專利名稱：L-半胱氨酸酶法轉化制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法。
背景技術：
L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人體的非必需氨基酸之一，其所帶的巰基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于醫(yī)藥領域、化妝品工業(yè)、食品領域和飼料添加劑領域等，具有非常廣泛的應用。根據(jù)目前文獻報導L-半胱氨酸的制備方法主要有提取法、化學合成法、發(fā)酵法和酶轉化法。1、提取法目前國內生產(chǎn)L-半胱氨酸主要以人或動物毛發(fā)為原料，先經(jīng)酸水解提取L-胱氨酸，再經(jīng)過電解還原制得L-半胱氨酸。該方法大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)受到原料來源的限制，產(chǎn)物中易混入其它氨基酸，分離難度大，環(huán)保成本高。也有廠家在生產(chǎn)L-半胱氨酸的相關產(chǎn)品中回收L-胱氨酸，曾慶群等(CN 101104599A,2008)對N-乙酰-L-半胱氨酸生產(chǎn)過程中排放的廢液進行氧化處理，分離回收了 L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生產(chǎn)成本。但是，近年來隨著人們環(huán)保意識的增強或宗教信仰等原因，一些西方國家禁用由動物毛發(fā)為原料制得的L-半胱氨酸，因此尋求新的制備L-半胱氨酸的方法勢在必行。2、化學合成法化學合成法是利用氯代烷類化合物經(jīng)過氧化反應、加成反應、還原反應、取代反應，最后得到DL-半胱氨酸?；瘜W合成法不僅步驟較多，而且得到的產(chǎn)物通常為外消旋體， 需經(jīng)拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。馬云峰(CN 1876628A, 2006)以DL-半胱氨酸為原料，以無機酸為溶劑，以D- 二苯甲酰酒石酸或L- 二苯甲酰酒石酸為拆分劑，將外消旋半胱氨酸與拆分劑按一定摩爾比溶于稀的無機酸溶液中，保溫攪拌、冷卻結晶，分別制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。3、發(fā)酵法目前發(fā)酵法生產(chǎn)L-半胱氨酸正處于實驗室探索階段，其主要問題是微生物體內的L-半胱氨酸合成過程復雜，且?guī)€基來源難以解決。張建國(CN 101831397A，2010)利用基因改造的大腸桿菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化鈉、硫代硫酸鈉等成分的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生了 L-半胱氨酸， 基因改造前的大腸桿菌BL21 (DE3)L-半胱氨酸產(chǎn)量幾乎為0，而基因改造后的BL21 (DE3) L-半胱氨酸產(chǎn)量達到lg/L。托馬斯·邁爾(CN 1262646C，2006)采用半胱氨酸代謝去調節(jié)、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等成分的培養(yǎng)基中補料分批發(fā)酵，流加葡萄糖及硫代硫酸鹽，發(fā)酵4 后發(fā)酵液中L-半胱氨酸含量達到22. 6g/L。Takagi Hiroshi (EP1234874, 2002)以棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過基因改造提高胞內絲氨酸乙酰轉移酶活性，同時降低半胱氨酸脫巰基酶活性，在含葡萄糖、硫酸銨等成分的產(chǎn)半胱氨酸培養(yǎng)基中發(fā)酵，積累了 L-半胱氨酸和L-胱氨酸。4、酶轉化法自 1979 年 Sano K.等(Applied and Environmental Microbiology, 34 (6) 806-810,1977)發(fā)現(xiàn)嗜硫氮雜環(huán)戊烯假單胞菌轉化DL-2-氨基-Δ 2-噻唑啉-4-羧酸 (DL-ATC)為L-半胱氨酸以來，酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸已成為近年來人們關注和研究的方向。 酶法轉化因具有專一性強、反應條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點而日益受到重視。日本具有用DL-ATC為原料酶法制備L-半胱氨酸較為成熟的生產(chǎn)工藝，國內學者也做了相關研究。王普(CN 100467587C,2009)以假單胞菌ζjwp_14濕菌體或粗酶液為酶源，以DL-ATC為底物，于20 52°C酶促轉化1 9h，得到含L-半胱氨酸的反應液，經(jīng)分離提取制得L-半胱氨酸。陳寧(CN 101348809A,2009)以惡臭假單胞菌(I^seudomonas putida) TS-1138為供試菌種，以全細胞為酶源酶法轉化DL-ATC合成了 L-半胱氨酸。以DL-ATC為底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化學合成DL-ATC，且酶轉化過程中需要多步酶促反應，整體催化效率不高。焦慶才等(BioresourceTechnology, 102 :3554-3557,2011)以 L-絲氨酸和吲哚為底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pETj8a-trpBA/BL21)酶法合成了 L-色氨酸。 但據(jù)文獻報道色氨酸合成酶不僅能夠催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸，還能催化L-絲氨酸和硫氫化鈉反應生成L-半胱氨酸。Ken-ichi Ishiwata等(Journal of Fermentation and Bioengineering, 67 (3) 169-172，1989)以L-絲氨酸和硫氫化鈉為底物，色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸，在最佳條件下反應液中L-半胱氨酸達到114g/L，轉化率是以L-絲氨酸和吲哚為底物酶法合成L-色氨酸的47%。日本專利(JP62215396-A，1987 ； JP63007790-A, 1988)報道了以 L-絲氨酸為底物， 以硫化氫或硫氫化物或硫化物為巰基供體，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。日本專利 (JP62019098-A, 1987)以DL-絲氨酸和硫化物為底物，用色氨酸合成酶將L-絲氨酸轉化生成L-半胱氨酸或L-胱氨酸，同時分離制備了 D-絲氨酸。以上色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的報道均以L-絲氨酸純品為底物，目前 L-絲氨酸和L-半胱氨酸的生產(chǎn)成本大體相當，故以L-絲氨酸純品酶法合成L-半胱氨酸無現(xiàn)實意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、低成本的制備L-半胱氨酸的方法。本發(fā)明以氨基酸工業(yè)中富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液代替L-絲氨酸純品，以色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。本發(fā)明可以通過以下技術方案來達到L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法，其步驟為(1)色氨酸合成酶基因工程菌DM206 (pET-28a-trpBA/BL21)，在含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生色氨酸合成酶；(2)將含有色氨酸合成酶的濕菌體或粗酶液與含L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入適量磷酸吡哆醛、表面活性劑、硫氫化鈉或硫化鈉或硫氫化銨或硫化銨或硫化氫，在25 55°C，pH 6 11條件下進行酶促反應；將反應生成的L-半胱氨酸氧化后分離得到L-胱氨酸，再經(jīng)過電解還原制得L-半胱氨酸。上述步驟(1)中的培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和/或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質量濃度為1 20g/L ；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨和/或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質量濃度為1 30g/L ；加入IPTG或乳糖誘導，IPTG終濃度為0. 05
0.15g/L，乳糖終濃度為5 15g/L。上述步驟O)中含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為角蛋白水解液或蠶絲水解液或酶法合成L-絲氨酸的反應液，混合氨基酸料液中總氨基酸含量(w/w)為10% 50%，其中 L-絲氨酸在總氨基酸中含量(w/w)為10% 95%。上述步驟( 的轉化液中加入適量的表面活性劑吐溫-80或十六烷三甲基溴化銨 (CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其濃度為0. 005g/L 5. Og/L。目前，我國L-半胱氨酸生產(chǎn)主要來源于毛發(fā)水解提取法，該方法工藝成熟，但大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)受到原料來源的限制，短時間內難以擴大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)保壓力大。而另一方面我國在氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中，會產(chǎn)生大量不能直接用于食品和醫(yī)藥方面的富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液，該混合氨基酸料液直接分離制備L-絲氨酸成本高、效率低。本發(fā)明以富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為原料，以色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明采用的色氨酸合成酶基因工程菌DM206，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高效表達色氨酸合成酶，使酶法合成L-半胱氨酸有較高的催化速率和轉化率，其中L-絲氨酸摩爾轉化率達到80 %以上。(2)本發(fā)明采用含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為反應原料，充分利用了工業(yè)副產(chǎn)物，解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸高效分離的難題，同時也為大規(guī)模生產(chǎn)L-半胱氨酸提供了更為豐富的原料，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。(3) L-半胱氨酸氧化后得到L-胱氨酸，L-胱氨酸和混合氨基酸料液中的其它氨基酸理化性質有較大差異，用等電點結晶法即可實現(xiàn)分離。(4)酶法合成L-半胱氨酸具有反應條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，成本低，工藝流程簡單等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例一1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體18g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含38g/L L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量15% )、13g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 005g/L 0P，pH 8. 5，37 °C酶促反應21h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為36g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為82.2%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH
1.0，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/LNa0H調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸通空氣氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得16. 8g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色， 中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得15. 6gL-胱氨酸精品，比旋光[α^= -223° (c = 2，lmol/L 鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。
實施例二1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體19g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含46g/L L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量10% )、15g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和5g/L吐溫-80，pH 9. 0，35 °C酶促反應^h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為45g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為84. 9 %。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 1. 0，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/LNa0H調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸通空氣氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得21g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得19. 6g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-224° (c = 2, lmol/L 鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例三1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體18g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含25g/L L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量25%)、8g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐溫-80，pH 9. 0，25 °C酶促反應15h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為23. 8g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為82.6%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 1. 0，加熱去除&S，活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/L NaOH調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸滴加雙氧水氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得10. 5g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得9. SgL-胱氨酸精品，比旋光[^g= - 224° (c = 2， lmol/L鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例四1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體19g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含70g/L L-絲氨酸的蠶絲酸水解液(氨基酸總含量35% )、32g Na2S、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0.05g/L CTAB，pH 9. 0，40°C酶促反應40h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為68. 8g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為85.3%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 0. 5，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/LNa0H調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸滴加雙氧水氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得32. 5g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得31g L-胱氨酸精品，比旋光[ag=-221° (c = 2， lmol/L鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例五1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體18g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含84g/L L-絲氨酸的蠶絲酸水解液(氨基酸總含量30%)、^g NH4HS、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L CTAB, pH 7. 0，37°C酶促反應40h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為81. 6g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為84. 3%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 0. 5，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/LNa0H調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸滴加雙氧水氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得38. 2g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得37g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-220° (c = 2，lmol/L鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例六1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體17g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含44g/L L-絲氨酸的蠶絲酸水解液(氨基酸總含量20% )、20g (NH4) 2S、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐溫80，pH 6. 0，55 °C酶促反應30h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為41. 2g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為81. 3%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 0. 5，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/L NaOH調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸通空氣氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得18. 8g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色， 中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得17g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-221° (c = 2, lmol/L 鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例七1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體19g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含105g/L酶法合成L-絲氨酸的反應液(氨基酸總含量11% )、47g Na2S、0. 2g/L 磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐溫-80，pH 11，37 °C酶促反應45h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為102g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為84. 3%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 0. 5，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/L NaOH調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸通空氣氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得49. 6g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色， 中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得48g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-222° (c = 2, lmol/L 鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例八1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的色氨酸合成酶濕菌體19g加入到500mL轉化液中， 轉化液中含120g/L酶法合成L-絲氨酸的反應液(氨基酸總含量50% )、39g NaHS,0. 2g/ L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐溫-80，pH 8，37 °C酶促反應45h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為118g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為85.3%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 0. 5，加熱去除H2S,活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/L NaOH調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸通空氣氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得57. 6g L-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色， 中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得56g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-224° (c = 2, lmol/L 鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。實施例九1.將IOOOmL發(fā)酵液離心得到的19g色氨酸合成酶濕菌體超聲波破碎制成20ml粗酶液，加入到500mL轉化液中，轉化液中含200g/L酶法合成L-絲氨酸的反應液(氨基酸總含量30%)和0. 2g/L磷酸吡哆醛，通入H2S氣體并用氨水調pH 9. 0，37°C酶促反應50h，反應結束后轉化液中L-半胱氨酸濃度為193g/L，對L-絲氨酸摩爾轉化率為83. 7%。2.將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，上清液用6mol/L鹽酸調pH 0. 5，加熱去除&S，活性碳脫色，抽濾，濾液用5mol/L NaOH調pH 5. 0，將濾液中的L-半胱氨酸通空氣氧化，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得95gL-胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結晶，真空抽濾，洗滌，烘干得93. 4g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-222° (c = 2, lmol/ L鹽酸)，L-胱氨酸精品經(jīng)電解還原制得L-半胱氨酸。
權利要求
1.一種L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法，其特征是由以下步驟構成(1)具有色氨酸合成酶活性的基因工程菌DM206，在含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生色氨酸合成酶；(2)將含有色氨酸合成酶的濕菌體或粗酶液與含L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入適量的磷酸吡哆醛、表面活性劑、硫氫化鈉或硫化鈉或硫氫化銨或硫化銨或硫化氫，在 25 55°C，pH 6 11條件下進行酶促反應，將反應生成的L-半胱氨酸通空氣或滴加雙氧水氧化后分離得到L-胱氨酸，再經(jīng)過電解還原制得L-半胱氨酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的L-半胱氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的含L-絲氨酸的混合氨基酸料液來源于角蛋白水解液或蠶絲水解液或酶法合成L-絲氨酸的反應液，混合氨基酸料液中總氨基酸含量(w/w)為10% 50%，其中L-絲氨酸在總氨基酸中含量(w/w)為10% 95%。
3.根據(jù)權利要求1所述的L-半胱氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度為0. 005 g/L 5. 0 g/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法。該制備方法采用含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液為原料，將具有L-色氨酸合成酶活性的濕菌體或粗酶液與含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，添加適量硫氫化物或硫化物，25～55℃，pH6～11條件下進行酶促反應，將反應生成的L-半胱氨酸通空氣或滴加雙氧水氧化，等電點結晶法分離得到L-胱氨酸，再經(jīng)過電解還原制得L-半胱氨酸。該方法解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸的分離及綜合利用難題，得到了附加值較高的L-半胱氨酸產(chǎn)品，具有原料來源廣、價格低廉，操作簡便，酶促轉化時間短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12P13/12GK102517352SQ201110446250
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權日2011年12月28日
發(fā)明者劉均忠, 劉茜, 曾慶群, 焦慶才, 王先兵, 肖國安 申請人:南京大學, 湖北新生源生物工程股份有限公司