cè)序列信息更為方便靈敏，測(cè)序文庫(kù)中的各個(gè)分子經(jīng)過單分子擴(kuò)增后，每個(gè)測(cè)序文庫(kù)分子均形成單分子拷貝陣列，各單分子拷貝陣列在進(jìn)行高通量基因測(cè)序時(shí)處于不同的位置，使得測(cè)序引物與單分子拷貝陣列之間的雜交，以及在酶作用下的延伸反應(yīng)可同時(shí)進(jìn)行，相互之間互不干擾。因此，可以同時(shí)對(duì)大量的(成百萬(wàn)上千萬(wàn)，甚至更多的)單分子拷貝陣列同時(shí)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)， 然后通過采集相應(yīng)的信號(hào)，進(jìn)而準(zhǔn)確的獲得所需的序列信息，且測(cè)序的靈敏度較Sanger更高。尤其是對(duì)多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了片段化處理，相當(dāng)于對(duì)相同序列的目標(biāo)區(qū)域分子的每個(gè)堿基的測(cè)序次數(shù)增加了，能夠進(jìn)一步提高測(cè)序的靈敏度。其中，步驟S3所述的高通量測(cè)序技術(shù)包括但不限于基于聚合酶的合成測(cè)序法、 基于連接酶的連接測(cè)序法?；诰酆厦傅暮铣蓽y(cè)序法是基于帶可去除標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的。在每次合成反應(yīng)中，每個(gè)模板鏈至多只能延伸一次，基于聚合酶的合成測(cè)序法的大致流程如下a.測(cè)序引物通過互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)，在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集該次加入核苷酸的標(biāo)記信號(hào)，即可得到與測(cè)序引物3’ 最末端堿基互補(bǔ)的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物(固定在引物-固相載體復(fù)合物上)的下一位的堿基序列信息。b.切除可去除標(biāo)記，然后在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸繼續(xù)進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集加入核苷酸的標(biāo)記信號(hào)，即可得到與測(cè)序引物3’末端堿基互補(bǔ)的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的下兩位的堿基序列信息。重復(fù)b步驟，直至不能繼續(xù)進(jìn)行合成反應(yīng)為止，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的全部序列信息?；谶B接酶的連接測(cè)序法是均是基于帶熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的。其中一種連接酶的連接測(cè)序法是基于在特定位置帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的，該寡核苷酸探針帶有η個(gè)堿基，從其5’端數(shù)起的第a位帶有熒光標(biāo)記，其中不同的堿基對(duì)應(yīng)特定的熒光標(biāo)記，因?yàn)樵摴押塑账崽结樀?’端或5’端進(jìn)行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物只能連接一個(gè)寡核苷酸探針。該連接測(cè)序法的大致流程如下A.測(cè)序引物通過互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)上，利用上述的寡核苷酸探針，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號(hào)，即可得到與單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a位堿基序列信息。B.切除寡核苷酸上的熒光標(biāo)記，在連接酶的作用下，以上述的寡核苷酸探針為原料，繼續(xù)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后采集熒光信號(hào)，從而得到單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’ 末端后或5’末端前第2a位的堿基序列信息。重復(fù)B步驟，直至不能繼續(xù)進(jìn)行連接反應(yīng)為止，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a、2a、3a、4a......位的堿基序列信息。然后將測(cè)序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上變性洗脫下來， 換用與之前的測(cè)序引物相比3’末端或5’末端少一個(gè)堿基的引物重復(fù)上述反應(yīng)，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3，末端后或5，末端前第a-1、2a-l、3a_l、4a_l......位的堿基序列信息。重復(fù)此步驟，最后獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’
末端如第a_(a_l)、2a_(a_l)、3a_(a_l)、4a_(a_l)......位的喊基序列i目息，從而獲得單
鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的全部序列信息。另一種連接酶的連接測(cè)序法同樣也是基于帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的， 該寡核苷酸探針帶有η個(gè)堿基，分為h(h ( η)組，同一組寡核苷酸探針的不同熒光標(biāo)記對(duì)應(yīng)同一特定位置的不同堿基序列，不同組之間的區(qū)別在于不同熒光標(biāo)記對(duì)應(yīng)的特定位置不同，因?yàn)樵摴押塑账崽结樀?’端或5’端進(jìn)行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物只能連接一個(gè)寡核苷酸探針。該連接測(cè)序法的大致流程如下a.測(cè)序引物通過互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)上，利用上述寡核苷酸探針中的一組(熒光標(biāo)記對(duì)應(yīng)的堿基位置為x，x < h)，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號(hào)，即可得到與單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第X 位堿基序列信息，將測(cè)序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上變性洗脫下來。b.然后重新將測(cè)序引物結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上，換用與a步驟不同的寡核苷酸探針組(熒光標(biāo)記對(duì)應(yīng)的堿基位置為1，I ( h)，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號(hào)，即可得到與單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第y位堿基序列信息，將測(cè)序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上變性洗脫下來。 c.重復(fù)步驟b，直至h組寡核苷酸探針均分別進(jìn)行過一次連接反應(yīng)，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第1、2.......h位的堿基序列信息。換用與之前的測(cè)序引物相比3’末端或5’末端多一個(gè)或多個(gè)通用堿基的引物按上述原理進(jìn)行反應(yīng)，能夠延長(zhǎng)獲得的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前的堿基序列的讀長(zhǎng)。這種基于連接酶的連接測(cè)序法的原理和具體實(shí)施方案可參考CN200710170507. I?；诰酆厦傅暮铣蓽y(cè)序法與焦磷酸測(cè)序法有一定的相似之處，因此，理論上來說， 焦磷酸測(cè)序法同樣能夠適用于本發(fā)明的檢測(cè)方法。但是現(xiàn)有的焦磷酸測(cè)序法在測(cè)序過程中采用的是天然dNTP，使得其在測(cè)序過程中，對(duì)待測(cè)序文庫(kù)上可能存在的連續(xù)單堿基重復(fù)序列的測(cè)定存在困難；而基于聚合酶的合成測(cè)序法中的核苷酸帶有的可去除標(biāo)記，能夠保證每次只延伸一個(gè)堿基；基于連接酶的連接測(cè)序發(fā)中的帶熒光標(biāo)記的探針的3’端或5’端進(jìn)行了修飾，保證每個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上只連接一個(gè)熒光探針；因此本發(fā)明的基于聚合酶的合成測(cè)序法和基于連接酶的連接測(cè)序法的準(zhǔn)確性較焦磷酸測(cè)序高。此外，因?yàn)楝F(xiàn)有的焦磷酸測(cè)序儀器中的蝕刻光纖玻片(PTP板)上的小孔較大 (55 UmX 44 μ m)，用于容納測(cè)序之前的乳液PCR所得的擴(kuò)增產(chǎn)物(乳液PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物被固定在10 μ m的珠上)，這大大限制了焦磷酸測(cè)序法的測(cè)序通量，使得其測(cè)序反應(yīng)的試劑成本較高。此外，焦磷酸測(cè)序法在測(cè)序過程中還需往蝕刻光纖玻片(PTP板)的小孔內(nèi)加入昂貴的含有多種蛋白的復(fù)合物以保證測(cè)序反應(yīng)的順利進(jìn)行，而這將大大提高測(cè)序反應(yīng)的試劑成本。
相對(duì)的，基于聚合酶的合成測(cè)序法和基于連接酶的連接測(cè)序法可通過I μ m的磁珠或者玻片來固定單分子擴(kuò)增的產(chǎn)物，使得其通量更高，且除了需要帶有可去除標(biāo)記的核苷酸或在3’端或5’端進(jìn)行了修飾的熒光標(biāo)記的探針外，所需的其他試劑無(wú)特殊要求，這就大大降低了測(cè)序反應(yīng)的試劑成本。在獲得相同數(shù)據(jù)量的情況下，基于聚合酶的合成測(cè)序法和基于連接酶的連接測(cè)序法的測(cè)序成本為焦磷酸測(cè)序法的2000分之一或更少。因此本發(fā)明方案中采用的是基于聚合酶的合成測(cè)序法或基于連接酶的連接測(cè)序法對(duì)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，同時(shí)檢測(cè)EGFR基因的外顯子18、19、20、21，KRAS基因的外顯子1、2、3、4，BRAF基因的外顯子11、15。設(shè)計(jì)分別用于擴(kuò)增EGFR基因外顯子18、19、20、21，KRAS基因的外顯子1、2、3、 4，BRAF 基因的外顯子 11、15 的特異性引物E18F(SEQ ID NO 1)和 E18R(SEQ ID NO :2)、 E19F(SEQ ID NO 3)和 E19R(SEQ ID NO :4)、E20F(SEQ ID NO 5)和 E20R(SEQ ID NO :6)、 E21F(SEQ ID NO 7)和 E21R(SEQ ID NO 8) ；K1F(SEQ ID NO :13) KlR(SEQ ID NO :14)、 K2F (SEQ ID NO :15)和 K2R(SEQ ID NO :16)、K3F(SEQ ID NO :17)和 K3R(SEQ ID NO :18)、 K4AF (SEQ ID NO :19)和 K4AR(SEQ ID NO :20)、K4BF (SEQ ID NO :21)和 K4BR(SEQ ID NO:
22),BllFl (SEQ ID NO :27)和BllRl(SEQ ID NO :28)、B11F2 (SEQ ID NO :29)和 B11R2(SEQ ID NO :30)、B15F1(SEQ ID NO :31)和 B15R(SEQ ID NO :32)、B15F2 (SEQ ID NO :33)和 B15R2(SEQ ID NO :34)?！?、待測(cè)樣品DNA的提取利用市場(chǎng)上常見的核酸提取試劑盒分別提取全血樣品(I至10)、血清樣品(11至 20)、石蠟組織樣品(21至30)的DNA，并分別做上相應(yīng)的標(biāo)記。二、易瑞沙適用性基因目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增利用上述的易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物。各易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增是分別進(jìn)行的。反應(yīng)體系如下
0193]上游引物(10μ Μ)2μ L ；
0194]下游引物(10μ Μ)2μ L ；
0195]dNTP(各 2.5mM)4μ L ；
0196]待測(cè)樣品DNA20ng ；
0197]Ex Taq (5U/ μ L)0. 25 μ L ；
0198]IOXEx Taq Buffer5 μ L ；
0199]ddH20 加至 50yL。
0200]PCR反應(yīng)條件如下
0201]95 °C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s，72°C 30s ;重復(fù) 25 個(gè)循環(huán)；72 °C 7min。利用PCR清潔試劑盒，分別對(duì)各樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔，除去未擴(kuò)增的引物和 dNTP，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。三、構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)此步驟可有多種實(shí)施方案，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，包括以下兩個(gè)步驟
I.擴(kuò)增產(chǎn)物的片段化利用超聲法進(jìn)行片段化處理。具體操作為測(cè)定回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，并按等摩爾數(shù)將同一樣品的不同易瑞沙適用性基因的目標(biāo)區(qū)域的回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混合，得混合液，并做上相應(yīng)的標(biāo)記。將每個(gè)樣品的混合液(約50yL)加入至400yL的TE buffer中，在430W功率條件下超聲4s，間隔20s，反復(fù)5次，得片段化產(chǎn)物。利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)各樣品的片段化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，切膠回收大小在40bp至IOObp的片段化產(chǎn)物。2.構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)在構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)之前，需對(duì)切膠回收的片段化產(chǎn)物分別進(jìn)行末端修飾，以便于接頭元件的連接。在本實(shí)施例中，對(duì)切膠回收的片段化產(chǎn)物的末端修飾包括磷酸化、末端補(bǔ)平和末端加A反應(yīng)。具體實(shí)現(xiàn)如下
I)磷酸化以及末端補(bǔ)平反應(yīng)
體系為
切膠回收的片段化產(chǎn)物約 2000ng ；
IOmM dNTPI. 5μ L ；
T4DNA 聚合酶(5U/ μ L)I μ L ；
Klenow DNA聚合酶O. I μ L ；
Τ4多核苷酸激酶(10U/yL)O. 5 μ L ；
IOm MATPI. 5μ L ；
T4DNA連接緩沖液10μ L ；
加 ddH20 至 100 μ L。
反應(yīng)條件為20°C孵育20min。,反應(yīng)結(jié)束后利用回收試劑盒進(jìn)行純化回收。
2)末端加A尾的反應(yīng)體系為
磷酸化以及末端補(bǔ)平后的回收產(chǎn)物約IOOOng ；
Klenow 緩沖液(NEB Buffer2)10μ L ；
IOmM dATP2 μ L ；
Klenow 酶(3，to 5’ exo minus, IOU/ μ L) I μ L ；
加 ddH20 至 100 μ L。
反應(yīng)條件為在37°C孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后利用純化試劑盒純化回收。
3)連接接頭I
本實(shí)施例中，采用如圖6所示的T末端分叉接頭作為接頭1，同一樣品的所使用的
T末端分叉接頭相同，不同樣品的T末端分叉接頭不同，區(qū)別在于標(biāo)簽序列不同，不同樣品對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽序列如下表I所示。 表I各樣本所使用的T末端分叉接頭上的標(biāo)簽序列
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，包括以下步驟A.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；B.對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；C.同時(shí)對(duì)所述多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測(cè)序，得到所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的序列信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，所述步驟A包括以下步驟Al.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；A2.利用接頭元件，與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到測(cè)序文庫(kù)；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，所述步驟A2包括以下步驟A21.對(duì)與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化，得片段化產(chǎn)物；A22.利用接頭元件，與所述片段化產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，所述步驟A22包括以下步驟A221.利用第一接頭與片段化產(chǎn)物的兩端連接，得第一連接產(chǎn)物；A222.環(huán)化第一連接產(chǎn)物，得環(huán)化產(chǎn)物；A223. II s型限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)化產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物；A224.在酶切產(chǎn)物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測(cè)序文庫(kù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，所述步驟A22包括以下步驟Α22Γ .利用第四接頭與片段化產(chǎn)物連接，得第二連接產(chǎn)物；A222’ . II s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得帶有第四接頭的酶切片段；A223’ .帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測(cè)序文庫(kù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，步驟A2所述的接頭元件中的至少一個(gè)接頭包含有第一標(biāo)簽序列，用于在文庫(kù)構(gòu)建過程中，對(duì)不同待測(cè)樣品的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，步驟 A中，與每個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的易瑞沙適用性基因特異性引物中，至少有一條引物與該目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端含有第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中對(duì)不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法，其特征在于，所述易瑞沙適用性基因包括EGFR、KRAS, BRAF中的至少一個(gè)。
9.一種易瑞沙適用性基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括易瑞沙適用性基因特異性引物，用于對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；接頭元件，用于與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的易瑞沙適用性基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的易瑞沙適用性基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述接頭元件中的至少一個(gè)接頭包含有第一標(biāo)簽序列，用于在文庫(kù)構(gòu)建過程中，對(duì)不同待測(cè)樣品的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的易瑞沙適用性基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，與每個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的易瑞沙適用性基因特異性引物中，至少有一條引物與該目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端含有第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中對(duì)不同待測(cè)樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12任一項(xiàng)所述的易瑞沙適用性基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述易瑞沙適用性基因包括EGFR、KRAS, BRAF中的至少一個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，提供了一種檢測(cè)易瑞沙適用性基因的方法及試劑盒，該方法包括以下步驟A.利用易瑞沙適用性基因特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；B.對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；C.同時(shí)對(duì)所述多個(gè)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測(cè)序，得到所述多個(gè)目標(biāo)區(qū)域的序列信息。該方法和試劑盒能同時(shí)對(duì)易瑞沙適用性基因的多個(gè)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行區(qū)域檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)還能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，并能進(jìn)一步同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行多區(qū)域檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586421SQ20111044517
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者盛司潼 申請(qǐng)人:盛司潼