專利名稱：發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種谷氨酸脫氫酶的發(fā)酵制備方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)是谷氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶，它廣泛分布于細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物組織中，是連接碳、氮代謝的重要酶類，催化谷氨酸脫氨生成a-酮戊ニ酸和氨，氨基被用于許多其他氨基酸的合成中。目前，谷氨酸脫氫酶已應(yīng)用到醫(yī)療診斷中，也是制備尿素氮試劑盒(速率法)的必 需酶之一。從1960年開始，國內(nèi)外對(duì)其他細(xì)菌來源的谷氨酸脫氫酶已開始進(jìn)行分離和研究。但對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌中谷氨酸脫氫酶的報(bào)道較少，谷氨酸棒桿菌中的谷氨酸脫氫酶的提取純化相關(guān)報(bào)道很少，國內(nèi)尚未實(shí)現(xiàn)菌株發(fā)酵制備谷氨酸脫氫酶的規(guī)模化生產(chǎn)，致使國內(nèi)研制尿素氮試劑盒所用的谷氨酸脫氫酶大多從國外進(jìn)ロ，因此試劑盒的成本較高，為降低其成本必須解決谷氨酸脫氫酶的制備問題，因而對(duì)谷氨酸脫氫酶的菌株發(fā)酵制備エ藝進(jìn)行深入的研究，將為指導(dǎo)エ業(yè)生產(chǎn)提供重要的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的一種エ藝，本エ藝可以有效提谷氨酸脫氫酶的產(chǎn)量和產(chǎn)品純度，提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的一種エ藝方法，其特征在于，包括如下步驟(I)谷氨酸棒桿菌CQ920的發(fā)酵谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)36h進(jìn)行活化，活化I 2次；將3-4塊0. 5-1. Ocm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)，32°C，180rpm培養(yǎng)10-12h ;培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，控制發(fā)酵溫度及通風(fēng)，發(fā)酵過程中流加10%的尿素控制pH值為7. 5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為IOh左右。(2)谷氨酸脫氫酶粗酶液的制備菌株發(fā)酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌數(shù)次，取定量濕菌體，按比例加入pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4°C用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液。(3)離子交換層析谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含0. 2-0. 6mm NaCl的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分布收集，合并活性部分。⑷疏水層析離子交換層析液用PEG6000濃縮后，上樣于用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH
7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分步收集，合并活性部分。
(5)凝膠過濾層析疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮后上樣于用含0. 2m NaCl的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱SuperdexG-200,用相同的緩沖液洗脫，分步收集，合并活性高的部分。(6)超濾將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4°C離心5~6ho(7)成品取離心后上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品。
本發(fā)明提供的上述以發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特點(diǎn)在于(I)誘變篩選獲得高產(chǎn)谷氨酸脫氫酶菌株，菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定，發(fā)酵液內(nèi)谷氨酸脫氫酶含量高，酶活性高，為后期發(fā)酵エ藝的優(yōu)化及產(chǎn)物的提取奠定了基礎(chǔ)；(2)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入了稀土元素，有效提高了谷氨酸脫氫酶的活性，優(yōu)化后菌株發(fā)酵酶活達(dá)到110U/mL，為國內(nèi)已報(bào)道中最高水平；(3)采用柱層析進(jìn)行谷氨酸脫氫酶的純化，可有效提高終產(chǎn)品的比酶活，同時(shí)降低雜質(zhì)對(duì)產(chǎn)物的影響，有效實(shí)現(xiàn)終產(chǎn)品的穩(wěn)定性和高效性；(4)利用液體發(fā)酵制備谷氨酸脫氫酶，與傳統(tǒng)提取法相比，具有周期短、產(chǎn)量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，制備獲得的谷氨酸脫氫酶的比酶活高于260U/mg。


附圖I為發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶エ藝流程圖，經(jīng)菌株發(fā)酵制備獲得的谷氨酸脫氫酶成品比酶活高于260U/mg。
具體實(shí)施例方式提出以下實(shí)例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)例I谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)36h活化2次；將3塊0. 5-1. Ocm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.5% (単獨(dú)滅菌)，葡萄H 2.5%,玉米漿3 %，硫酸鎂0.4%,磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2 X 10_6，pH值7. 0-7. 2)，32°C，180rpm培養(yǎng)IOh ;培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.8% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調(diào)節(jié)至7. 0-7. 2)，發(fā)酵溫度前期控制為34 °C，中期為36°C，后期為37°C，通風(fēng)控制為前期200r/min，中期250r/min，后期230r/min，發(fā)酵過程中流加10%的尿素控制PH值為7. 5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為IOh左右，發(fā)酵18h后停止。菌株發(fā)酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌2次，取30g濕菌體，加入150ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4°C用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，谷氨酸脫氫酶的酶活為110U/mL。谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合并活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣于用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合并活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣于用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩沖液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合并活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品，比酶活為260. 8U/mg。實(shí)例2谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)36h活化I次；將4塊0. 5-1. Ocm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.8% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖3 %，玉米漿2.5%,硫酸鎂0.4%,磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2 X 10_6，pH 值7. 0-7. 2)，32°C，180rpm培養(yǎng)12h ;培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.8% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調(diào)節(jié)至7. 0-7. 2)，發(fā)酵溫度前期控制為33°C，中期為35°C，后期為37°C，通風(fēng)控制為前期200r/min，中期250r/min，后期230r/min，發(fā)酵過程中流加10%的尿素控制PH值為7. 5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為IOh左右，發(fā)酵18h后停止。菌株發(fā)酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌3次，取30g濕菌體，加入200ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4°C用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，谷氨酸脫氫酶的酶活為112U/mL。谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合并活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣于用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合并活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣于用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩沖液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合并活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品，比酶活為262. 2U/mg0實(shí)例3谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)36h活化2次；將4塊
0.5-1. Ocm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.5%-0.8% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖2.8%，玉米漿3 %，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2X 10_6，pH值7. 0-7. 2),32°C,180rpm培養(yǎng)12h ;培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8 %的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.8% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂 0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. 1%，硫酸鐵 2X10_6，硫酸錳 2X10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3
0.071mmol/L, NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調(diào)節(jié)至7. 0-7. 2)，發(fā)酵溫度前期控制為32°C，中期為34°C，后期為37°C，通風(fēng)控制為前期200r/min，中期250r/min，后期230r/min，發(fā)酵過程中流加10%的尿素控制pH值為7. 5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為IOh左右，發(fā)酵18h后停止。
菌株發(fā)酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌3次，取30g濕菌體，加入150ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4°C用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，谷氨酸脫氫酶的酶活為112. 6U/mL。谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合并活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣于用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合并活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣于用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩沖液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合并活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品，比酶活為261. 5U/mg。實(shí)施例四谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)36h活化2次；將4塊
0.5-1. Ocm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.5% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖3 %，玉米漿3 %，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2 X 10_6，pH值7. 0-7. 2)，32°C，180rpm培養(yǎng)12h ;培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)(尿素0.8% (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調(diào)節(jié)至7. 0-7. 2)，發(fā)酵溫度前期控制為32°C，中期為36°C，后期為37°C，通風(fēng)控制為前期200r/min，中期250r/min，后期230r/min，發(fā)酵過程中流加10%的尿素控制PH值為7. 5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為IOh左右。菌株發(fā)酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌3次，取30g濕菌體，加入240ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4°C用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液，谷氨酸脫氫酶的酶活為112. 5U/mL，發(fā)酵18h后停止。谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合并活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣于用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合并活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣于用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩沖液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合并活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品，比酶活為26 0. 9U/mg。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特征在于，包括如下步驟 (1)發(fā)酵谷氨酸棒桿菌CQ920接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)36h進(jìn)行活化，活化I 2次；將3-4塊0. 5-1. Ocm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)，32°C，180rpm培養(yǎng)10-12h ;培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液以8%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，控制發(fā)酵溫度及通風(fēng)，發(fā)酵過程中流加10%的尿素控制pH值為7. 5左右，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵烈欢ㄖ禃r(shí)開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時(shí)間為IOh左右； (2)粗酶液的制備菌株發(fā)酵液離心，用0.2%的KCl洗滌數(shù)次，取定量濕菌體，按比例加入pH 7. 5 25mm的Tris-HCl緩沖液，菌體懸液在4°C用超聲波細(xì)胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉淀，獲得谷氨酸脫氫酶粗提液； (3)離子交換層析離子交換層析エ藝為谷氨酸脫氫酶粗提液上樣于25mmTris-HCKpH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mmTris_HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分步收集，合并活性部分； (4)疏水層析離子交換層析液用PEG6000濃縮后，上樣于用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分步收集，合并活性部分； (5)凝膠過濾層析疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮后上樣于用含0. 2m NaCl的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200,用相同的緩沖液洗脫,分步收集,合并活性高的部分； (6)超濾將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器于5000r/min，4°C離心 5_6h ； (J)成品取離心后上部超濾液，冷凍干燥，獲得谷氨酸脫氫酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特征在于，步驟(I)所述的種子培養(yǎng)基尿素0. 5 % -0. 8 % (単獨(dú)滅菌)，葡萄糖2^-3%,玉米漿2.5^-3%,硫酸HO. 4%,磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10'硫酸錳2 X 10' pH值7. 0-7. 2 ;發(fā)酵培養(yǎng)基尿素0.5% -0.8% (單獨(dú)滅菌)，葡萄糖2% -3%，玉米漿0.5-% 0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH 值調(diào)節(jié)至 7. 0-7. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特征在于，步驟(I)所述的發(fā)酵溫度前期控制為30-35°C，中期為32-37°C，后期為35-38°C ;通風(fēng)控制為前期150-200r/min,中期 200_250r/min，后期 180_230r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特征在于，步驟(2)所述的谷氨酸脫氫酶制備過程中菌體洗滌次數(shù)為2-3次，濕菌體及緩沖液的比例為1:5-1: 8(m/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特征在于，步驟(3)、(4)、(5)、(6)所述的純化各步操作均加入0. 02%疊氯化鈉以防止雜菌污染。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的發(fā)酵法制取谷氨酸脫氫酶的エ藝，其特征在于，制備獲得的谷氨酸脫氫酶的比酶活高于260U/mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)菌株發(fā)酵制取谷氨酸脫氫酶的方法，其制備方法如下經(jīng)過谷氨酸棒桿菌發(fā)酵、制備粗酶液、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、超濾、濃縮干燥后，獲得谷氨酸脫氫酶成品，其比酶活高于260U/mg，酶活回收率高于14％，純化倍數(shù)約75倍。本發(fā)明采用上述方法制備谷氨酸脫氫酶，設(shè)備簡單，方法易行，操作安全，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/06GK102787106SQ20111044971
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者高聚霞 申請(qǐng)人:西藏金稞集團(tuán)有限責(zé)任公司