專利名稱：用于t淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于處理人外周血、臍帶血、胸水、腹水等樣品中的單個核細(xì)胞成為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-Induced Killer，簡稱CIK)的方法，特別是一種用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，該方法可以應(yīng)用于臨床細(xì)胞生物治療，也可以應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、臨床應(yīng)用研究及生物技術(shù)研究，尤其可以應(yīng)用于免疫系統(tǒng)研究和腫瘤殺傷作用的研究。
背景技術(shù)：
隨著腫瘤對人類生存健康的威脅日益嚴(yán)重，應(yīng)對腫瘤的治療模式也發(fā)生著日新月異的變化，各種新藥物、新技術(shù)、新方法層出不窮，其中細(xì)胞生物治療是繼手術(shù)、放療和化療后發(fā)展的第四類腫瘤治療方法，成為腫瘤生物治療中重要的發(fā)展方向。癌癥是腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視系統(tǒng)的細(xì)胞疾病，機體免疫功能的缺陷是癌癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。機體的抗腫瘤免疫主要為T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)。細(xì)胞生物治療技術(shù)將自體免疫細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)、分化、擴增再回輸至體內(nèi)，繞過體內(nèi)腫瘤免疫障礙機制，通過激發(fā)機體的免疫反應(yīng)來對抗、抑制和殺滅癌細(xì)胞。繼淋巴因子激活殺傷細(xì)胞、浸潤腫瘤淋巴細(xì)胞及分化抗原(Cluster of Differentiation,簡稱⑶)3單抗激活的殺傷細(xì)胞后，CIK的殺瘤作用日益受到重視。CIK細(xì)胞是1991年由美國斯坦福大學(xué)施密特等首次報道。他們發(fā)現(xiàn)在體外模擬人體內(nèi)環(huán)境的條件下，外周血淋巴細(xì)胞可以被多種細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)并增殖為一群具有高效細(xì)胞毒活性的異質(zhì)效應(yīng)細(xì)胞。由于該細(xì)胞群同時表達(dá)CD3、CD8和CD56膜蛋白分子，故又稱為自然殺傷細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強大的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物限制性殺瘤的優(yōu)點，可特異性聚集于腫瘤局部發(fā)揮抗瘤殺瘤作用。CIK 細(xì)胞在體內(nèi)歸巢于脾臟和淋巴結(jié)，在肝臟中分布最多，其次是外周血。其中CD3+、CD8+、CD56+ 是CIK細(xì)胞群中的主要效應(yīng)細(xì)胞，在正常人外周血中僅占淋巴細(xì)胞的1-5%，而在體外經(jīng)多種因子刺激培養(yǎng)10-25天后，細(xì)胞數(shù)量較培養(yǎng)前可增加1000倍以上。與其他過繼性免疫治療細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞具有增殖快、殺瘤活性強、殺瘤譜廣、副作用小、對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點。對化療耐藥的腫瘤細(xì)胞株有殺傷作用，而對正常造血集落細(xì)胞的生長沒有影響。通過取病人少量單個核細(xì)胞，在體外特定條件下制備出大量CIK細(xì)胞，回輸體內(nèi)后直接發(fā)揮有效清除腫瘤作用，尤其對手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細(xì)胞擴散和復(fù)發(fā)，提高機體免疫力，并實現(xiàn)了延長患者生存期，快速提高患者生活質(zhì)量等多重目標(biāo)。因此，CIK被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的優(yōu)選細(xì)胞。目前腫瘤生物治療中心應(yīng)用樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，簡稱 DC)和CIK細(xì)胞聯(lián)合回輸?shù)姆椒?，用于惡性黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、膀胱癌等疾病治療。但目前各個實驗室培養(yǎng)CIK的方法，使用材料，培養(yǎng)時間均不一致，導(dǎo)致有效細(xì)胞的培養(yǎng)周期、質(zhì)量和數(shù)量參差不齊，給臨床應(yīng)用帶來了效果不穩(wěn)定的風(fēng)險因素。另外，在中國專利申請?zhí)枮?00910045790. 4的“一種CIK細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑”中，公開了一種CIK細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑。其記載的CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)因子組合為植物血凝素、抗CD3單抗和抗CD28單抗。該方案中所使用的植物血凝素是一種有絲分裂原，能激活小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，繼而分裂增殖，釋放淋巴因子，提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，但由于其較難提純，且成本極高，所以一直以來僅在實驗室中作為刺激淋巴細(xì)胞增殖的試劑，很難應(yīng)用于臨床的大規(guī)模使用。在中國專利申請?zhí)枮?00310109565. 5的 “一種CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法”中，公開了一種CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法同樣采用了植物血凝素和抗CD3單克隆抗體兩種有絲分裂原聯(lián)合激活細(xì)胞，雖然能夠增強細(xì)胞的刺激強度，但該方法需要借助生物反應(yīng)器完成，不僅成本高，使用不方便，且不利于醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用。綜上，現(xiàn)有CIK細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)體外培養(yǎng)方法急需改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法可以用于 T淋巴細(xì)胞體外定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴增。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是該用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴增，其技術(shù)要點是具體操作步驟如下 第一步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選
將稀釋好的血細(xì)胞以1:1的比例緩慢注入細(xì)胞分選液上，并離心處理；用移液管吸出分選后的第一層液體即血漿或細(xì)胞組織均漿液層，棄去，吸取第二層細(xì)胞即環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞于新的離心管中；向新收集的細(xì)胞中補加生理鹽水，離心處理后棄上清；重復(fù)洗兩次；其中細(xì)胞分選液的配制方法為取9% Ficoll溶液720ml與33. 4%泛影葡胺30ml充分混合，再向該混合液中加入7. 5g的明膠，充分混勻；用高濃度的泛影葡胺或稀釋的Ficoll 來調(diào)整溶液的相對密度至1.077g/ml ；最后放入溫度為121°C的高壓蒸汽滅菌中30min，室溫保存?zhèn)溆茫?br> 第二步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)
取包被瓶一個，所述包被瓶是預(yù)先包被了 CD3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia、三種因子的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用生理鹽水或培養(yǎng)基潤洗一次并棄去，加入患者自體血漿 2飛ml ；取培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻后將其移入包被瓶中；而后用培養(yǎng)基潤洗離心管，將潤洗液再次移入包被瓶中；將包被瓶放入5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
包被瓶的制備?、?單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia加入到40ml磷酸鹽緩沖液中，⑶3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia三種因子的濃度比例為10:1:1， 制成總濃度為1200ng/ml的混合溶液，充分混勻；將該混合溶液加入到600ml培養(yǎng)瓶中，4°C 靜置至少24小時，制成初始包被瓶；將初始包被瓶在_40°C條件下冷凍24小時；啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內(nèi)的溫度降至-40 V，將包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達(dá)到<15Pa，真空凍干20小時；打開CO2進(jìn)氣閥，關(guān)閉真空泵；待壓力到IlOK 后關(guān)閉CO2進(jìn)氣閥，取出包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4°C保存；在規(guī)定的保質(zhì)期內(nèi)使用； 第三步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴增
吸取新鮮培養(yǎng)基溶解細(xì)胞因子A，即20萬單位的白細(xì)胞介素_2，注入包被瓶中，此時細(xì)胞因子A在培養(yǎng)瓶中的濃度為0. 4萬單位/ml ；于5%C02, 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3天后，向包被瓶中補加新鮮培養(yǎng)基IOOml ；再于5% C02，37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)廣2天，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿包被瓶底時，進(jìn)行轉(zhuǎn)袋；
用移液管吹下包被瓶中的貼壁細(xì)胞，用注射器吸取新鮮培養(yǎng)基溶解細(xì)胞因子B，即200 萬單位的白細(xì)胞介素_2，加入包被瓶中，同時加入患者自體血漿2 5ml，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)袋中；用新鮮培養(yǎng)基潤洗包被瓶兩次 ，將潤洗液一并倒入培養(yǎng)袋中，補加培養(yǎng)基至IOOOml，此時細(xì)胞因子B在培養(yǎng)瓶中的濃度為0. 2萬單位/ml ；將培養(yǎng)袋放入5%C02， 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、天后，補加新鮮培養(yǎng)基1000ml，繼續(xù)放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 補液后第二天，進(jìn)行檢菌，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物是否可以用于回輸治療或醫(yī)學(xué)研究。還包括檢菌、回輸步驟
所述檢菌時，取出培養(yǎng)袋，用注射器由取樣口吸取培養(yǎng)物分別注入兩個雙相血培養(yǎng)瓶中，一瓶送與第三方進(jìn)行無菌檢測，一瓶用于自檢；將雙向血培養(yǎng)瓶置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3天后若無菌生長，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物可以用于回輸治療或醫(yī)學(xué)研究；
回輸時，準(zhǔn)備離心管8個，將培養(yǎng)物倒入離心管中，剩余培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； 4°C條件下，離心處理棄去上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞并集中到2個離心管中；4°C條件下， 離心處理棄去上清；用生理鹽水重懸細(xì)胞并集中到1個離心管中；4°C條件下，離心處理棄去上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞；4°C條件下，離心處理棄去上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞；用注射器吸取一只細(xì)胞分散劑注入新的離心管中，該細(xì)胞分散劑為10%人血清白蛋白，而后將無菌篩網(wǎng)放到該離心管上；吸取細(xì)胞懸液，注入裝有無菌濾器的離心管中；通過濾網(wǎng)濾去大的細(xì)胞團；取回輸袋一個，倒入細(xì)胞并加生理鹽水備用。所述培養(yǎng)方法用于處理人外周血、臍帶血、胸水、腹水中的單個核細(xì)胞的體外定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴增。本發(fā)明具有的優(yōu)點及積極效果是由于本發(fā)明采用了特殊的細(xì)胞因子組合用于對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，這三種因子分別是CD3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia ；這三種因子的最佳濃度比例為10:1:1，這三種因子在培養(yǎng)基中的總終濃度為 1200ng/ml，實驗表明這種組合是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化的極有效的方式。同時，以細(xì)胞因子預(yù)先包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶的方法誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化，增加了 T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子接觸的面積和時間，使之更容易接受到細(xì)胞因子刺激而迅速被誘導(dǎo)分化。另外，本發(fā)明采用了凍干的方法制備包被瓶，這種方法對于保證細(xì)胞因子的活性是非常有效的。如果這種方法應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，既可以延長包被瓶的保質(zhì)期，又降低了對運輸條件的要求，是一種適用于實際生產(chǎn)的極好方法。Y-干擾素是由⑶4+或⑶8+細(xì)胞產(chǎn)生的同源二聚體糖蛋白，可通過多種途徑直接或間接發(fā)揮抗腫瘤作用，增強自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。在誘導(dǎo) CIK細(xì)胞形成過程中加入γ-干擾素可降低白細(xì)胞介素-2用量；同時γ-干擾素加入的順序與細(xì)胞毒活性密切相關(guān)，先加入Y-干擾素后加入白細(xì)胞介素_2可提高細(xì)胞毒活性。這是因為先加入Y “干擾素可促使外周血單核細(xì)胞上白細(xì)胞介素_2受體數(shù)量增加，從而有效地激活了效應(yīng)細(xì)胞?？笴D3單克隆抗體作為一種有絲分裂促進(jìn)劑可促進(jìn)細(xì)胞增殖。20世紀(jì) 80年代初研究者們就發(fā)現(xiàn)抗CD3抗體或抗T細(xì)胞受體抗體能模擬生理配體體外激活靜止的 T細(xì)胞，使之大量增殖，表達(dá)白細(xì)胞介素_2受體，產(chǎn)生內(nèi)源性白細(xì)胞介素_2。抗CD3單抗具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，抗體抑制惡性腫瘤的生長可能是免疫增強的效果，抗體使抗腫瘤特異性T細(xì)胞數(shù)量增多，活性增強，同時內(nèi)源性細(xì)胞因子的誘生放大了這種作用?？笴D3單克隆抗體不僅在CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中起著重要作用，在提高CIK細(xì)胞對白血病及淋巴瘤的殺傷敏感性上同樣具有促進(jìn)作用。白細(xì)胞介素-1主要由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。白細(xì)胞介素-1的體內(nèi)抗腫瘤作用機制是增強T細(xì)胞及增加腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能。白細(xì)胞介素-1可以介導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞上表達(dá)白細(xì)胞介素_2受體，與Y -干擾素、CD3單克隆抗體聯(lián)合使用時可以明顯提高CIK的細(xì)胞毒效應(yīng)，但白細(xì)胞介素-1對CIK細(xì)胞擴增不起作用。白細(xì)胞介素_2是T淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子(由133個氨基酸組成的多肽， 相對分子質(zhì)量約為15X103)。它是人體免疫應(yīng)答的核心物質(zhì)，具有免疫增強、抗腫瘤和抗感染等作用。臨床上已用于腎癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、腸癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤、白血病及癌性胸腹水等病癥的治療。與放療、化療比較，白細(xì)胞介素_2對正常細(xì)胞毒副作用輕微，能減輕腫瘤患者的疼痛，提高患者生活質(zhì)量。此外結(jié)核病、肝炎、艾滋病、性病、成癮性吸毒者及其他免疫功能低下患者均可使用白細(xì)胞介素_2。CIK細(xì)胞是多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)培養(yǎng)的一群異質(zhì)細(xì)胞群，多種細(xì)胞因子的作用是相互協(xié)同的，單一因子對效應(yīng)細(xì)胞的增殖及細(xì)胞毒活性無作用或者小于多種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用。聯(lián)合作用的機制是最終共同激活靜止T細(xì)胞，提高細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素_2受體和產(chǎn)生白細(xì)胞介素_2 的能力，啟動自分泌途徑白細(xì)胞介素_2依賴的T細(xì)胞激活反應(yīng)。另外，本發(fā)明制備了一種高效的細(xì)胞分選液，該細(xì)胞分選液能夠有效裂解血液中的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞成分充分沉淀，與待分離的單個核細(xì)胞分開。再則，本發(fā)明試劑盒采用無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基可達(dá)到生物潔凈要求，成分明確，質(zhì)量穩(wěn)定，便于質(zhì)控，克服了人AB血清的缺點，能減少病人意外感染的機會，對于免疫治療的推廣應(yīng)用有重要意義。使用本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理T淋巴細(xì)胞，可以收獲95%以上的⑶3+細(xì)胞，其中⑶3+⑶8+細(xì)胞達(dá)80%以上，CD3+CD4+細(xì)胞達(dá)10-20%以上，CD3+CD56+細(xì)胞達(dá)16_20%。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述


圖1是人外周血經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后所獲得培養(yǎng)4天的40倍鏡下CIK細(xì)胞實拍圖2是人外周血經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后所獲得培養(yǎng)7天的40倍鏡下CIK細(xì)胞實拍圖3是人外周血經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后所獲得培養(yǎng)7天的100倍鏡下CIK細(xì)胞實拍圖4是人外周血經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后所獲得培養(yǎng)9天的40倍鏡下CIK細(xì)胞實拍圖5是人外周血經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后所獲得培養(yǎng)10天的40倍鏡下CIK細(xì)胞實拍圖6是人外周血經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后所獲得培養(yǎng)10天的400倍鏡下CIK細(xì)胞實拍圖7是人胸水經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后獲得的CIK細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定反饋出的CD45+散點圖，圖中圈出的是CD45+細(xì)胞，這些細(xì)胞代表樣品中的白細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等；
圖8是人胸水經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后獲得的CIK細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定反饋出的CD3+散點圖，圖中圈出的是CD3+細(xì)胞，這些細(xì)胞代表樣品中的T淋巴細(xì)胞；
圖9是人胸水經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后獲得的CIK細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定反饋出的⑶3+⑶8+散點圖，圖中根據(jù)⑶8抗原將⑶3+細(xì)胞分成了的兩部分，上方是⑶3+⑶8+雙陽細(xì)胞，代表的是細(xì)胞毒性T細(xì)胞；下方是CD3+CD8—單陽細(xì)胞；
圖10是人胸水經(jīng)本發(fā)明所述培養(yǎng)方法處理后獲得的CIK細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定反饋出的⑶4+CD8+散點圖，圖中根據(jù)⑶4和⑶8抗原將⑶3+細(xì)胞分成四部分，右上方是⑶4+⑶8+ 雙陽細(xì)胞；右下方是CD4—CD8+單陽細(xì)胞，代表的是細(xì)胞毒性T細(xì)胞；左下方是CD4—CD8-雙陰細(xì)胞；左上方是⑶4+CD8—單陽細(xì)胞，代表的是輔助性T細(xì)胞。
具體實施例方式結(jié)合圖廣10和對本發(fā)明作詳細(xì)描述。本發(fā)明所述T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法主要用于T淋巴細(xì)胞體外定向分選、誘導(dǎo)、 分化、培養(yǎng)、擴增等；其處理的生物樣品包括人外周血、臍帶血、胸水、腹水等；可以應(yīng)用于臨床細(xì)胞生物治療，包括腎癌、惡性黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直腸癌、胃癌、肺癌、食管癌、 宮頸癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤(非T細(xì)胞淋巴瘤)等惡性腫瘤疾病，也可以應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、臨床應(yīng)用研究及生物技術(shù)研究，尤其可以應(yīng)用于免疫系統(tǒng)研究和腫瘤殺傷作用的研究。具體培養(yǎng)方法如下
實施例一
現(xiàn)以人外周血為處理樣品，使用本發(fā)明所述試劑盒中內(nèi)容物分選誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，并應(yīng)用于臨床生物治療。具體操作步驟如下 步驟一.血液處理
1.將50ml抗凝血注入50ml離心管中，4°C條件下160(T2000Xg離心lOmin。如不能馬上離心，可放于4°C保存，但不能超過4小時。2.用移液管將上層血漿移入新50ml離心管中，標(biāo)注好患者信息。56°C滅活30min。3.生理鹽水稀釋血細(xì)胞至50ml，用移液管混勻。以上為稀釋血細(xì)胞過程。4.將稀釋好的血細(xì)胞以1 :1的比例緩慢注入每管7ml的細(xì)胞分選液上。注意不要打破界面。5. 20°C條件下，220(T2500Xg離心20min。此時離心管中細(xì)胞由上至下分為四層。
第一層血漿或細(xì)胞組織均漿液層；第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層；第三層透明細(xì)胞分選液層；第四層紅細(xì)胞層。用移液管吸出第一層液體，棄去；吸取第二層細(xì)胞于新的50ml 離心管中。6.向新收集的細(xì)胞中補加生理鹽水至50ml，4°C條件下，160(T2000Xg離心 4 5min。7.棄去上清。輕彈離心管管底，打散沉淀。8.重復(fù)步驟6 7兩次。以上為細(xì)胞分選過程。9.取已包被細(xì)胞因子24小時以上的包被瓶，用生理鹽水或培養(yǎng)基潤洗一次并棄去，加入患者自體血漿2 5ml。
10.取25ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用移液管充分混勻后將其移入包被瓶中。11.用25ml培養(yǎng)基潤洗離心管，將潤洗液再次移入包被瓶中。12.將包被瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以上為細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程。步驟二.加細(xì)胞因子A
1.血液處理第二天，從上述培養(yǎng)箱中取出包被瓶，觀察細(xì)胞狀態(tài)。2.用5ml注射器吸取新鮮培養(yǎng)基2ml溶解細(xì)胞因子A，注入包被瓶中。3.將包被瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟三.補液
1.上述培養(yǎng)廣3天時，如圖1所示，細(xì)胞出現(xiàn)生長跡象，向包被瓶中補加新鮮培養(yǎng)基 100ml。2.將包被瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟四.轉(zhuǎn)袋
1.上述培養(yǎng)廣2天時，如圖2、圖3所示，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿包被瓶底時，進(jìn)行轉(zhuǎn)袋。2.用移液管吹下包被瓶中的貼壁細(xì)胞，用5ml注射器吸取新鮮培養(yǎng)基2ml溶解細(xì)胞因子B，加入包被瓶中，同時加入患者自體血漿2 5ml。3.取培養(yǎng)袋，標(biāo)注好患者信息。4.取下培養(yǎng)袋管帽、50ml注射器針頭和內(nèi)栓。將培養(yǎng)袋進(jìn)液口與注射器頭相連。5.將包被瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)袋中；用新鮮培養(yǎng)基潤洗包被瓶兩次，將潤洗液一并倒入培養(yǎng)袋中。6.向培養(yǎng)袋中補加新鮮培養(yǎng)基至1000ml。7.夾緊進(jìn)液口，除去注射器，蓋好管帽。8.將培養(yǎng)袋放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟五.補液
1.轉(zhuǎn)袋后3-4天，如圖4、圖5、圖6所示，細(xì)胞開始大量成團生長，此時可以適度揉動培養(yǎng)袋，以打散細(xì)胞團，使細(xì)胞個體能更好的與培養(yǎng)基中的生長因子相接觸。2.取下培養(yǎng)袋管帽、50ml注射器針頭和內(nèi)栓。將培養(yǎng)袋進(jìn)液口與注射器頭相連。 補加新鮮培養(yǎng)基1000ml。3.夾緊入液口。除去注射器，蓋好管帽。4.將培養(yǎng)袋放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完成細(xì)胞擴增，待檢菌后，備用。步驟六.檢菌
1.補液后第二天，進(jìn)行檢菌。2.取出培養(yǎng)袋，用5ml注射器由取樣口吸取培養(yǎng)物5ml注入兩個雙相血培養(yǎng)瓶中， 一瓶送與第三方進(jìn)行無菌檢測，一瓶用于自檢。將雙向血培養(yǎng)瓶置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.將培養(yǎng)袋放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3天后若無菌生長，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物可以用于回輸治療。步驟七.回輸
1.觀察細(xì)胞生長情況，確定回輸時間。
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2.準(zhǔn)備50ml離心管8個，標(biāo)注好患者信息。 3.將培養(yǎng)物倒入50ml離心管中，剩余培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。4.4°C條件下，160(T2000Xg離心4 5min。棄去上清，輕彈離心管管底打散細(xì)胞。5.用生理鹽水重懸細(xì)胞并集中到2個離心管中。6.4°C條件下，160(T2(KK)Xg離心4 5min。棄去上清，輕彈離心管管底打散細(xì)胞。7.用生理鹽水重懸細(xì)胞并集中到1個離心管中。8.4°C條件下，160(T2000Xg離心4 5min。棄去上清，輕彈離心管管底打散細(xì)胞。9.用生理鹽水重懸細(xì)胞。10.4°C條件下，160(T2000Xg離心4 5min。棄去上清，輕彈離心管管底打散細(xì)胞。11.用生理鹽水重懸細(xì)胞。12.用5ml注射器吸取一只細(xì)胞分散劑注入新的50ml離心管中。將無菌篩網(wǎng)放到
離心管上。13.用移液管吸取細(xì)胞懸液，注入裝有無菌濾器的離心管中。通過濾網(wǎng)濾去大的細(xì)胞團。14.取回輸袋一個，標(biāo)注好患者信息。剪開管口，連接50ml注射器，倒入細(xì)胞并加生理鹽水至150ml。15.用止血鉗夾住管口，熱合機封口。在操作過程中應(yīng)該注意以下幾點
1.將血液注入細(xì)胞分離液上時，應(yīng)輕柔緩慢，切勿打破界面。2.培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱后應(yīng)寧松瓶口使氣體流通。3.每天觀察細(xì)胞生長狀況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)袋中的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞集落時，輕柔培養(yǎng)袋打散集落。防止因細(xì)胞大量聚集導(dǎo)致核心部的細(xì)胞死亡。4.操作過程要求在萬級潔凈實驗室的局部百級超凈工作臺內(nèi)完成，以保證整個過程的安全無菌。5.培養(yǎng)瓶應(yīng)盡可能水平放置。取回輸前的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果表明，50ml的外周血經(jīng)本方法處理后，可收獲細(xì)胞數(shù)約5X IO9飛X IO11個。取某一例樣品經(jīng)本方法處理收獲的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果如圖7 10所示。細(xì)胞群中白細(xì)胞共同抗原CD45+的細(xì)胞約占全部回輸細(xì)胞的 68. 61% (見圖7)，其中T淋巴細(xì)胞表面抗原⑶3+細(xì)胞的比例達(dá)到99% (見圖8)，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞表面抗原⑶3+⑶8+雙陽細(xì)胞占68% (見圖9)，輔助性T細(xì)胞表面抗原⑶3+⑶4+雙陽細(xì)胞占32% (見圖10)，由此可以看出，本發(fā)明方法培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞具有非常高的收率和純度。實施例二
本發(fā)明還可用于人臍帶血中T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴增。具體操作步驟如下 步驟一.血液處理
1.將80ml抗凝臍帶血分別注入4個50ml離心管中，4°C條件下1600 2000Xg離心 IOmin0如不能馬上離心，可放于4°C保存，但不能超過4小時。2.棄去上層血漿。3.生理鹽水分別稀釋4管血細(xì)胞至50ml，用移液管混勻。以上為稀釋血細(xì)胞過程。
4.將稀釋好的血細(xì)胞以1 :1的比例緩慢注入每管7ml的細(xì)胞分選液上。注意不要打破界面。5. 20°C條件下，220(T2500Xg離心20min。吸取第二層細(xì)胞于新的50ml離心管中。6.向新收集的細(xì)胞中補加生理鹽水至50ml，4°C條件下，160(T2000Xg離心 4 5min。7.棄去上清。輕彈離心管管底，打散沉淀。8.重復(fù)步驟6 7兩次。以上為細(xì)胞分選過程。9.取已包被細(xì)胞因子24小時以上的包被瓶，用生理鹽水或培養(yǎng)基潤洗一次并棄去。10.取25ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用移液管充分混勻后將其移入包被瓶中。11.用25ml培養(yǎng)基潤洗離心管，將潤洗液再次移入包被瓶中。12.將包被瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以上為細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程。步驟二.加細(xì)胞因子A
1.血液處理第二天，從上述培養(yǎng)箱中取出包被瓶，觀察細(xì)胞狀態(tài)。2.用5ml注射器吸取新鮮培養(yǎng)基2ml溶解細(xì)胞因子A，注入包被瓶中。3.將包被瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟三.補液
1.上述培養(yǎng)2 3天時，向包被瓶中補加新鮮培養(yǎng)基100ml。2.將包被瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟四.轉(zhuǎn)袋
1.上述培養(yǎng)廣2天時，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿包被瓶底時，進(jìn)行轉(zhuǎn)袋。2.用移液管吹下包被瓶中的貼壁細(xì)胞，用5ml注射器吸取新鮮培養(yǎng)基2ml溶解細(xì)胞因子B，加入包被瓶中。3.取培養(yǎng)袋，標(biāo)注好患者信息。后續(xù)步驟同實施例一。實施例三
本發(fā)明還可用于人胸水或腹水中T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴增。具體操作步驟如下 步驟一.取胸水或腹水1000ml，4°C條件下，160(T2000Xg離心4 5min。
步驟二.棄去上清，輕彈離心管管底，打散沉淀。步驟三.用生理鹽水漂洗細(xì)胞3次。步驟四.取包被瓶，用生理鹽水或培養(yǎng)基潤洗一次并棄去。步驟五.取25ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用移液管充分混勻后將其移入包被瓶中。步驟六.用25ml培養(yǎng)基潤洗離心管，將潤洗液再次移入包被瓶中。步驟七.將培養(yǎng)瓶放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后續(xù)步驟除不再加入患者自體血漿以外，其他步驟同實施例一。為使本發(fā)明所述培養(yǎng)方法能夠在規(guī)范的、標(biāo)準(zhǔn)化儀器狀態(tài)下進(jìn)行，對其所用試劑及試驗器材進(jìn)行介紹
其中包括用于盛裝液體的無菌離心管，50X50ml/個；用于吸放液體的無菌移液管， 9 X IOml/支；用于分選細(xì)胞的細(xì)胞分選液，7 X 7ml/管；用于誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的包被瓶，1瓶； 用于為細(xì)胞提供生長所需營養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，2X IL/瓶；用于吸放液體的無菌注射器7 X 5ml/個；用于作為漏斗轉(zhuǎn)接液體的無菌注射器，7 X 50ml/個；用于刺激T淋巴細(xì)胞分裂的細(xì)胞因子A，即白細(xì)胞介素_2，20萬單位/支；用于作為培養(yǎng)細(xì)胞容器的無菌細(xì)胞培養(yǎng)袋，1 X 2L/個；用于刺激T淋巴細(xì)胞分裂的細(xì)胞因子B，即白細(xì)胞介素_2，200萬單位/支； 用于檢菌的雙向血培養(yǎng)瓶，2個；用于防止細(xì)胞聚集的細(xì)胞分散劑，5X2ml/支；用于過濾細(xì)胞團的無菌過濾網(wǎng)，5個；用于盛裝細(xì)胞懸液的無菌回輸袋，5X250ml/個；用于標(biāo)注回輸信息的標(biāo)簽，5個。上述試劑及試驗器材的制備及來源如下
1、包被瓶的制備?、?單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia加入到40ml磷酸鹽緩沖液中，CD3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia三種因子的最佳濃度比例為 10:1:1，制成總濃度為1200ng/ml的混合溶液，充分混勻；將該混合溶液加入到600ml培養(yǎng)瓶中，4°C靜置至少24小時，制成初始包被瓶；將初始包被瓶在-40°C條件下冷凍24小時； 啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內(nèi)的溫度降至-40°C，將包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達(dá)到<15Pa，真空凍干20小時；打開CO2進(jìn)氣閥，關(guān)閉真空泵；待壓力到IlOK后關(guān)閉CO2進(jìn)氣閥，取出包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4°C保存；在規(guī)定的保質(zhì)期內(nèi)使用。2、細(xì)胞分選液的制備
取9% Ficoll溶液720ml與33. 4%泛影葡胺30ml充分混合，再向該混合液中加入 7. 5g的明膠，充分混勻。用高濃度的泛影葡胺或稀釋的Ficoll來調(diào)整溶液的相對密度至 1.077g/ml。于121°C高壓蒸汽滅菌30min，室溫保存?zhèn)溆谩?、離心管和移液管均購買于美國康寧公司。注射器均購買于沈陽北華醫(yī)材有限公
司ο4、磷酸鹽緩沖液購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(2000ml/袋)；⑶3單克隆抗體購買于日本轉(zhuǎn)基因公司(5mg/5ml/支)；白細(xì)胞介素_1 α購買于美國GIBCO公司 (100 μ g/支)；白細(xì)胞介素-2購買于北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司(20萬單位/支，200萬單位/支)；Y -干擾素購買于山東泉港藥業(yè)有限公司(100萬單位/支);細(xì)胞分散劑即人血清白蛋白，購買于德國杰特貝森生物制品有限公司(10g/50ml/瓶);無血清培養(yǎng)基購買于美國 GIBCO 公司(IOOOml/ 瓶)。
權(quán)利要求
1.一種用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選、誘導(dǎo)、分化、 培養(yǎng)、擴增，其特征在于具體操作步驟如下第一步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選將稀釋好的血細(xì)胞以1:1的比例緩慢注入細(xì)胞分選液上，并離心處理；用移液管吸出分選后的第一層液體即血漿或細(xì)胞組織均漿液層，棄去，吸取第二層細(xì)胞即環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞于新的離心管中；向新收集的細(xì)胞中補加生理鹽水，離心處理后棄上清；重復(fù)洗兩次；其中細(xì)胞分選液的配制方法為取9% Ficoll溶液720ml與33. 4%泛影葡胺30ml充分混合，再向該混合液中加入7. 5g的明膠，充分混勻；用高濃度的泛影葡胺或稀釋的Ficoll 來調(diào)整溶液的相對密度至1.077g/ml ；最后放入溫度為121°C的高壓蒸汽滅菌中30min，室溫保存?zhèn)溆茫坏诙?、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)取包被瓶一個，所述包被瓶是預(yù)先包被了 CD3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia三種因子的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用生理鹽水或培養(yǎng)基潤洗一次并棄去，加入患者自體血漿 2飛ml ；取培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻后將其移入包被瓶中；而后用培養(yǎng)基潤洗離心管，將潤洗液再次移入包被瓶中；將包被瓶放入5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;包被瓶的制備取⑶3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia加入到40ml磷酸鹽緩沖液中，⑶3單克隆抗體、Y-干擾素、白細(xì)胞介素-Ia三種因子的濃度比例為10:1:1， 制成總濃度為1200ng/ml的混合溶液，充分混勻；將該混合溶液加入到600ml培養(yǎng)瓶中，4°C 靜置至少24小時，制成初始包被瓶；將初始包被瓶在_40°C條件下冷凍24小時；啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內(nèi)的溫度降至-40 V，將包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達(dá)到<15Pa，真空凍干20小時；打開CO2進(jìn)氣閥，關(guān)閉真空泵；待壓力到IlOK 后關(guān)閉CO2進(jìn)氣閥，取出包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4°C保存；在規(guī)定的保質(zhì)期內(nèi)使用；第三步、對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴增吸取新鮮培養(yǎng)基溶解細(xì)胞因子A，即20萬單位的白細(xì)胞介素_2，注入包被瓶中，此時細(xì)胞因子A在培養(yǎng)瓶中的濃度為0. 4萬單位/ml ；于5%C02, 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3天后，向包被瓶中補加新鮮培養(yǎng)基IOOml ；再于5% C02，37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)廣2天，當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿包被瓶底時，進(jìn)行轉(zhuǎn)袋；用移液管吹下包被瓶中的貼壁細(xì)胞，用注射器吸取新鮮培養(yǎng)基溶解細(xì)胞因子B，即200 萬單位的白細(xì)胞介素_2，加入包被瓶中，同時加入患者自體血漿2 5ml，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)袋中；用新鮮培養(yǎng)基潤洗包被瓶兩次，將潤洗液一并倒入培養(yǎng)袋中，補加培養(yǎng)基至IOOOml，此時細(xì)胞因子B在培養(yǎng)瓶中的濃度為0. 2萬單位/ml ；將培養(yǎng)袋放入5%C02， 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、天后，補加新鮮培養(yǎng)基1000ml，繼續(xù)放入5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 補液后第二天，進(jìn)行檢菌，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物是否可以用于回輸治療或醫(yī)學(xué)研究。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于還包括檢菌、 回輸步驟所述檢菌時，取出培養(yǎng)袋，用注射器由取樣口吸取培養(yǎng)物分別注入兩個雙相血培養(yǎng)瓶中，一瓶送與第三方進(jìn)行無菌檢測，一瓶用于自檢；將雙向血培養(yǎng)瓶置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3天后若無菌生長，證明培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)物可以用于回輸治療或醫(yī)學(xué)研究；回輸時，準(zhǔn)備離心管8個，將培養(yǎng)物倒入離心管中，剩余培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； 4°C條件下，離心處理棄去上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞并集中到2個離心管中；4°C條件下， 離心處理棄去上清；用生理鹽水重懸細(xì)胞并集中到1個離心管中；4°C條件下，離心處理棄去上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞；4°C條件下，離心處理棄去上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞；用注射器吸取一只細(xì)胞分散劑注入新的離心管中，該細(xì)胞分散劑為10%人血清白蛋白，而后將無菌篩網(wǎng)放到該離心管上；吸取細(xì)胞懸液，注入裝有無菌濾器的離心管中；通過濾網(wǎng)濾去大的細(xì)胞團；取回輸袋一個，倒入細(xì)胞并加生理鹽水備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于用于處理人外周血、臍帶血、胸水、腹水中的單個核細(xì)胞的體外定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴增。
全文摘要
一種用于T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，從根本上解決現(xiàn)有T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法存在的成本高、使用不方便、且不利于醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用的問題，本發(fā)明包括對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定向分選、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴增等步驟，采用了特殊的細(xì)胞因子組合用于對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，這三種因子分別是CD3單克隆抗體、γ-干擾素、白細(xì)胞介素-1α，這三種因子的最佳濃度比例為10∶1∶1，這三種因子在培養(yǎng)基中的總終濃度為1200ng/ml，實驗表明這種組合是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化的極有效的方式。
文檔編號C12N5/0783GK102433303SQ201110449100
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者李文欣 申請人:遼寧邁迪生物科技有限公司