專利名稱：骨髓間充質(zhì)干細胞分化誘導過程中的細胞免疫熒光染色方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種骨髓間充質(zhì)干細胞分化誘導過程中的細胞免疫熒光染色方法，其應用于骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導過程。
背景技術：
雖然骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植治療缺血性腦損傷固然已取得了一定的進展，但BMSCs移植后神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化率在體外可高達80%，在體內(nèi)僅為3% 10%，而且在體內(nèi)環(huán)境下分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的比率較大而分化為神經(jīng)元樣細胞的比率較小，這無疑會給神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復帶來不利因素。如果能將骨髓基質(zhì)細胞在體外分化為神經(jīng)元樣細胞， 再行細胞移植會有事半功倍的效果。中胚層來源的BMSCs向外胚層來源的神經(jīng)元分化的研究正處于起步階段。全反式維甲酸是維生素A的衍生物，能夠明顯增加神經(jīng)細胞的數(shù)量并呈劑量依賴效應，能調(diào)節(jié)EGF 反應的神經(jīng)干細胞分化，增加神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞的合成。將其與神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞因子聯(lián)合用于誘導胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞方向分化，同體內(nèi)發(fā)育過程相似，且可以部分模擬體內(nèi)環(huán)境，因此日益受到重視。但是，這些研究多停留在誘導后BMSC具有神經(jīng)元形態(tài)特征和表達神經(jīng)細胞標記物水平上，而缺乏具有神經(jīng)細胞生理學特性的證據(jù)，因此許多學者認為這類細胞被稱為“神經(jīng)元樣細胞”更為妥當。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種骨髓間充質(zhì)干細胞分化誘導過程中的細胞免疫熒光染色方法，其應用于骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導過程，所述誘導過程應用全反式維甲酸(ATRA)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子 (EGF)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化為神經(jīng)元樣細胞，不僅具有了神經(jīng)細胞的典型形態(tài)，并表達神經(jīng)元標志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE), 星型膠質(zhì)細胞標志抗原膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein, GFAP)； 提示BMSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力，可使跨胚層分化為神經(jīng)元樣細胞，有望成為神經(jīng)細胞替代治療的種子細胞。具體的，本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導方法包括如下步驟Si.分離培養(yǎng)細胞所有操作均在無菌條件下進行，骨髓來源于髖關節(jié)手術時的松質(zhì)骨碎片或下肢骨開放性手術時收集。肝素抗凝收集的骨髓懸液，D-Hanks液稀釋(V V，1 1)，緩慢加在一半體積的Ficoll分離液上，600g離心15min，收集界面層細胞，D-Hanks液洗1遍，調(diào)整細胞濃度為1 X 105/ml,接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為 DMEM-LG+1% Penici 11 in-Streptomycin+10% FBS,37°C>5% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)。細胞密度達到70%融合后用0. 25%的胰蛋白酶消化，1瓶分2瓶的比例傳代培養(yǎng)。S2. BMSCs的形態(tài)學觀察在倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態(tài)特征，并攝片記錄。S3.流式細胞儀檢測抗原表達培養(yǎng)細胞代)用0. 25%的胰蛋白酶消化后， 含1 %小牛血清白蛋白PBS調(diào)整細胞至5 X 106/ml。取50ul細胞懸液，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD;M-FITC、CD45-PE、CD29-FITC, CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、，置 4°C 孵30分鐘，PBS洗2次，進行流式細胞儀分析。S4.誘導分化實驗取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60%時， 換成誘導培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+lymol/L ATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)。37°C、5% CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)。S5.細胞免疫熒光染色培養(yǎng)細胞在誘導分化3天后采用免疫熒光染色。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導方法的步驟流程示意圖。
具體實施例方式如圖1所示為本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導方法的步驟流程示意圖，所述實施例的方法包括如下步驟Si.分離培養(yǎng)細胞所有操作均在無菌條件下進行，骨髓來源于髖關節(jié)手術時的松質(zhì)骨碎片或下肢骨開放性手術時收集。肝素抗凝收集的骨髓懸液，D-Hanks液稀釋(V V，1 1)，緩慢加在一半體積的Ficoll分離液上，600g離心15min，收集界面層細胞，D-Hanks液洗1遍，調(diào)整細胞濃度為1 X 105/ml,接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為 DMEM-LG+1% Penici 11 in-Streptomycin+10% FBS,37°C>5% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)。細胞密度達到70%融合后用0. 25%的胰蛋白酶消化，1瓶分2瓶的比例傳代培養(yǎng)。S2. BMSCs的形態(tài)學觀察在倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態(tài)特征，并攝片記錄。S3.流式細胞儀檢測抗原表達培養(yǎng)細胞代)用0. 25%的胰蛋白酶消化后， 含1 %小牛血清白蛋白PBS調(diào)整細胞至5 X 106/ml。取50ul細胞懸液，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD;M-FITC、CD45-PE、CD29-FITC, CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、，置 4°C 孵30分鐘，PBS洗2次，進行流式細胞儀分析。S4.誘導分化實驗取2-3代培養(yǎng)細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60%時， 換成誘導培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+lymol/L ATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)。37°C、5% CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)。S5.細胞免疫熒光染色培養(yǎng)細胞在誘導分化3天后采用免疫熒光染色。貼壁細胞去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，經(jīng)4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3次，0. 3% TritonX-IOO 處理20min，PBS漂洗3次，10 %羊血清室溫封閉20min，吸出血清，分別加入兔抗人NSE(1 500) ,GFAPd 1000)，37°C孵育 2h，然后 PBS 洗 3 次，加入羊抗鼠-FITC (1 500) 孵30min。顯色后在熒光顯微鏡下觀察。實驗結果及分析1. BMSCs的原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)4h后可見細胞貼壁，開始貼壁細胞呈單個分散， 多為長梭狀。3d后開始增殖，形態(tài)多樣，一為梭形，帶有2 3個較長的突起，細胞核圓形或橢圓形，有1 3個核仁；另有一種為寬闊扁平形或羽毛形，形狀不規(guī)則，細胞核亦為圓形或橢圓形。其他有一些呈細小梭形、圓形等，量較少。后同形態(tài)細胞聚集并形成集落，5 7d后貼壁細胞開始融合，形成單層，其中梭形細胞排列具有一定的方向性。7 9d后可見有80%以上細胞融合，呈漩渦狀生長或成簇生長，隨著細胞密度的增加，胞體變得細長，形態(tài)類似成纖維細胞。原代細胞生長較慢，長滿瓶底需2-4周，在胎牛血清存在的條件下，傳代細胞在3-5d左右可增殖一倍。培養(yǎng)的細胞可以穩(wěn)定生長傳代，而且體外培養(yǎng)10代以后， 細胞的增殖速度無明顯減慢。2. BMSCs的表面抗原特性流式細胞儀檢測結果顯示BMSCs表達⑶29、⑶44和⑶105，不表達⑶34、⑶45和 CD106。3.誘導分化及免疫熒光染色結果加入誘導液池后細胞形態(tài)即明顯變化，光鏡下BMSCs的細胞質(zhì)向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)。3 證后多數(shù)細胞能形成神經(jīng)元樣細胞形態(tài)，胞體呈圓形，突起較長，在突起末端出現(xiàn)分支，部分相鄰細胞的突起連接成網(wǎng)，但細胞數(shù)目無明顯增加。3d后大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殡p極或多極神經(jīng)元細胞樣形態(tài)，伸出突觸(類似軸突或樹突)，部分細胞之間拉成網(wǎng)狀，染色可見NSE、GFAP陽性。本實施例的誘導方法應用全反式維甲酸(ATRA)、堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化為神經(jīng)元樣細胞，不僅具有了神經(jīng)細胞的典型形態(tài)，并表達神經(jīng)元標志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、星型膠質(zhì)細胞標志抗原膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein, GFAP)；提示BMSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力，可跨胚層分化為神經(jīng)元樣細胞，有望成為神經(jīng)細胞替代治療的種子細胞。本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1. 一種骨髓間充質(zhì)干細胞分化誘導過程中的細胞免疫熒光染色方法，其用于骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導過程，所述誘導過程包括分離培養(yǎng)細胞、BMSCs的形態(tài)學觀察、流式細胞儀檢測抗原表達、誘導分化實驗以及細胞免疫熒光染色，所述細胞免疫熒光染色方法為將培養(yǎng)細胞在誘導分化3天后采用免疫熒光染色；貼壁細胞去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，經(jīng)4 %的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3次， 0. 3% TritonX-IOO處理20min，PBS漂洗3次，10%羊血清室溫封閉20min，吸出血清，分別加入兔抗人NSE(1 500)、GFAP(1 1000)，37°C孵育2h，然后PBS洗3次，加入羊抗鼠-FITC(1 500)孵 30min ；以及顯色后在熒光顯微鏡下觀察。
全文摘要
本發(fā)明提出一種骨髓間充質(zhì)干細胞分化誘導過程中的細胞免疫熒光染色方法，其應用于骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的全反式維甲酸聯(lián)合細胞因子誘導過程，所述誘導過程應用全反式維甲酸(ATRA)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化為神經(jīng)元樣細胞，不僅具有了神經(jīng)細胞的典型形態(tài)，并表達神經(jīng)元標志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶、星型膠質(zhì)細胞標志抗原膠質(zhì)纖維酸性蛋白；提示BMSCs仍然保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞的能力，可使跨胚層分化為神經(jīng)元樣細胞，有望成為神經(jīng)細胞替代治療的種子細胞。
文檔編號C12Q1/02GK102533646SQ201110448140
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權日2011年12月27日
發(fā)明者陸華 申請人:陸華