專利名稱：一種人工抗原遞呈細(xì)胞及其在nk細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及NK細(xì)胞免疫治療中NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法。
背景技術(shù)：
NK細(xì)胞(natural killer cell，自然殺傷細(xì)胞)是一類大顆粒淋巴細(xì)胞，是機(jī)體初始(innate)免疫和后繼(adaptive)免疫的重要橋梁，在機(jī)體抗感染性疾病和惡性腫瘤免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要的作用。繼發(fā)性NK細(xì)胞移植能產(chǎn)生良好的抗腫瘤效應(yīng)，而其自身很少被受體排斥，且不會(huì)引起任何GVHD(Graft Versus Host Disease)，因此，繼發(fā)性NK細(xì)胞治療(Adoptive NK cell therapy)已成為目前最熱門和最有前途的惡性腫瘤治療方法之
ο盡管繼發(fā)性NK細(xì)胞免疫治療具有良好的抗腫瘤效應(yīng)和巨大的應(yīng)用前景，但NK細(xì)胞免疫治療仍然難以進(jìn)行常規(guī)臨床應(yīng)用，其中最主要障礙在于，在外周血淋巴細(xì)胞(PBMC) 中，NK細(xì)胞只是一個(gè)很小的群體，僅占人外周血淋巴細(xì)胞的10 15%，難以滿足巨大的臨床需要。為解決這一難題，首先要在數(shù)量上保證NK細(xì)胞的有效供給，因此，探索各種有效的NK 細(xì)胞體外擴(kuò)增(Ex vivo expansion)方法已成為NK細(xì)胞免疫治療的重要發(fā)展趨勢。應(yīng)用人工抗原遞呈細(xì)胞(artificialantigen presenting cell, aAPC)作為飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cell)進(jìn)行NK細(xì)胞體外擴(kuò)增已成為NK細(xì)胞擴(kuò)增的一種重要方法。在以往的研究中有研究者應(yīng)用遺傳修飾的K562細(xì)胞作為人工抗原遞呈細(xì)胞，如應(yīng)用4-1BBL (CD137L) 和膜固定IL15 (membrane-bound IL-15, mIL_15)轉(zhuǎn)化的K562細(xì)胞進(jìn)行NK細(xì)胞擴(kuò)增，這種方法可以獲得較高細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞，但NK細(xì)胞增殖受到限制，5-6周后細(xì)胞不再擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種人工抗原遞呈細(xì)胞。本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供一種人工抗原遞呈細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供一種人工抗原遞呈細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種NK細(xì)胞擴(kuò)增方法。為了解決本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種人工抗原遞呈細(xì)胞，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為4-lBBL-mIL-21-aAPC，其細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體和膜固定白介素21 (mIL-21)。作為一個(gè)優(yōu)選，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為4-lBBL-mIL-21-K562細(xì)胞。為了解決本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明提供了人工抗原遞呈細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟
(1)構(gòu)建4-1BBL表達(dá)的轉(zhuǎn)座子；
(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞 4-lBBL-aAPC ；(3)在步驟(2)獲得的4-lBBL-aAPC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-21 (membrane-bound IL-21, mIL-21 )，建立 4-lBBL_mIL-21 -aAPC。作為一個(gè)優(yōu)選，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為4-lBBL-mIL-21-K562細(xì)胞。為了解決本發(fā)明第三個(gè)目的，本發(fā)明提供了人工抗原遞呈細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用。為了解決本發(fā)明第四個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，利用上述人工抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，包括以下步驟
(1)構(gòu)建4-1BBL表達(dá)的轉(zhuǎn)座子；
(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞 4-lBBL-aAPC ；
(3)在步驟(2)獲得的4-lBBL-aAPC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-21 (membrane-bound IL-21, mIL-21 )，建立 4-lBBL_mIL-21 -aAPC ；
(4)致死性照射或絲裂霉素處理步驟(3)獲得的人工抗原遞呈細(xì)胞，按2:1與外周血淋巴細(xì)胞混合，在NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中共培育；
(5)1周后，重復(fù)刺激1次，連續(xù)數(shù)周，以獲得足夠量的NK細(xì)胞。作為一個(gè)優(yōu)選，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為4-lBBL-mIL-21-K562細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，為建立一種高效和高細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，我們通過在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體(4-1BBL)和膜固定白介素21 (mIL_21 )，構(gòu)建新型人工抗原遞呈細(xì)胞4-lBBL-mIL-21 -aAPC,如4-lBBL-mIL-21_K562細(xì)胞，以此作為擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞，從外周血淋巴細(xì)胞中直接擴(kuò)增NK細(xì)胞。流式細(xì)胞分析、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等表明所擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度高和細(xì)胞毒性強(qiáng)，具有明顯的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。本發(fā)明提供的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法簡單、易于操作；擴(kuò)增效率好、純度高；擴(kuò)增持續(xù)時(shí)間長、腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)明顯。


圖1為4-1BBL和mIL_21在4-lBBL-mIL_21- K562人工抗原遞呈細(xì)胞中的表達(dá)。圖2為4-lBBL-mIL-21-K562人工抗原遞呈細(xì)胞所擴(kuò)增NK細(xì)胞的純度(W代表擴(kuò)增周數(shù))。圖3 為 4-lBBL-mIL-21-K562 人工抗原遞呈細(xì)胞與 4-lBBL-mIL-15- K562 人工抗原遞呈細(xì)胞所擴(kuò)增NK細(xì)胞的增殖比較。圖4為NK細(xì)胞擴(kuò)增前后的受體表達(dá)(W代表擴(kuò)增周數(shù)，0 W代表擴(kuò)增前細(xì)胞)。圖5為4-lBBL-mIL-21-K562人工抗原遞呈細(xì)胞與4-lBBL-mIL-15_K562人工抗原遞呈細(xì)胞所擴(kuò)增NK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷效率(擴(kuò)增第21天，不同捐獻(xiàn)者)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的4-lBBL-mIL-21-K562的制備方法和NK細(xì)胞擴(kuò)增方法的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。實(shí)施例1、人工抗原遞呈細(xì)胞4-lBBL-mIL-21_K562的制備方法
1.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4 T0P0質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達(dá)載體的Nhe I-XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子。2.將4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得 4-1BBL 穩(wěn)定表達(dá)的 K562 細(xì)胞(4-1BBL-K562)。3.將 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，建立4-lBBL-mIL-21-K562人工抗原遞呈細(xì)胞。實(shí)施例2、NK細(xì)胞擴(kuò)增方法
1.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4 TOPO質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達(dá)載體的Nhe I-XhoI 位點(diǎn)，構(gòu)建4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子。2.將4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得 4-1BBL 穩(wěn)定表達(dá)的 K562 細(xì)胞(4-1BBL-K562)。3.將 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，建立4-lBBL-mIL-21- K562人工抗原遞呈細(xì)胞。4.將 IL-15-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，建立4-lBBL-mIL-15 -K562人工抗原遞呈細(xì)胞。5.用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血淋巴細(xì)胞。6. IOOGy放射線照射構(gòu)建的人工抗原遞呈細(xì)胞。7.照射過的人工抗原遞呈細(xì)胞與淋巴細(xì)胞按2:1混合，在含有10%FBS、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、50U/ml IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中于5% CO2培養(yǎng)箱中共培育，每2天更
換新鮮培養(yǎng)基一次。8.每周按步驟6和7程序重復(fù)刺激擴(kuò)增后細(xì)胞1次。9.在不同時(shí)間點(diǎn)，檢測NK細(xì)胞純度(見圖2)、細(xì)胞數(shù)目(見圖3)、表面受體表達(dá)(見圖4)和對腫瘤細(xì)胞的殺傷效力(見圖5)。通過構(gòu)建新型人工抗原遞呈細(xì)胞，以此作為擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞，從外周血淋巴細(xì)胞中直接擴(kuò)增NK細(xì)胞。流式細(xì)胞分析、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等表明所擴(kuò)增的細(xì)胞NK純度高和細(xì)胞毒性強(qiáng)，具有明顯的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，如用其它類型的細(xì)胞 721. 221細(xì)胞等替代K562細(xì)胞，用其它方式實(shí)現(xiàn)4-1BBL和mIL_21在細(xì)胞膜表面的表達(dá)，對擴(kuò)增條件和程序進(jìn)行改進(jìn)等等，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種人工抗原遞呈細(xì)胞，其特征在于，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為 4-lBBL-mIL-21-aAPC，其細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體和mIL_21。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人工抗原遞呈細(xì)胞，其特征在于，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為 4-lBBL-mIL-21-K562 細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1所述的人工抗原遞呈細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)構(gòu)建4-1BBL表達(dá)的轉(zhuǎn)座子；(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞 4-lBBL-aAPC ；(3)在步驟(2)獲得的4-lBBL-aAPC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-21，建立 4-lBBL-mIL-21-aAPC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人工抗原遞呈細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為4-lBBL-mIL-21-K562細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1或2所述的人工抗原遞呈細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用。
6.一種NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述人工抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，包括以下步驟(1)構(gòu)建4-1BBL表達(dá)的轉(zhuǎn)座子；(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞4-lBBL-aAPC ；(3)在步驟(2)獲得的4-lBBL-aAPC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-21，建立 4-lBBL-mIL-21 -aAPC ；(4)致死性照射或絲裂霉素處理步驟(3)獲得的人工抗原遞呈細(xì)胞，按2:1與外周血淋巴細(xì)胞混合，在NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中共培育；(5)1周后，重復(fù)刺激1次，連續(xù)數(shù)周，以獲得足夠量的NK細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，其特征在于，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為 4-lBBL-mIL-21-K562 細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效和高細(xì)胞毒性的自然殺傷(NK)細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，通過在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體(4-1BBL)和膜固定白介素21(mIL-21)，構(gòu)建新型人工抗原遞呈細(xì)胞4-1BBL-mIL-21-aAPC，如4-1BBL-mIL-21-K562細(xì)胞等，以此作為擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞，從外周血淋巴細(xì)胞中直接擴(kuò)增NK細(xì)胞。流式細(xì)胞分析、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等表明所擴(kuò)增的細(xì)胞NK純度高和細(xì)胞毒性強(qiáng)，具有明顯的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。
文檔編號C12N5/0783GK102559600SQ20111044952
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者余健秀, 朱詩國, 王艷麗 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院