專利名稱：一種具有腫瘤細胞殺傷作用的cik細胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從人外周血或臍帶血中分離單個核細胞(PBMC)，并且通過17-20天的時間以最為簡單的方法獲得具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞。
背景技術(shù)：
腫瘤一直以來幾乎是死亡的代名詞。雖然醫(yī)學(xué)以及生物學(xué)界圍繞著腫瘤的發(fā)生、機理以及治療等方面進行了大量的工作，但是目前為止最為主要的治療方式還是放化療。但是對于患者而言放化療無異于飲鴆止渴，患者不僅需要付出高額的治療費用并且還要忍受副作用所帶來的巨大痛苦，而更為可悲的是這一痛苦的過程只不過是延緩死亡而已。因此，相關(guān)專家學(xué)者越來越清楚地認識到攻克腫瘤應(yīng)該尋找另一條路線。細胞治療并不是近幾年才受到關(guān)注的，從早期的NK細胞、樹突狀細胞直到現(xiàn)在的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(Cytokine-1nduced Killer,CIK)以及多種細胞的聯(lián)合應(yīng)用細胞治療已經(jīng)發(fā)展成為一個非常有希望的手段并越來越受到重視。其中，CIK細胞由于其增殖能力強、細胞毒作用強、兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點，并且對腫瘤細胞的識別能力很強，如同“細胞導(dǎo)彈”，能精確“點射”腫瘤細胞，但不會傷及“無辜”的正常細胞。尤其對手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細胞擴散和復(fù)發(fā)，提高機體免疫力，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。CIK細胞的特點:1、增殖能力強，主要效用細胞⑶3+⑶56+可增殖1000倍；2、殺傷活力強，遠優(yōu)于傳統(tǒng)的LAK細胞和細胞因子Y干擾素、白細胞介素2等；3、殺瘤譜廣，不受MHC限制，具有廣譜殺腫瘤和病毒的作用，對多重耐藥腫瘤細胞仍敏感，殺瘤活性不受環(huán)孢素A(CsA)和FK506等免疫抑制劑的影響，能抵抗腫瘤細胞引發(fā)的效應(yīng)細胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小,無嚴重不良反應(yīng)。CIK細胞治療技術(shù)的優(yōu)勢:1、可有清除手術(shù)、放化療后殘余的癌細胞及微小病灶，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；2、可與放、化療聯(lián)合使用，能降低放化療的毒副作用的感染率，提高放化療的療效；3、可用于放、化療無效的患者，或?qū)熕幬锂a(chǎn)生耐藥性的患者的治療；4、對于失去手術(shù)機會或已復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長生存期；大部分患者出現(xiàn)瘤體減小甚至消失或長期帶瘤生存的治療效果；5、由于CIK細 胞具有免疫調(diào)節(jié)和體細胞修復(fù)作用，在治療腫瘤的同時，大部分患者尤其是放化療后的患者，可出現(xiàn)消化道癥狀減輕或消失，皮膚有光澤，黑斑淡化，靜脈曲張消失，脫發(fā)停止甚至頭發(fā)生長或白發(fā)變黑等“年輕化”表現(xiàn)，及精神狀態(tài)或體力明顯恢復(fù)等現(xiàn)象，從而提聞腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長生存期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一套簡單、高效、可重復(fù)性好的具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，利用密度為1.084的Ficoll單核細胞分離液于PBS系統(tǒng)中分離外周血或臍帶血單個核細胞，并且通過17-20天的誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得CIK細胞。Ficoll、外周血或臍帶血、PBS混合體積比為1:1:1。單個核細胞分離離心參數(shù)為:離心力250g，離心時間40分鐘。所述具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，包括以下步驟:(1)臨床獲取外周血或臍帶血，利用密度為1.084的Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞；(2) DO天利用初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；D1天加入抗⑶3抗體，IL_2 ;以后每三天補加基礎(chǔ)培養(yǎng)基、自體血清和IL-2 ;第19天獲得足量CIK細胞；(3)對獲得CIK細胞進行表面標志物檢測和殺傷活力檢測。按體積比濃度計，所述初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基為淋巴細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基98 %、自體血清濃度為1%、雙抗1%、IFN-Y濃度為2000u/ml ;CIK維持培養(yǎng)基為淋巴細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基98%、自體血清濃度為I %、雙抗1%、IL-2濃度為1000u/ml。所述雙抗為青霉素和鏈霉素。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用ficoll密度梯度離心法高效分離獲得單個核細胞、并利用細胞培養(yǎng)袋和CIK細胞培養(yǎng)系統(tǒng)獲得足量的CIK，可以滿足臨床治療的需求。本方法單個核細胞分離效果優(yōu)于其他方法；操作簡便易行；采用Takara淋巴細胞培養(yǎng)基，和自體血清、細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)，避免了胎牛血清的應(yīng)用，減少外源致熱源、致敏原污染幾率，同時保持了 CIK細胞高效擴增的優(yōu)點；利用細胞培養(yǎng)袋技術(shù)、減少細胞污染幾率，適合臨床治療應(yīng)用。


圖1 CIK細胞總量擴增曲線；圖2誘導(dǎo)CIK細胞流式檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:1.使用Ficoll單核細胞分離液從45ml新鮮外周血中分離得到6*107左右的PBMC:1)在醫(yī)院診所等具有資質(zhì)的醫(yī)療機構(gòu)采集新鮮的外周血50ml，利用枸櫞酸鈉或者肝素等為抗凝劑，采用靜脈穿刺的方式將外周血采集到采血袋當中，2)冷鏈運輸，在4°C環(huán)境下保存外周血，并運輸?shù)綄嶒炇遥M行單個核細胞分離，外周血可以保存24小時，不影響單個核細胞采集。
3)新鮮血液樣品和磷酸緩沖液(PBS)全部溫浴至20°C后按照1:1的比例混合均勻。4)取3支新的50ml離心管，每個離心管中加入溫浴至20°C的Ficoll單核細胞分離液15ml (密度為1.084)。5)使用一次性移液管將30ml混合均勻的血液稀釋液輕輕加到Ficoll單核細胞分離液的上層并確保兩層液體分層明顯。6)輕輕將配平的離心管放入離心機中，250g離心40min。7)輕輕取出離心管，以新移液管首先吸出上層血清至一個新的離心管中備用然后吸取單個核細胞白膜層以及白膜層上下各5ml的液體至另一個新的離心管中。8)在單個核細胞的離心管中加入30ml PBS,混合均勻后250g離心5min。9)移液管吸棄上清再次加入30ml PBS,混合均勻后250g離心5min。10)重復(fù)7)的操作11)移液管吸棄上清，加入5ml CIK細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基充分混勻細胞計數(shù)并計
算活率。12)保留5*107個細胞用于CIK細胞誘導(dǎo)。13)將自體血清分成3支0.5ml、I支1.5ml、I支5ml、2支20ml凍存在20°C條件下備用

2.CIK細胞的誘導(dǎo):(以下百分比濃度均為體積比濃度)I)將分離獲得的PBMC按照l*106/ml、共50ml接種到T-175細胞培養(yǎng)瓶中，并且添加1%自體血清、I %的雙抗以及終濃度2000u/ml的IFN-Y在CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)。2) 24h后在培養(yǎng)基中添加終濃度1000u/ml的IL-2和100ng/ml抗CD3的單抗繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，并將本日定為誘導(dǎo)Dl。3) D4時對細胞進行細胞計數(shù)以及活率，按照50ml培養(yǎng)基補加I %自體血清、I %的雙抗以及終濃度1000u/ml的IL-2持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。4)D7時對細胞進行細胞計數(shù)以及活率，補加50ml新鮮培養(yǎng)基并且按照IOOml培養(yǎng)基補加1%自體血清、1%的雙抗(青霉素和鏈霉素，Gibco, W10479)以及終濃度1000u/ml的IL-2混合均勻后平均分到2個T-175中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。5)D10時對細胞進行細胞計數(shù)以及活率，將全部細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，補力口350ml新鮮培養(yǎng)基并且按照450ml培養(yǎng)基補加I %自體血清、I %的雙抗以及終濃度IOOOu/ml的IL-2混合均勻繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。6)D13時對細胞進行細胞計數(shù)以及活率，補加1350ml新鮮培養(yǎng)基并且按照1800ml培養(yǎng)基補加I %自體血清、I %的雙抗以及終濃度1000u/ml的IL-2混合均勻繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。7)D16時對細胞進行細胞計數(shù)以及活率，按照1800ml培養(yǎng)基補加1%自體血清、I %的雙抗以及終濃度1000u/ml的IL-2混合均勻繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。8)D19時250g離心回收所有細胞進行細胞計數(shù)以及活率9)通過流式細胞儀檢測⑶3+⑶56+細胞比例10)以Hela細胞作為靶細胞進行細胞殺傷實驗以確定誘導(dǎo)的CIK細胞的殺傷效果實施例1:
PBMC 的分離:I) 50ml新鮮血液樣品(外周血或臍帶血)和磷酸緩沖液(PBS)全部溫浴至20°C后按照1:1的比例混合均勻。2)取3支新的50ml離心管，每個離心管中加入15ml溫浴至2(TC的Ficoll單核細胞分離液(密度為1.084)。3)使用一次性移液管將30ml混合均勻的血液稀釋液輕輕加到Ficoll單核細胞分離液的上層并確保兩層液體分層明顯。4)輕輕將配平的離心管放入離心機中，250g離心40min。5)輕輕取出離心管，以新移液管首先吸出上層血清至一個新的離心管中備用然后吸取單個核細胞白膜層以及白膜層上下各5ml的液體至另一個新的離心管中。6)在單個核細胞的離心管中加入30ml PBS,混合均勻后250g離心5min。7)移液管吸棄上清再次加入30ml PBS,混合均勻后250g離心5min。8)重復(fù)7)的操作9)移液管吸棄上清，加入5ml CIK細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基充分混勻細胞計數(shù)并計算活率。10)最終獲得16.2*107個細胞活率99%以上，保留5*107個細胞用于誘導(dǎo)。將自體血清按照3支0.5ml、I支1.5ml、I支5ml、2支20ml凍存在20°C條件下備用。

CIK細胞誘導(dǎo):I)將5*107個細胞懸浮于49mlCIK誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(TAKARA公司GT-T551培養(yǎng)基)中并加入到一個T-175細胞培養(yǎng)瓶中，加入0.5ml自體血清、0.5ml雙抗、0.1ml IFN-y母液(1000000u/ml)混合均勻后放入CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)。2) 24h 后在培養(yǎng)基中添加 0.25ml IL-2 母液(200000u/ml)和 0.005ml 抗 CD3 的單抗母液(lmg/lml)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，并將本日定為誘導(dǎo)Dl。3) D4時對細胞進行細胞計數(shù)結(jié)果為4.84*10'活率99%以上，補加0.5ml自體血清(使用低溫保存的血清)、0.5ml雙抗、0.25ml IL-2母液繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。4)D7時對細胞進行細胞計數(shù)結(jié)果為6.85*107、活率99%以上，補加50ml新鮮培養(yǎng)基以及Iml自體血清(使用低溫保存的血清)、lml雙抗、0.5ml IL-2母液混合均勻后平均分到2個T-175細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。5)DlO時對細胞進行細胞計數(shù)結(jié)果為18.5*107、活率99%以上，將所有細胞加入到細胞培養(yǎng)袋(TAKARA公司GT-T610 (A)細胞培養(yǎng)袋)中，再加入400ml新鮮培養(yǎng)基并補加5ml自體血清(使用低溫保存的血清)、5ml雙抗、2.5ml IL-2母液混合均勻后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。6)D13時對細胞進行細胞計數(shù)結(jié)果為118.5*107、活率99%以上，補加1350ml新鮮培養(yǎng)基并補加18ml自體血清(使用低溫保存的血清)、18ml雙抗、9ml IL-2母液混合均勻
后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。7)D16時對細胞進行細胞結(jié)果為422.5*10'活率99%以上，并補加18ml自體血清(使用低溫保存的血清)、18ml雙抗、9ml IL-2母液混合均勻后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。8)D19時250g離心回收所有細胞進行細胞計數(shù)結(jié)果共獲得552.5*107個細胞、活率99%以上。
9)通過流式細胞儀檢測⑶3+⑶56+細胞比例，結(jié)果顯示⑶3+⑶56+細胞比例為28.4% (圖 2)10)以Hela細胞作為靶細胞按照CIK細胞:靶細胞比例20: I進行細胞殺傷實驗，殺傷5h后殺傷效率達到72%。結(jié)果顯示本方法誘導(dǎo)出的CIK細胞具有很好的殺傷效率。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，其特征在于，利用密度為1.084的Ficoll單核細胞分離液于PBS系統(tǒng)中分離外周血或臍帶血單個核細胞，并且通過17-20天的誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得CIK細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，其特征在于，F(xiàn)icoll、外周血或臍帶血、PBS混合體積比為1:1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CIK細胞的制備方法，其特征在于，單個核細胞分離離心參數(shù)為:離心力250g，離心時間40分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)臨床獲取外周血或臍帶血，利用密度為1.084的Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞； (2)DO天利用初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；D1天加入抗CD3抗體，IL-2 ；以后每三天補加基礎(chǔ)培養(yǎng)基、自體血清和IL-2 ;第19天獲得足量CIK細胞； (3)對獲得CIK細胞進行表面標志物檢測和殺傷活力檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，其特征在于，按體積比濃度計，所述初 始誘導(dǎo)培養(yǎng)基為淋巴細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基98 %、自體血清濃度為I %、雙抗1%、IFN-Y濃度為2000u/ml ;CIK維持培養(yǎng)基為淋巴細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基98%、自體血清濃度為I %、雙抗1%、IL-2濃度為1000u/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述雙抗為青霉素和鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有腫瘤細胞殺傷作用的CIK細胞的制備方法，利用密度為1.084的Ficoll單核細胞分離液于PBS系統(tǒng)中分離外周血或臍帶血單個核細胞，并且通過17-20天的誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得CIK細胞。本發(fā)明利用ficoll密度梯度離心法高效分離獲得單個核細胞、并利用細胞培養(yǎng)袋和CIK細胞培養(yǎng)系統(tǒng)獲得足量的CIK，可以滿足臨床治療的需求。本方法采用Takara淋巴細胞培養(yǎng)基，和自體血清、細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)，避免了胎牛血清的應(yīng)用，減少外源致熱源、致敏原污染幾率，同時保持了CIK細胞高效擴增的優(yōu)點；利用細胞培養(yǎng)袋技術(shù)、減少細胞污染幾率，適合臨床治療應(yīng)用。
文檔編號C12N5/078GK103184192SQ20111044664
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者陳曉波, 韓洪起, 韓俊領(lǐng), 黃家學(xué), 武文杰, 侯士芳, 張宇光 申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司