專利名稱：一種用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用基因的單核苷酸多態(tài)性來評定豬背膘厚度大小，并用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代數(shù)量遺傳學(xué)的原理和方法在豬育種實踐中的應(yīng)用取得了巨大成功，如今它對一些遺傳力高且呈連續(xù)性正態(tài)分布的數(shù)量性狀仍然是必不可少的選擇方法。但對于低遺傳力性狀，如母豬的產(chǎn)仔數(shù)等，選擇反應(yīng)并不理想。另外大多數(shù)重要經(jīng)濟性狀需要等到成年后才能鑒定，這無疑增大了世代間隔，降低了年遺傳改進量。因此，動物遺傳育種學(xué)家從分子 遺傳水平上找到性狀的遺傳差異或與數(shù)量性狀連鎖的遺傳標(biāo)記，從而實現(xiàn)真正的基因型選擇。分子遺傳學(xué)及測定技術(shù)的飛速發(fā)展，對家畜基因組分析的深入研究起了有力的推動作用。通過基因組分析可以從核酸水平認(rèn)識遺傳物質(zhì)，鑒定基因型并確定控制表型性狀的基因或與該基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上可對家畜直接進行基因型選擇或標(biāo)記輔助選擇(marker assisted selection, MAS),且不受性別、時間和環(huán)境等因素的影響,從而加快遺傳進展。在當(dāng)今的豬肉市場，瘦肉產(chǎn)量仍然是決定豬胴體商業(yè)價值最重要的因素。世界養(yǎng)豬發(fā)達國家的分級標(biāo)準(zhǔn)也是根據(jù)胴體瘦肉率的不同將豬胴體劃分為不同的等級。在實際工作中，瘦肉率是難以直接測量的，必須屠宰之后才能測，但作為種豬來說，屠宰之后就沒有可利用的價值了。因此，人們一直試圖尋找一種簡便的活體評定瘦肉率的方法，以減少屠宰帶來的經(jīng)濟損失。幸運的是，遺傳相關(guān)分析結(jié)果表明，背膘厚與胴體瘦肉率存在極強的負(fù)相關(guān)(rA = -O. 7 -O. 86)，且活體背膘厚有較高的遺傳力(h2 = O. 4 O. 6)(彭中鎮(zhèn)等《豬的遺傳改良》，北京，農(nóng)業(yè)出版社，1991)。這一研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為通過背膘厚來選育提高豬的瘦肉率成為可能。目前已研究的與豬的脂肪沉積或是與背膘厚相關(guān)的基因有類胰島素生長因子2 (Insulin like growth factor 11, IGF」' )，黑素皮質(zhì)激素受體4(Melanocortin-4receptor,MC4R),瘦素基因(Leptin,LEP)等。盡管影響豬脂肪沉積性能的侯選基因的研究取得了一些重要進展，但豬的重要經(jīng)濟性狀通常是數(shù)量性狀，涉及到的生理生化過程相當(dāng)復(fù)雜，即使同一個數(shù)量性狀，盡管已揭示其1-2個受控基因，因此其它具有較大效應(yīng)的新基因或QTL仍有待發(fā)現(xiàn)。可卡因-安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄妝(Cocaine-andAmphetamine RegulatedTranscript,CART)是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)肽(Michael，1999)。人的CART基因定位于5ql32，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。cDNA的核苷酸同源性為92%，編碼區(qū)同源性更高達95%。這顯示CART基因在哺乳動物里是很保守的(Douglass等，1996)。CART肽主要分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)如下丘腦、垂體和腎上腺等(Koylu等，1997 ;傅茂等，2002)。CART的生理功能厭食動物的CARTmRNA在下丘腦的弓狀核內(nèi)表達量較高。而肥胖動物由于L印tin信號傳遞受阻，在下丘腦的弓狀核內(nèi)CARTmRNA幾乎無表達。當(dāng)給小鼠腦內(nèi)注射重組的CART可抑制正常和饑餓狀態(tài)下的攝食，說明CART在動物體內(nèi)可能是一個內(nèi)源性攝食抑制劑，可通過下丘腦-垂體-腎上腺軸抑制采食，調(diào)節(jié)體脂含量(Lambert等，1998 ；Boguslawa等，2006 Judit等，2007)。Elias等(1998)認(rèn)為Leptin激活這些神經(jīng)通路有助于產(chǎn)熱、消耗能量、減少體脂含量。另外在瘦素缺乏和瘦素受體缺乏的小鼠下丘腦弓狀核中，CART的mRNA水平明顯降低。瘦素缺乏的小鼠，給予瘦素后下丘腦CART的mRNA水平明顯增加，說明CART參與攝食及體內(nèi)體脂含量的調(diào)節(jié)(Menyhert等,2007)。Wierup等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，CART基因敲除小鼠的胰島素分泌減少，在采食量沒有變化的情況下，40周齡小鼠的體脂含量顯著增加。認(rèn)為CART可通過調(diào)控動物體內(nèi)胰島素的分泌來調(diào)控采食行為，減少體脂。CART的SNP與肥胖的關(guān)系
國內(nèi)外學(xué)者對CART基因的SNP與肥胖的關(guān)系做了大量的研究。但各種研究的結(jié)果差異較大。Guerardel等(2005)分析CART基因5 ^上游的3. 7kb區(qū)域，篩查得到31個SNP，發(fā)現(xiàn)SNP-3608T > C與高加索人的肥胖有極顯著相關(guān)。Del Giudice等(2001)在研究一個遺傳肥胖的意大利家族時發(fā)現(xiàn)，CART前體蛋白的一個Leu34Phe突變可引起兒童早期肥胖，但后期正常。Yanik等(2006)在此基礎(chǔ)上，做了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)在肥胖家族中CART前體蛋白的Leu34Phe突變，導(dǎo)致體內(nèi)活性CART肽的顯著降低。提示人類肥胖發(fā)生可能是由于Leu34Phe突變，導(dǎo)致活性CART肽的缺失引起。但也有研究持相反觀點。Echwald等(1999)篩選到CART3' UTR的多態(tài)，發(fā)現(xiàn)這種多態(tài)性與丹麥高加索人的肥胖不相關(guān)。Challis等(2000)篩查英國白人的CART因的全部編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)CART因A1475G位的變異和Ser66Thr的變異與肥胖無關(guān)。傅茂等(2002)用PCR-SSCP法也得到CART基因1457位堿基A的缺失與中國人肥胖的發(fā)生無顯著關(guān)聯(lián)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用基因的單核苷酸多態(tài)性來評定豬背膘厚度大小，并用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法。發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的發(fā)明提供了一種評價豬個體間背膘厚度大小的方法，是利用CART基因單核苷酸多態(tài)性來預(yù)測脂肪在豬背膘中沉積性能的方法。本發(fā)明檢測的是NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中序列登錄號為EF581838的序列(SEQ IDNO : I) 5'端第650位核苷酸或SEQ ID NO :2的5'端第95位核苷酸C還是T，屬于包嘧啶到胸腺嘧啶的堿基置換，以確定豬個體在此位點的基因型，然后通過基因型確定脂肪在背膘中的沉積性能。如果NCBI數(shù)據(jù)庫中序列登錄號為EF581838的序列5'端第650位核苷酸及SEQ ID N0:2的5'端第95位核苷酸為C時，其純合體的基因型為CC ;SEQ ID N01的5'端第650位核苷酸及SEQ ID NO :2的5'端第95位核苷酸為T時，其純合體的基因型為TT ;它們的雜合體基因型為CT。所述方法中，所述檢測NCBI數(shù)據(jù)庫中序列登錄號為EF581838的序列5'端第650位核苷酸或SEQ ID N0:2的5'端第95位核苷酸為C還是T的方法包括先PCR擴增含有序列表中序列2的5'端第95位核苷酸的基因組片段，然后對擴增產(chǎn)物進行測序或者用TaqI酶切擴增產(chǎn)物。通過測定SEQ ID N0:1的5'端第650位核苷酸，以及SEQ ID N0:2的5'端第95位核苷酸，確定豬的基因型，來評價豬個體間背膘厚度大小。當(dāng)SEQ ID NO : I的5'端第650位核苷酸及SEQ ID NO :2的5'端第95位核苷酸為C時，基因型為CC，判斷豬的背膘厚度較小，瘦肉率較高。當(dāng)SEQ ID NO : I的5'端第650位核苷酸及SEQ ID NO :2的5'端第95位核苷酸為T時，基因型為TT，判斷豬的背膘厚度較大，瘦肉率較低。當(dāng)SEQ ID NO : I的5'端第650位核苷酸及SEQ ID NO :2的5'端第95位核苷酸 為一個為C，一個為T時，基因型為CT，判斷豬的背膘厚度較大，瘦肉率較低。所述含有NCBI數(shù)據(jù)庫中序列登錄號為EF581838的序列5'端第650位核苷酸(C/T)的基因組片段PCR擴增產(chǎn)物可為SEQ ID NO 2的1039bp的核苷酸片段；TaqI酶切所述1039bp PCR擴增產(chǎn)物，若得到1039bp單一片段，其基因型為TT純合體；若得到1039bp，95bp及945bp三個酶切片段時，其基因型為CT雜合體；若得到95bp及945bp兩個片段時，基因型為CC純合體。在進行凝膠電泳時，120V，20分鐘以內(nèi)為宜，如果時間過長，94bp的片段會跑出膠外而消失。更具體地說，測定SEQ ID NO :1的5'端第650位核苷酸及SEQ ID NO :2的5'端第95位核苷酸，可以采用以下方法先PCR擴增含有SEQ ID N0:2的5'端第95位核苷酸的基因組片段，然后對擴增產(chǎn)物進行測序或者用TaqI酶切擴增產(chǎn)物；所述含有SEQ IDNO :1的5'端第650位核苷酸(C/T)的基因組片段PCR擴增產(chǎn)物為SEQ ID NO 2的1039bp的核苷酸片段JaqI酶切所述1039bp PCR擴增產(chǎn)物，若得到1039bp單一片段，其基因型為TT純合體；若得到1039bp，94bp及945bp三個酶切片段時，其基因型為CT雜合體；若得到94bp及945bp兩個片段時，基因型為CC純合體。通過長白-藍塘F2資源群體各基因型個體的脂肪沉積性能進行評估a. CC型個體背膘厚度相對較??；TT和CT型脂肪在背膘中沉積相對較多，且兩者背膘厚度基本無顯著差異；b.在反映脂肪沉積性能高的性狀如板油重、第6、7肋間活體背膘厚、最后肋骨處活體背膘厚、平均活體背膘厚、平均胴體背膘厚等性狀，CC型的值最低，CT值最高，TT型次之，CC型與CT或TT型都呈現(xiàn)顯著性差異，而CT與TT型之間無差異。本發(fā)明的豬可卡因-安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽及其編碼基因CART可用于檢測豬的活體背膘厚、胴體背膘厚、板油重等反映豬脂肪沉積性能的性狀。即當(dāng)以豬的基因組為模版，利用表I中相應(yīng)引物進行PCR擴增，其產(chǎn)物用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進行酶切，凝膠電泳后按照上述方法進行基因型及脂肪沉積性能斷定。從而為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標(biāo)記，并將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。


圖I為預(yù)測方法流程圖；本發(fā)明利用CART基因單核苷酸多態(tài)性來評定豬背膘厚度大小，并用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法流程圖。圖2為TaqI-RFLP三種基因型(CC，CT, TT)的電泳結(jié)果；本發(fā)明中PCR擴增產(chǎn)物的TaqI-RFLP的三種基因型(CC，CT,TT)電泳結(jié)果。M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000plus(200-2000bp ladder)注，由于跑膠時間過長，94bp的片段已跑出膠外。
具體實施例方式下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。本發(fā)明利用單核苷酸多態(tài)性來評定豬背膘厚度大小，并用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法流程圖如圖I所示，PCR擴增反應(yīng)體系、PCR擴增反應(yīng)程序、酶切反應(yīng)體系分別如表I、表2、表3所不。具體方法如下述實施例所述。實施例I用于評定豬背膘厚度大小的SNP所在DNA序列的獲得及多態(tài)性分析
用于該單核苷酸多態(tài)性檢測的DNA樣品來自豬的基因組，可通過采集豬的唾液或毛囊然后參照常規(guī)方法提取其基因組DNA后于_20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)序列表中序列I設(shè)計引物PCAL/PCAR，它們分別位于該基因的第2顯示子(Exon 2)和第三外顯子(Exon 3)區(qū)，其引物序列如下SEQ ID NO 3 PCAL :5，-GATTGAAGCGCTGCAGGAAGTC-3’SEQ ID NO 4 PCAR :5’ -CAGGAGGAAGGAATTGCAGGAG—3’該引物擴增片段長度1039bp，位于豬CART基因的第2內(nèi)含子上，即SEQ ID NO 1中自序列的5’端第556-1594bp處的核苷酸片段，也即SEQ ID NO :2。序列分析結(jié)果表明在這1039bp的DNA片段中，在SEQ ID NO 2的自5’端第95位(SEQ ID NO 1的第650位核苷酸)存在C-T的突變。當(dāng)SEQ ID NO :2的5’端第95位核苷酸為C時，該基因假定為由C等位基因控制，當(dāng)SEQ ID NO 2的5’端第95位核苷酸為T時，該基因假定為由T等位基因控制，這兩個等位基因可組成三種基因型純合體CC、TT，雜合體CT。即SEQ ID NO :2的5’端第95位核苷酸為C時，存在I個TaqI酶切位點(T I CGA)，因此將上述擴增片段用TaqI酶切鑒定其基因型。當(dāng)基因型為TT時，擴增片段經(jīng)TaqI酶切后只有1039bp —個片段；當(dāng)基因型為CC時，擴增片段經(jīng)TaqI酶切后為94bp、945bp兩個片段；當(dāng)基因型為CT時，擴增片段經(jīng)TaqI酶切后為1039bp、94bp、945bp bp三個片段；三種基因型的酶切鑒定凝膠電泳圖如圖2所示。圖2中M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(200-2000bp ladder)。PCR擴增反應(yīng)體系、反應(yīng)程序以及酶切體系如表I、表2、表3所述。表I PCR擴增反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法，其特征在于通過測定SEQ IDNO: I的5'端第650位核苷酸，以及SEQ ID NO:2的5'端第95位核苷酸，確定豬的基因型，來判斷豬個體間背膘厚度大小。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述SEQID NO: I的Y端第650位核苷酸及SEQ ID NO:2的5'端第95位核苷酸為C時，基因型為CC，判斷豬的背膘厚度較小，瘦肉率較高。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述SEQID NO: I的Y端第650位核苷酸及SEQ ID NO:2的5'端第95位核苷酸為T時，基因型為TT，判斷豬的背膘厚度較大，瘦肉率較低。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述SEQID NO: I的Y端第650位核苷酸及SEQ ID NO: 2的5'端第95位核苷酸為一個為C，一個為T時，基因型為CT，判斷豬的背 膘厚度較大，瘦肉率較低。
5.如權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于測定SEQID ΝΟ:1的Y端第650位核苷酸及SEQ ID NO:2的5'端第95位核苷酸的方法為先PCR擴增含有SEQ IDNO:2的5'端第95位核苷酸的基因組片段，然后對擴增產(chǎn)物進行測序或者用Taql酶切擴增產(chǎn)物；所述含有SEQ ID NO: I的5'端第650位核苷酸(C/T)的基因組片段PCR擴增產(chǎn)物為SEQ ID NO: 2的1039bp的核苷酸片段'Taql酶切所述1039bp PCR擴增產(chǎn)物，若得到 1039bp單一片段，其基因型為TT純合體；若得到1039bp，94bp及945bp三個酶切片段時，其基因型為CT雜合體；若得到94bp及945bp兩個片段時，基因型為CC純合體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于豬背膘厚標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法，通過測定SEQ ID NO:1的5′端第650位核苷酸，以及SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸，確定豬在該位點的基因型，來判斷同品種或同類型豬背膘厚的大小。本發(fā)明可用于檢測第6、7肋間活體背膘厚、最后肋骨處活體背膘厚、平均活體背膘厚、平均胴體背膘厚等反映豬背膘厚大小的性狀，從而為通過標(biāo)記輔助選擇減少背膘厚提高豬的瘦肉率提供新的重要分子標(biāo)記，并將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK102719523SQ201110448950
公開日2012年10月10日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者朱曉萍, 李加琪, 李華周, 王翀, 莫德林, 陳瑤生 申請人:中山大學(xué)