專利名稱：一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Mll)菌株及其應用，特別適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶，屬于生物技術領域。
背景技術：
利用廉價生物質資源生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品是生物技術的重要研究內容。木聚糖是自然界中的一種豐富的可再生資源，是最具代表性的半纖維素成分，占半纖維素的1/3-1/2， 是除纖維素外自然界中最豐富的多糖。因此，如何利用木聚糖成為目前國內外研究的熱點。木聚糖是由D-木糖主鏈(以β _1，4鍵相連)和L-阿拉伯糖分枝(α-1，2和 α -1，3相連)所組成的聚合物,與木質素和纖維素以4-0-methyl-D-glucuronic acid鍵相連，形成了交聯(lián)復雜的結構，為降解半纖維素帶來困難。目前，工業(yè)降解木聚糖常用的方法有酸法、堿法和酶法，其中酸法、堿法應用較為廣泛，但酸堿水解液中含有較多的有毒物質， 對于后期微生物發(fā)酵有抑制作用；另外，采用酸法或堿法降解木聚糖，生產(chǎn)環(huán)保壓力很大， 因此受到國家的限制，故從長期生產(chǎn)效果來看，酶法降解木聚糖將是未來木聚糖降解的主要的方式。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最關鍵的水解酶。木聚糖被降解時，起主要作用的酶是β-1,4-內切木聚糖酶和β-D-木糖苷酶。β-1，4-內切木聚糖酶以內切方式作用于木聚糖主鏈內部的β_1，4木糖苷鍵，其主要水解產(chǎn)物為低聚木糖、木寡糖、木二糖等； β -D-木糖苷酶通過水解低聚木糖、木寡糖等的非還原性末端來催化釋放木糖殘基。木聚糖酶在飼料工業(yè)、食品工業(yè)、造紙工業(yè)、能源工業(yè)等眾多領域具有巨大的應用價值和廣闊的應用前景。例如，在紙漿漂白的初始階段，向紙漿中加入木聚糖酶可以增加紙漿的光亮度和水解度，從而減少了在后期漂白中氯化物的用量，降低了對環(huán)境的污染；在面包烘烤過程中，向面團中加入木聚糖酶，可縮短面團的發(fā)酵時間，改善面包心的彈性和硬度，增加面包的體積和比容，有效地改善面包焙烤品質；向飼料中添加木聚糖酶可以顯著提高畜禽的生產(chǎn)性能。木聚糖酶可以破壞植物細胞壁結構，提高各種類型飼料的利用率，減少畜禽腸道疾病，增進畜禽健康，提高畜禽成活率；減少粘糞，降低空氣中氨氣和硫化物濃度， 減少環(huán)境污染，減少粘糞排出和臟蛋，使畜禽體重均勻。因此，伴隨著人類對于可持續(xù)性發(fā)展和環(huán)境的重視，木聚糖酶在工業(yè)上的應用將更加受到人們的重視。海洋放線菌主要分布在海底沉積物、海洋生物表面以及海水中。海洋環(huán)境的特殊性造就了海洋放線菌獨特的代謝方式和代謝產(chǎn)物。近年來人們不斷從各種海洋環(huán)境中尋找到能產(chǎn)生具有新型作用機制的抗生素、酶制劑(蛋白酶、淀粉酶、和纖維素酶等)、維生素 (Β12)和有機酸的放線菌。在海洋高壓、低溫、高鹽的生命極限環(huán)境中，海洋放線菌擁有獨特的代謝途徑和合成能力，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也提供了產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物的潛力。海洋微生物生產(chǎn)的酶一般具有與其生存環(huán)境相關的特性，例如，耐鹽性、耐高溫性、適冷性等，這些特性在工業(yè)極端條件下有廣闊應用前景。此外，放線菌的遺傳操作簡單，便于進行遺傳改造，與霉菌相比更具有生物安全性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Mll) 菌株及其應用，該菌株具有寡營養(yǎng)、pH、NaCl耐受性性質，可用于發(fā)酵制備耐堿耐鹽木聚糖酶；上述的耐堿耐鹽木聚糖酶所具有的獨特酶學性質，使之可廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中。本發(fā)明涉及一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Mll)菌株，分類命名為Streptomyces viridochromogenes,所述菌株的登記入冊編號為CGMCC No. 5565, 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2011年12月9日。所述海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌(以下省略Ml I)菌株可生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶，適合在造紙、飼料、食品、釀酒以及能源工業(yè)中使用。所述菌株在Bennett固體培養(yǎng)基上生長時，菌落為圓形，致密，經(jīng)過2_3天菌落表面生長出白灰色孢子，基底為墨綠色，產(chǎn)生黑色色素，生長速度較快。該菌株具有較好的寡營養(yǎng)性、pH、NaCl耐受性，在pH值為11的極端堿性條件下，菌株依然生長良好；在1%的 NaCl中生長最佳。本發(fā)明菌株可在以木聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，所產(chǎn)生的發(fā)酵液具有降解木聚糖的能力。發(fā)酵7天時發(fā)酵酶活最高，可達68. 9U/ml。所述菌株所生產(chǎn)的木聚糖酶同時具有較好的pH穩(wěn)定性、NaCl耐受性和熱穩(wěn)定性等特性。本發(fā)明篩選到的綠色產(chǎn)色鏈霉菌所生產(chǎn)的木聚糖酶，其最適PH值為6. 0，在pH5-9 的范圍內維持80%以上的酶活性；最適溫度為70°C，在45°C下處理60min，酶活性維持在 88%以上；在601下處理60min，酶活性維持在在75%以上；本發(fā)明中的木聚糖酶最適底物為山毛櫸木聚糖，無纖維素酶活性；該木聚糖酶具有很好的NaCl耐受性，當NaCl終濃度為 lmol/L時，木聚糖酶酶活維持在86. 6%;當NaCl終濃度為2M時，殘留酶活70. 4%;當NaCl 終濃度為5mol/L時，殘留酶活46. 8%。本專利所描述的具有這些特性的木聚糖酶還未見報道。所述菌株所生產(chǎn)的木聚糖酶可降解多種農(nóng)業(yè)廢棄物及廉價生物質，對菊芋秸桿的降解效果最佳。此外，對海洋來源的海帶纖維也具有較好的降解性能，表明該木聚糖酶在利用海洋大型海藻生產(chǎn)高值產(chǎn)品方面有應用價值。所述木聚糖酶在pH為9時，殘留酶活為最大酶活性的83. 3%，表現(xiàn)了較好的耐堿性，且在60°C下保持較高的酶活力，能夠滿足造紙中的生物漂白工藝，一定程度上水解紙漿中的半纖維素，使紙張成色、硬度、質量有所提高。更重要的是，代替或部分降低了氯化物的使用量，減少對環(huán)境的污染。本發(fā)明中木聚糖酶還可應用于釀酒工業(yè)，降低物料粘度，提高淀粉的利用率，增加酒精的產(chǎn)率。本發(fā)明中的木聚糖酶在能源工業(yè)中也顯示出巨大的應用潛力，該酶在45°C下可長時間維持較高酶活，與目前同步糖化工藝溫度一致，且可降解農(nóng)業(yè)廢棄物中的半纖維素為單糖，供下游工藝發(fā)酵利用，產(chǎn)生清潔可再生能源。本發(fā)明的有益效果是該菌株分離自大連海泥樣品中，2011年12月9日保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為5565。該菌株在pH值為11的極端堿性環(huán)境下正常生長，并表現(xiàn)了良好的耐受寡營養(yǎng)的特性，能降解多種含半纖維素的生物質，包括玉米秸桿、 稻草、菊芋秸桿、海帶纖維等，在利用廉價生物質資源生產(chǎn)生物基化學品方面具有廣闊的應用前景。該菌株在最適條件下生產(chǎn)木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可達68. 9U/ml。生產(chǎn)的木聚糖酶具有以下性質最適pH值6. O,最適溫度70°C,最適底物為山毛櫸木聚糖,所產(chǎn)木聚糖酶無纖維素酶活性，具有良好的PH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，且可耐受高濃度NaCl。做為一種海洋來源的酶制劑，可廣泛用于造紙、食品、飼料、釀酒、能源等工業(yè)。


圖I是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌寡營養(yǎng)耐受性。a.對照；b.稀釋2倍；c.稀釋3倍； d.稀釋5倍。圖2是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌pH耐受性。a. pH = 5 ；b. pH = 7 ；c. pH = 9 ；d. pH = 11。圖3是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌NaCl耐受性。a.對照；b. I % NaCl ；c. 2% NaCl ；d. 3% NaCl。圖4是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶結果。圖5是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌木聚糖酶最適溫度結果。圖6是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌木聚糖酶熱穩(wěn)定性結果。圖7是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌木聚糖酶最適pH結果。圖8是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌木聚糖酶pH穩(wěn)定性結果。圖9是海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌木聚糖酶NaCl耐受性結果。
具體實施例方式實驗材料和試劑I.菌株海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌由本發(fā)明人2006年從大連小平島海泥樣品中分離獲得。2.生化試劑木聚糖山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖(美國SIGMA公司);海帶纖維購自陜西慈緣生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Solarbio公司)；測序由大連寶生物工程有限公司完成；TaKaRa rTaq大連寶生物工程有限公司；IOxPCR Buffer大連寶生物工程有限公司；dNTP Mixture大連寶生物工程有限公司。提取菌株基因組DNA試劑洗滌液50mmol/LTris, 25mmol/L EDTA，0. 1% PVP, pH 為 8. 0。裂解液50mmol/LTris, 25mmol/L EDTA, I. 2% PVP,3% SDS。抽取液10mmol/LTris, lmmol/L EDTA, 0. 3mmol/L NaAC, pH 為 8.0。提取液苯酚氯仿異戊醇=25 : 24 : I。TE 緩沖液50mmol/L Tris, pH 為 8. O。DNS試劑配方甲液溶解6. 9g結晶酚于15. 2mL 10%的NaOH中，用蒸餾水稀釋至69mL再加入6. 9g NaHSO3 ；乙液稱取255g酒石酸鉀鈉，加入至300mL的10% NaOH中，再向其中加入 880mLl % 3,5- 二硝基水楊酸溶液；將甲乙兩液相混即得到黃色DNS試劑，貯存于棕色試劑瓶中。在常溫下，放置7-10 天后使用，半年內有效。3.培養(yǎng)基Bennett固體培養(yǎng)基葡萄糖IOg,蛋白胨2g,酵母粉lg，牛肉膏l(xiāng)g，瓊脂20g, ρΗ7· O。木聚糖固體培養(yǎng)基山毛櫸木聚糖10g, NH4NO3 4g，K2HPO4 · 3H20 lg, MgSO4 · 7H20 O. 5g, NaCl 0. 3g,瓊脂 20g, pH6. 5-7. 0。富集培養(yǎng)基(NH4)2SO45g, KH2PO4 lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. OlgjCaCl2 0. 2g，山毛櫸木聚糖IOg, pH 7. 0。TSB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3. 0g，葡萄糖2. 5g,K2HPO4 ·3Η20 2. 5g， NaCl 5g, pH 7. 0。木聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基=K2HPO4· 3H20 I. llg, KH2PO4 3. 65g，(NH4)2NO3 3g， MgSO4 ·7Η20 2. 2g, CaCl2 0. 3g，葡萄糖I. 5g，蛋白胨2. 5g，牛肉膏3g，山毛櫸木聚糖10g，pH 6. 5o說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。實施例I :菌株的獲得將來源于大連小平島海泥樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后，按常規(guī)稀釋后涂布于木聚糖平板上，30°C培養(yǎng)5-6天，挑取產(chǎn)生透明圈菌落在木聚糖固體培養(yǎng)基上劃線分離，重復劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法篩選到該分泌木聚糖酶的菌株。本發(fā)明菌株在Bennett平板上30°C下培養(yǎng)7天，菌落呈圓形，直徑約為3-4cm，基底為墨綠色，菌落表面突起，產(chǎn)生白灰色孢子，釋放大量黑色色素。其最適PH為7. 0-9. 0，最適溫度為30°C。實施例2 :提取海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌基因組DNA，以及其16SrDNA的獲得提取海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌基因組DNA:I)將菌株接種于50mL的TSB液體培養(yǎng)基中，在30°C下轉速170rpm培養(yǎng)72小時， 此時正處于對數(shù)生長期。收集發(fā)酵液lmL，8000r/min離心5min后棄上清液，洗滌液清洗菌
體，離心后重復一次清洗。2)向洗滌后的菌體中，加入100 μ L裂解液懸浮菌體，100°C煮沸15min后冷卻至室溫。3)加入65°C預熱好的抽提液O. 5ml，輕微震蕩。4)加等體積Tris飽和酹/氯仿溶液,強烈震蕩lmin, 10000r/min離心5min,小心
吸取上清液，轉移至干凈的離心管。5)向上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕倒轉混合兩次，_20°C靜置2小時。6) 12000r/min 離心 5min, 70% 的乙醇洗漆一次，10000r/min 離心 5min,開口揮發(fā)至無醇味，干燥后溶于20 μ LTE緩沖液中，制得總DNA。16SrDNA序列的獲得16SrDNA PCR 引物如下Pl :5，一 ATTCGGCACACAGAAAC 一 3 ‘P2 :5，一 AGAGGAGAACCGIAGAC 一 3 ‘PCR反應條件如表I所示表IPCR反應條件
權利要求
1.一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌菌株(Streptomyces viridochromogenes),其特征在于所述菌株的登記入冊編號為CGMCC No. 5565,保藏于中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2011年12月9日。
2.根據(jù)權利要求I所述的一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌菌株的應用，其特征在于所述海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌菌株應用于工業(yè)生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶。
全文摘要
一株生產(chǎn)耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產(chǎn)色鏈霉菌菌株及其應用，屬于生物技術領域。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為5565。該菌株在pH11的極端堿性環(huán)境下正常生長，并表現(xiàn)了良好的耐受寡營養(yǎng)的特性，能降解多種含半纖維素的生物質，包括玉米秸稈、稻草、菊芋秸稈、海帶纖維等，在利用廉價生物質資源生產(chǎn)生物基化學品方面具有廣闊的應用前景。該菌株在最適條件下生產(chǎn)木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可達68.9U/ml。生產(chǎn)的木聚糖酶具有以下性質最適pH值6.0，最適溫度70℃，最適底物為山毛櫸木聚糖，所產(chǎn)的木聚糖酶無纖維素酶活性，具有良好的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，且可耐受高濃度NaCl。作為一種海洋來源的酶制劑，可廣泛用于造紙、食品、飼料、釀酒、能源等工業(yè)。
文檔編號C12N1/20GK102586134SQ201110448168
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權日2011年12月28日
發(fā)明者劉卓, 白鳳武, 趙心清 申請人:大連理工大學