專利名稱：豬4-1bb受體，編碼其的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，具體涉及豬4-1BB受體，編碼其的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是一個(gè)豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，然而目前豬瘟、繁殖和呼吸綜合癥(藍(lán)耳病， PRRSV)等疫病嚴(yán)重流行是我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)面臨的最大困難，因此疫病防控成為穩(wěn)定和發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的重大問(wèn)題。然而，近年來(lái)豬病普遍呈現(xiàn)多病原交叉混合感染，豬的抗病能力和疫苗的防治效果明顯降低。因此要做好疫病防控工作，需要尋找疫苗研發(fā)的新策略，或者尋求替代或輔助途徑，如培育出具有抗病性的新品種豬。然而已有的研究成果多致力于利用特定疾病抗性基因培養(yǎng)單一抗病特性的家畜新品種。而這種策略顯然與當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)疫病多發(fā)的現(xiàn)實(shí)狀況差距太大。因此，培育出具有廣譜抗病性的新品種豬成為眾多科研人員的理想。適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)在動(dòng)物抵抗病原體侵襲過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。T細(xì)胞的活化更是該反應(yīng)的重中之重。近年來(lái)的研究證明，T細(xì)胞的有效激活需要雙信號(hào)刺激。 一是MHC-抗原肽與TCR結(jié)合產(chǎn)生的第一信號(hào)，二是共刺激受體，主要是4-1BB等受體與其配體結(jié)合產(chǎn)生的第二信號(hào)。在正常的機(jī)體微環(huán)境下，抗原遞呈細(xì)胞遞呈出來(lái)的抗原肽往往數(shù)量較少，其與TCR的結(jié)合不足以活化T細(xì)胞，容易造成T細(xì)胞反應(yīng)無(wú)能。而T細(xì)胞共刺激受體4-1BB等提供的共刺激信號(hào)通路可以彌補(bǔ)較弱的TCR信號(hào)，從而激活T細(xì)胞。再者，當(dāng) TCR與抗原肽的親和不足時(shí)，往往難以活化T細(xì)胞，而足夠的共刺激信號(hào)也能起到增強(qiáng)TCR 信號(hào)通路的作用，從而激活T細(xì)胞?？傊?，足夠的共刺激信號(hào)，既可以克服TCR占有率較少的問(wèn)題，還可以彌補(bǔ)TCR親和力的不足。因此共刺激受體介導(dǎo)的信號(hào)能增強(qiáng)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能，從而具備成為廣譜抗病基因候選的潛能。4-1BB分子(亦名⑶137)自1989年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其在共刺激信號(hào)通路上所起的重要作用日趨明朗。與其配體4-1BBL相結(jié)合傳遞的信號(hào)主要作用是增強(qiáng)CD8T細(xì)胞的活性和記憶性T細(xì)胞的抗病毒活性，同時(shí)也加強(qiáng)了 T細(xì)胞功能信號(hào)的放大和對(duì)病原物的有效清除。 而4-1BB分子在記憶性T細(xì)胞對(duì)抗原再次產(chǎn)生作用時(shí)也介導(dǎo)傳遞必須的信號(hào)。另外，4-1BB 還在獲得性免疫調(diào)控中同時(shí)扮演介導(dǎo)腫瘤清除和預(yù)防自身免疫疾病的雙重角色。4-1BB受體對(duì)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的建立、增強(qiáng)及其維持都具有重要作用，這預(yù)示著他們作為靶基因在轉(zhuǎn)基因育種研究及應(yīng)用中具有良好的前景。但是目前絕大多數(shù)共刺激分子相關(guān)研究都是基于基因敲除或者是利用抗4-1BB的單抗來(lái)除去或者增強(qiáng)共刺激信號(hào)的方式進(jìn)行的。這些策略明顯不適于育種研究。再者，豬的4-1BB受體目前只有預(yù)測(cè)的基因序列信息被公布，其確切的編碼序列及其蛋白功能在此之前均未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬4-1BB受體，編碼其的基因及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供豬4-1BB受體分子，其為由SEQ ID NO. 3或4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。這兩個(gè)豬4-1BB受體分子的氨基酸長(zhǎng)度分別為255 (變體1)和241 (變體2、，兩者之間的同源性高達(dá)94. 5%，受體分子2僅比受體分子1在靠近羧基端缺少連續(xù)的14個(gè)氨基酸。SEQ ID NO. 3所示的為豬4-1BB變體1的氨基酸序列，SEQ ID NO. 4所示的為豬4-1BB 變體2的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明豬4-1BB受體還包括由SEQ ID NO. 3或4所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID NO. 3或4所示的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。例如在 4-1BB兩個(gè)變體的胞外區(qū)，將第79位的絲氨酸替換為蘇氨酸，或是將第107位的谷氨酰胺缺失，或是在198位后面增加3個(gè)脯氨酸。優(yōu)選的，衍生蛋白的氨基酸序列與SEQ ID No. 3或4所示的氨基酸序列的同源性可為70%以上，優(yōu)選80%以上，更優(yōu)選90%以上。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因。優(yōu)選的，本發(fā)明提供的編碼豬4-1BB受體的基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1或2所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明還提供的含有豬4-1BB受體基因的載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供所述的豬4-1BB受體在提高豬廣譜抗病性中的應(yīng)用。如通過(guò)制備抗豬4-1BB單抗來(lái)研制生物制劑，以口服或注射方式給藥后，該單抗與4-1BB受體的結(jié)合可增強(qiáng)T細(xì)胞激活所需的第二信號(hào)，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，提高豬的抗病能力。本發(fā)明還提供上述的豬4-1BB受體基因在培育廣譜抗病性豬中的應(yīng)用。具體方法為1)將豬4-1BB受體基因克隆到真核表達(dá)載體上，或通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得豬 4-1BB受體基因mRNA ；2)利用電穿孔法將制備的重組載體或mRNA導(dǎo)入豬胚胎細(xì)胞；3)獲得4-1BB表達(dá)水平上調(diào)，從而廣譜性抗病性提高的轉(zhuǎn)基因豬。本發(fā)明基于共刺激受體4-1BB的轉(zhuǎn)基因策略是動(dòng)物育種研究的一項(xiàng)新型策略。將共刺激受體4-1BB特異性地高表達(dá)于T細(xì)胞，可以增強(qiáng)T細(xì)胞在受到抗原刺激時(shí)的激活、增殖和細(xì)胞因子分泌活性，進(jìn)而增強(qiáng)宿主后天性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)疫苗免疫效果。所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)見(jiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體培育成功后，在病原感染時(shí)的免疫功能及其抗病能力也將明顯提高?；诟弑磉_(dá)4-1BB的策略，與培養(yǎng)單一抗病特性的家畜新品種相比，可以更有效地地增強(qiáng)宿主在受到多病原交叉混合感染時(shí)的抗病能力，并提高疫苗效果。


圖1是載體pMax-4-ΙΒΒΗΑ構(gòu)成模式圖，其中pCMV 巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，可調(diào)控目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子；4-1BB-HA:豬4-1BB與HA標(biāo)簽的融合蛋白的基因編碼區(qū)，HA標(biāo)簽是編碼一個(gè)HA (流感病毒血細(xì)胞凝集素抗原決定簇)短肽的一段基因序
4列，可用來(lái)檢測(cè)所融合蛋白的表達(dá)情況；SV40:是是猴空泡病毒40mRNA末端的一段多聚腺苷酸殘基，具有終止轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性的作用。圖2是豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)轉(zhuǎn)染pMax-4-ΙΒΒΗΑ質(zhì)粒后，用Western blot 方法檢測(cè)其外源蛋白表達(dá)情況。圖3是豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)轉(zhuǎn)染pMax-4-ΙΒΒΗΑ質(zhì)粒后在受到抗原 (PRRSV)刺激24h后，其T細(xì)胞激活marker⑶25分子的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高。對(duì)照未經(jīng)轉(zhuǎn)染的豬PBMC經(jīng)PRRSV感染后⑶25轉(zhuǎn)錄水平；空轉(zhuǎn)染空轉(zhuǎn)染的豬PBMC經(jīng)PRRSV感染后 ⑶25轉(zhuǎn)錄水平；4-1BB 經(jīng)pMax-4-ΙΒΒΗΑ質(zhì)粒轉(zhuǎn)然后的豬PBMC經(jīng)PRRSV感染后⑶25轉(zhuǎn)錄水平)。圖4是豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)轉(zhuǎn)染pMax-4-ΙΒΒΗΑ質(zhì)粒后在受到抗原 (PRRSV)刺激24h后，其PBMC細(xì)胞內(nèi)IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平明顯提高。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例14-1ΒΒ基因的克隆本發(fā)明以人和豬基因序列比對(duì)結(jié)果具有較高相似性為理論基礎(chǔ)，根據(jù)人的4-1ΒΒ 序列設(shè)計(jì)引物，以五指山豬的cDNA為模板調(diào)取豬的4-1BB疑似序列。具體操作步驟為(1)通過(guò)與人類的4-1BB基因序列進(jìn)行比對(duì)，在豬的基因組中找到相似性較高的基因片段，并據(jù)此設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1 :P1和P2)。(2)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) cDNA的提取從豬的前腔靜脈無(wú)菌采取20ml肝素鈉抗凝血，經(jīng)PBS等體積稀釋、混勻后，將其緩慢加于等體積的豬淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?，中?guó))上，水平轉(zhuǎn)子離心1800rpm，20min。之后吸取血漿下的淋巴細(xì)胞層，獲得PBMC。利用hvitrogen公司的Trizol試劑(TRIzol LSReagent)提取PBMC的總RNA，再用ABI公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(First Strand Synthesis Kit for RT-PCR)合成豬的 cDNA。(3)以豬的cDNA為模板，利用NEB公司的phusion高保真聚合酶試劑盒擴(kuò)增其 4-1BB的疑似序列。擴(kuò)增反應(yīng)體系雙蒸水，34.5μ 1 ;5 X HF buffer, 10 μ 1 ； IOmM dNTPmix, 1 μ 1 ； 25 μ M Ρ1，1μ 1 ;25μΜ Ρ2，1μ 1 ；phusion 聚合酶，0· 5 μ 1 ；cDNA,2y 1。反應(yīng)程序預(yù)變性98°C，Imin ；循環(huán)(35個(gè)):98 V，IOs ；55°C，20s ；72°C，Imin ；補(bǔ)充延伸72°C，IOmin0擴(kuò)增所得產(chǎn)物連接到商品化克隆載體(pEASY-Blimt Simple)上，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，豬4-1BB的核苷酸編碼框有兩種，一個(gè)長(zhǎng)768bp (變體1)，另一個(gè)長(zhǎng)726bp (變體2、。兩者同源性高達(dá)94. 5%，與變體1相比，變體2在靠近3’ 端缺少連續(xù)的42個(gè)核苷酸。變體1的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，變體2的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。(4)根據(jù)步驟(3)所測(cè)得的序列信息設(shè)計(jì)5’ RACE和3’ RACE所需引物(表1 5，GSPl 和 5，GSP2 ；3，GSPl 和 3，GSP2)，利用 TAKARA 公司的試劑盒(5，-Full RACE Kit和3，F(xiàn)ull RACE Core Set Ver. 2. 0)，獲取其5，和3，末端的轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(UTR)序列信息。變體1的cDNA全長(zhǎng)序列如SEQ ID No. 1所示，變體1的cDNA全長(zhǎng)序列如SEQ IDNo. 2 所示。將攜帶變體1的克隆載體命名為PEASY-4-1BB-1，攜帶變體2的克隆載體命名為 PEASY-4-1BB-2。 表1豬4-1BB基因克隆所用的引物
權(quán)利要求
1.豬4-1BB受體分子，其為1)由SEQID NO. 3或4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQID NO. 3或4所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述的豬4-1BB受體的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO. 1或2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述的豬4-1BB受體在提高豬廣譜抗病性中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，以權(quán)利要求1所述的豬4-1BB受體分子為免疫原，制備4-1BB的單克隆抗體，再制備成制劑后進(jìn)行給藥，提高豬的廣譜抗病能力。
8.權(quán)利要求2或3所述的基因在培育廣譜抗病性豬中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟1)將豬4-1BB受體基因克隆到真核表達(dá)載體上，或通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得豬4-1BB 受體基因mRNA ；2)利用電穿孔法將制備的重組載體或mRNA導(dǎo)入豬胚胎細(xì)胞；3)獲得4-1BB表達(dá)水平上調(diào)，從而廣譜性抗病性提高的轉(zhuǎn)基因豬。
全文摘要
本發(fā)明提供豬4-1BB受體分子，其為1)由SEQ ID NO.3或4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID NO.3或4所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼其的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或2所示。本發(fā)明提供的共刺激受體4-1BB特異性地高表達(dá)于豬的外周血T細(xì)胞，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞在受到抗原刺激時(shí)的激活、增殖和細(xì)胞因子分泌活性，進(jìn)而增強(qiáng)宿主后天性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)疫苗免疫效果。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102558342SQ201110445260
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者劉賢勇, 索勛, 蘇華荔, 趙新新, 黃驍舾 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)