專利名稱：分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高低密度法分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，細(xì)胞替代治療可以治療帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神經(jīng)退行性疾病以及腦卒中、腦外傷等引起的神經(jīng)功能缺失，神經(jīng)干細(xì)胞作為基因治療的載體，可以治療帕金森氏病、粘多糖病和顱內(nèi)腫瘤等。但是， 神經(jīng)干細(xì)胞的研究目前尚處于初期階段，有許多問題還沒有得到解決，如神經(jīng)干細(xì)胞如何在體內(nèi)和體外定向分化為我們需要的某種特定的神經(jīng)細(xì)胞，體外分離得到的神經(jīng)干細(xì)胞與體內(nèi)的是否有差異等等，這些都需要進(jìn)一步的研究。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究是近十年來神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一，近年來不斷有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人胚腦和其它哺乳類動(dòng)物一樣存在具有自我更新和廣泛分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，如何快速有效地分離培養(yǎng)出人胚神經(jīng)干細(xì)胞并長(zhǎng)期傳代擴(kuò)增是進(jìn)一步研究神經(jīng)干細(xì)胞的前提條件。由于胚齡越大，神經(jīng)干細(xì)胞越難分離培養(yǎng)，以往學(xué)者[1，2]常用小胚齡胚胎(7 9周)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，而大胚齡胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)的研究則較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明應(yīng)用高、低密度培養(yǎng)法從13周齡人胚胎大腦皮層中分離和培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，并用免疫熒光法予以鑒定。具體的，本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的方法步驟包括Sl 原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)取13周水囊引產(chǎn)的新無菌條件下分離出大腦皮層組織，剝除腦分成小塊后在PBS液中漂洗三次洗去血細(xì)胞，用細(xì)吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含 B27(l 50) (GibcoBRL)和 EGF(Serotec) 20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ml 的 DMEM/ F12(l D(GibcoBRL)無血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO7/ ml，將原代細(xì)胞短暫貼壁2次去除成纖維細(xì)胞，分別種植于未包被的25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細(xì)胞懸液/瓶)，37°C，5% C02條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)方法分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞法，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法7天后首次換液時(shí)重新計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以1 X 105/ml密度分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。我們采用的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法與通常貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法有所不同，每次換液時(shí)吸取上懸液離心后加新鮮培養(yǎng)基種入新的培養(yǎng)瓶，原瓶中僅保留貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。S2 神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用嚴(yán)格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于350 500 μ m)切成數(shù)塊，小克隆球(小于100 μ m)不作處理繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)克隆球生長(zhǎng)情況7 10天傳代一次，方法同前。
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S3.單細(xì)胞定點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察克隆形成在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法中挑選散在的出現(xiàn)明顯增大具有強(qiáng)折光性的細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號(hào)筆分別標(biāo)記，動(dòng)態(tài)定點(diǎn)觀察并照相記錄。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時(shí)，用自制玻璃微管(內(nèi)徑約250 500 μ m) 逐個(gè)吸出克隆球進(jìn)行分化試驗(yàn)。S4.誘導(dǎo)分化培養(yǎng)將以上獲得的來自單細(xì)胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清終止后分別種植于直徑315cm預(yù)先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用有血清培養(yǎng)基DM EM/ F12+5% Fcs進(jìn)行分化培養(yǎng)。S5.免疫熒光法檢測(cè)將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時(shí)后行免疫熒光檢測(cè)。經(jīng)分化培養(yǎng)后的細(xì)胞分別于2、7和14天行免疫熒光檢測(cè)。每個(gè)培養(yǎng)皿用油性記號(hào)筆畫五個(gè)圈，分別用抗Nestin Ig G、抗N SEIg G、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白對(duì)照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。神經(jīng)干細(xì)胞傳代時(shí)， 培養(yǎng)基中加入Brdu (5 μ mol/L)，連續(xù)傳代兩次后種入包被的小培養(yǎng)皿，貼壁培養(yǎng)12小時(shí)后行免疫熒光檢測(cè)。本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法，可以快速形成克隆球，克隆球開始形成時(shí)間比維持低密度培養(yǎng)明顯提前，并且生長(zhǎng)迅速。而一旦進(jìn)入有絲分裂期形成克隆球，則必須及時(shí)降低密度， 以避免高密度的抑制作用。


通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的方法步驟流程圖；圖2所示為本發(fā)明的分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的步驟流程圖。
具體實(shí)施例方式主要實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公(Olympus CK40)，熒光顯微鏡 (Olympus B)(51)，CO2培養(yǎng)箱(REVCO)，75cm2培直徑培養(yǎng)皿(Corning，NY)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)液的配制DMEM/F12B27 (Gibco)、EGF(Serotec)和 bFGF (Chemicon International)、 胎牛血清(Gibco)。有血 DM EM/F12(1 1)+5 % Fcs，無血清培 DMEM/F12 (1 1)+5 % Fcs+EGF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)。免疫熒光抗體一抗為抗 Nestin Ig G(BD 抗神經(jīng)元特異性抗原(NSE)Ig G(An2tibody Diagnostica Inc)、抗膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原(GFAP) Ig G (Bio Genx)、抗少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗(CN P) Ig G (Chemicon)、Brdu 和 Anti Brdu (Sig ^ 光二抗(Sigma)。所述高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的方法包括如下步驟Si:原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)(如圖2所示的步驟)取13周水囊引產(chǎn)的新無菌條件下分離出大腦皮層組織，剝除腦分成小塊后在PBS液中漂洗三次洗去血細(xì)胞，用細(xì)吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含 B27(l 50) (GibcoBRL)和 EGF(Serotec) 20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 XlO7Ail，將原代細(xì)胞短暫貼壁2次去除成纖維細(xì)胞，分別種植于未包被的25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細(xì)胞懸液/瓶)，37°C，5%C02條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)方法分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞法，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法7天后首次換液時(shí)重新計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以1 X 105/ml密度分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。我們采用的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法與通常貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法有所不同，每次換液時(shí)吸取上懸液離心后加新鮮培養(yǎng)基種入新的培養(yǎng)瓶，原瓶中僅保留貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。S2 神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用嚴(yán)格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于350 500 μ m)切成數(shù)塊，小克隆球(小于100 μ m)不作處理繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)克隆球生長(zhǎng)情況7 10天傳代一次，方法同前。S3.單細(xì)胞定點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察克隆形成在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法中挑選散在的出現(xiàn)明顯增大具有強(qiáng)折光性的細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號(hào)筆分別標(biāo)記，動(dòng)態(tài)定點(diǎn)觀察并照相記錄。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時(shí)，用自制玻璃微管(內(nèi)徑約250 500 μ m) 逐個(gè)吸出克隆球進(jìn)行分化試驗(yàn)。S4.誘導(dǎo)分化培養(yǎng)將以上獲得的來自單細(xì)胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清終止后分別種植于直徑3. 5cm預(yù)先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用有血清培養(yǎng)基DM EM/ F12+5% Fcs進(jìn)行分化培養(yǎng)。S5.免疫熒光法檢測(cè)將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時(shí)后行免疫熒光檢測(cè)。經(jīng)分化培養(yǎng)后的細(xì)胞分別于2、7和14天行免疫熒光檢測(cè)。每個(gè)培養(yǎng)皿用油性記號(hào)筆畫五個(gè)圈，分別用抗Nestin Ig G、抗N SEIg G、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白對(duì)照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。神經(jīng)干細(xì)胞傳代時(shí)， 培養(yǎng)基中加入Brdu (5 μ mol/L)，連續(xù)傳代兩次后種入包被的小培養(yǎng)皿，貼壁培養(yǎng)12小時(shí)后行免疫熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如下一、原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果1.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法原代細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀，1周時(shí)團(tuán)塊中可形成少量小克隆球， 首次換液后可見克隆球增多并逐漸長(zhǎng)大，有少量小克隆球可以從細(xì)胞團(tuán)塊中游出，2周時(shí)已經(jīng)有大克隆球(大于200 μ m)形成，單克隆球周圍仍吸附有許多其它細(xì)胞，一般經(jīng)過三次傳代后可以得到純的克隆球。2.貼壁細(xì)胞法首次換液后，發(fā)現(xiàn)每高倍視野(倒置顯微鏡X 100倍)下大約有 200個(gè)細(xì)胞貼壁，其中處于有絲分裂期的極強(qiáng)折光性大細(xì)胞平均大約有5個(gè)，少數(shù)散在的貼壁細(xì)胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象；培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)又有新的極強(qiáng)折光性大細(xì)胞形成，數(shù)量增多至每高倍視野下大約有20個(gè)，其中大量未分裂的原代細(xì)胞和出現(xiàn)分化的細(xì)胞開始死亡并脫落；培養(yǎng)3周后，未分裂的原代細(xì)胞基本已經(jīng)脫落干凈，此時(shí)已經(jīng)有極強(qiáng)折光性大細(xì)胞開始形成緊密小克隆球(大約5 20個(gè)細(xì)胞組成，直徑約40 60 μ m)，培養(yǎng)4周后，已有大量大小不等的克隆球形成)，許多大克隆球(直徑約200 350 μ m)已脫壁懸浮生長(zhǎng)，克隆球周圍無其它細(xì)胞吸附。二、神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)結(jié)果
在傳代培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)克隆球相當(dāng)緊密，吸管機(jī)械吹打不能將克隆球分散，用胰酶消化雖能制成單細(xì)胞懸液，但有大量細(xì)胞死亡或出現(xiàn)分化，傳代比較困難。用機(jī)械法將大克隆球分割成數(shù)塊，小克隆球繼續(xù)培養(yǎng)，可以長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。三、單細(xì)胞克隆結(jié)果極強(qiáng)折光性細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記后定點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察，能清楚地觀察從單個(gè)細(xì)胞逐漸分裂增殖形成克隆球，無其它細(xì)胞吸附聚集現(xiàn)象，克隆球用微管吸出分離后活力仍很旺盛。四、誘導(dǎo)分化結(jié)果在DMEM/F12+5%FcS有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12小時(shí)后即可見部分細(xì)胞貼壁并有短小突起伸出，2天后可見大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，突起不斷增粗和伸長(zhǎng)，1周后分化成形態(tài)不一的、分散成片的多突起星狀細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞，突起互相交織成網(wǎng)狀，2周后有部分細(xì)胞出現(xiàn)逐漸衰退和死亡。五、免疫熒光檢測(cè)結(jié)果貼壁的克隆球呈Nestin抗原陽(yáng)性，同時(shí)NSE、GFAP和CNP免疫熒光染色均呈陰性。 分化細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)到NSE、GFAP和CNP陽(yáng)性細(xì)胞，Nestin免疫熒光染色在7天時(shí)可見部分陽(yáng)性細(xì)胞，2周后幾乎未找到Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。Brdu標(biāo)記表明克隆的大部分細(xì)胞為Brdu陽(yáng)性細(xì)胞。由于人們對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)還不夠全面和深入，目前神經(jīng)干細(xì)胞尚無準(zhǔn)確的定義，一般認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞終身具有自我更新能力和多分化潛能，能通過對(duì)稱和不對(duì)稱分裂進(jìn)行增殖，損傷或疾病能刺激干細(xì)胞分化。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)中分離純化的干細(xì)胞能夠不斷分裂增殖，并通過定點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察，可以完整地記錄從單個(gè)細(xì)胞分裂增殖形成克隆球的經(jīng)過，應(yīng)用Brdu標(biāo)記可以進(jìn)一步說明神經(jīng)干細(xì)胞的分裂增殖能力；來自單個(gè)細(xì)胞的克隆球進(jìn)行誘導(dǎo)分化后同時(shí)行神經(jīng)元特異性抗原(NSE)、膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原(GFAP)和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原(CNP)免疫熒光檢測(cè)，均有陽(yáng)性表達(dá)，其中GFA P陽(yáng)性細(xì)胞最多，說明具有多分化潛能；目前人們將神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的一種中間絲蛋白-神經(jīng)巢蛋白(Nestin)作為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性生物學(xué)標(biāo)記，我們分離出的神經(jīng)干細(xì)胞檢測(cè)均呈Nestin陽(yáng)性表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)分化過程中，表達(dá)逐漸減少和消失。本發(fā)明中，我們應(yīng)用先高密度(lX107ml)后降低密度(lX105/ml)的原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法，1周后即可以形成克隆球，克隆球開始形成時(shí)間比維持1X IO5Ail密度培養(yǎng)O周時(shí)開始形成克隆球)明顯提前，并且生長(zhǎng)迅速?？赡苁求w外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞要進(jìn)入有絲分裂期需要有其它細(xì)胞的相互作用，一旦進(jìn)入有絲分裂期形成克隆球，則必須及時(shí)降低密度，以避免高密度的抑制作用。由于克隆球周圍吸附其它細(xì)胞，所以必須經(jīng)過幾次傳代后才能純化。神經(jīng)干細(xì)胞具有一定的貼壁能力，在形成克隆球并長(zhǎng)大至200 μ m前，能夠一直保持貼壁狀態(tài)，這有利于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法在不改變細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境狀態(tài)下動(dòng)態(tài)觀察從單個(gè)干細(xì)胞分裂增殖形成克隆球的全過程。原代細(xì)胞應(yīng)用開始高密度(lX107ml)而后密度逐漸遞減的貼壁培養(yǎng)法開始形成克隆球的時(shí)間較晚，可能與神經(jīng)干細(xì)胞密度依賴性有關(guān)，一旦開始形成克隆球，生長(zhǎng)速度明顯加快，大約4周時(shí)即可以得到大量克隆球。首次培養(yǎng)時(shí)使用高密度，神經(jīng)干細(xì)胞和其它細(xì)胞一樣有較多數(shù)量貼壁，每次換液去除懸浮起的活力下降或死亡的細(xì)胞，細(xì)胞密度逐漸下降，大約3周時(shí)，貼壁細(xì)胞密度大約在IX (IO3 IO5)/ml左右， 神經(jīng)干細(xì)胞仍能較好地分裂增殖并形成克隆球。貼壁培養(yǎng)法可以準(zhǔn)確地觀察從單細(xì)胞至克
6隆球的全過程，得到的克隆球周圍無其它細(xì)胞的吸附，無需傳代純化，結(jié)合在培養(yǎng)瓶底面標(biāo)記和微管吸取技術(shù)，可以得到來自單細(xì)胞的克隆球。 本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的方法，其包括如下步驟取大胚齡水囊引產(chǎn)的新無菌條件下分離出大腦皮層組織，剝除腦分成小塊后在PBS液中漂洗三次洗去血細(xì)胞，用細(xì)吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液；使用200目尼龍濾網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X IOVml ；以及將原代細(xì)胞短暫貼壁2次去除成纖維細(xì)胞，分別種植于未包被的培養(yǎng)瓶，37°C，5% CO2 條件下靜置培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的方法，其中所述培養(yǎng)方法包括懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞法。
3.如權(quán)利要求2所述的分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的方法，其中所述懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法是在高細(xì)胞密度培養(yǎng)7天后首次換液時(shí)重新計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以1 X 105/ml密度分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求2所述的分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的方法，其中所述貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法在每次換液時(shí)吸取上懸液離心后加新鮮培養(yǎng)基種入新的培養(yǎng)瓶，原瓶中僅保留貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提出一種分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的方法，其應(yīng)用于大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)過程，所述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程的步驟包括原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng)；神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；單細(xì)胞定點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察克隆形成；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)；以及免疫熒光法檢測(cè)。本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細(xì)胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法，可以快速形成克隆球，克隆球開始形成時(shí)間比維持低密度培養(yǎng)明顯提前，并且生長(zhǎng)迅速。而一旦進(jìn)入有絲分裂期形成克隆球，則必須及時(shí)降低密度，以避免高密度的抑制作用。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK102443569SQ201110447680
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者吳衛(wèi)江 申請(qǐng)人:吳衛(wèi)江