專利名稱：Figla基因啟動(dòng)子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及動(dòng)物干細(xì)胞的體外增殖、分化、分離，特別涉及 Figla基因啟動(dòng)子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞和生殖細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化的研究是生命科學(xué)研究的重要課題之一。在動(dòng)物繁殖育種中，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的遺傳完全依賴于生殖細(xì)胞來完成；在人類，由于雌性生殖細(xì)胞——卵子的發(fā)生、成熟障礙等引起的不孕癥更是困擾眾多患者的一個(gè)現(xiàn)實(shí)問題；在基礎(chǔ)研究中，卵子更是發(fā)育生物學(xué)研究的最重要研究對(duì)象之一；因此雌性生殖的發(fā)生、分化的研究，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的意義。然而高等哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、分化完全在體內(nèi)完成，因此很難動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)地檢測(cè)和研究其中的分子事件(Hua J， Sidhu KS. Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells[J], Stem Cells and Development,2008，17 :399-411.)。干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。胚胎干細(xì)胞 (ES細(xì)胞或ESCs)是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或原始生殖細(xì)胞(PGCs)分離而來的多能性干細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞的獨(dú)特生物學(xué)特性，使胚胎干細(xì)胞在細(xì)胞替代治療、組織器官修復(fù)與重建、基因治療以及發(fā)育生物學(xué)模型、新藥開發(fā)和毒理實(shí)驗(yàn)等，幾乎所有的生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域均具有重要的意義。近年來，科學(xué)家從多種來源和采用外源基因轉(zhuǎn)染等方法也獲得了類似胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞?？梢詫⑺镁哂蠩S細(xì)胞特性的細(xì)胞通稱為多能性干細(xì)胞。近年來，Hubner 等(Hubner K, Fuhrmann G, Christenson LK et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells [J]. Science，2003，300 1251-1256.)， Toyooka 等(Toyooka Y，Tsunekawa N，Akasu R et al. Embryonicstem cells can form germ cells in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100 :11457-11462.)，Geijsen 等(Geijsen N，Horoschak M，Kim K et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells [J] · Nature，2004，427 :148-154.)分別在 《kience》和《Nature》等國際頂尖雜志上報(bào)道在ES細(xì)胞分化為類胚體(EBs)及其進(jìn)一步分化的過程中，存在生殖系細(xì)胞，進(jìn)一步甚至可能分化為卵母細(xì)胞或精子。Lacham-kaplm等 (Lacham-Kap1an 0, Chy H, Trounson A. Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes [J], Stem Cells，2006，24 :266-273.)用新生鼠睪丸細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠ES 細(xì)胞源的EBs，其進(jìn)一步發(fā)育為含有卵母細(xì)胞的卵巢樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)Figl α和ΖΡ3等卵母細(xì)胞特異性標(biāo)志。發(fā)現(xiàn)雄性小鼠ES細(xì)胞在維甲酸(RA)誘導(dǎo)下既可能分化為精子也可能分化為卵母細(xì)胞(Kerkis AiFonseca SA, Serafim RC et al. In vitro differentiation of male mouse embryonic stem cells into both presumptive sperm cells and oocytes[J]. Cloning Stem Cells，2007，9 :535-548. )。Chen 等(Chen HF，Kuo HC，Chien C-L etal. Derivation, characterization and differentiation of human embryonic stem cells comparing serum-containing versus serum-free media and evidence of germ cell differentiation [J]. Human Reproduction, 2007, 22 :567-577.)發(fā)現(xiàn)人類 ES 細(xì)胞在體外可能自發(fā)分化為卵母細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。Hua等(Hua J，Sidhu KS. Coaxing hESC to form oocyte-like structures by co-culture with testicular extract and hormones[J]. The Open Stem Cell Journal，2011，3 :34-45.)運(yùn)用睪丸提取物結(jié)合生殖激素誘導(dǎo)人類ES 細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化，可以得到一些具有卵母細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞。然而，已有的報(bào)道誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化尤其卵母細(xì)胞分化的數(shù)量有限，重復(fù)性差，其中很重要的原因在于缺少特殊的篩選標(biāo)記。導(dǎo)致誘導(dǎo)過程長，效果不穩(wěn)定，因此很難在體內(nèi)外深入探討相關(guān)細(xì)胞因子、微環(huán)境和一些關(guān)鍵基因在干細(xì)胞向生殖細(xì)胞發(fā)育分化過程中的作用和機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，生殖系a因子(Figla)是第一個(gè)生殖細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)早期卵泡發(fā)育中的關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控，能直接影響原始卵泡的形成(Choi Y， Rajkovic A.Genetics of early mammalian folliculogenesis[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2006,63(5) :579-590 ；Soyal S Μ, Amleh A, Dean J.FIGa , a germ cell—specific transcription factor required for ovarian follicle formatiaon[J]· Development，2000，127 :4645-4654.)。小鼠的 Figla 最早可以在 13. 5d的雌性胚胎的生殖嵴中找到，并且在卵泡和生殖細(xì)胞簇的發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)， 對(duì)于Zp基因的表達(dá)、透明帶的形成具有調(diào)節(jié)作用(Huntriss J, Gosden R, Hinkins M et al. Isolation, characterization and expression of the human Factor In the Germline alpha (FIGLA) gene in ovarian follicles and oocytes[J]. Molecular Human Reproduction, 2002，8 (12) :1087-1095.)。對(duì)于雌性胚胎，缺乏Figla不會(huì)影響生殖細(xì)胞的遷移和增殖，生殖嵴也會(huì)正常形成出現(xiàn)，但是出生后卵母細(xì)胞會(huì)迅速退化消失，不能形成原始卵泡。而且敲除Figla基因會(huì)導(dǎo)致雌鼠不孕(Liang L，Soyal SM, Dean J. FIG α , a germ cell specific transcription factor involved in the coordinate expression of the zona pellucida genes[J]· Development，1997，124 :4939-4949.)。人類的 Figla缺失或突變可能會(huì)引起不同程度的卵巢發(fā)育或卵母細(xì)胞成熟障礙，促使卵巢早衰 (POF)、不孕的發(fā)生(Suzumori N, Pangas SA, Rajkovic A et al. Candidate genes for premature ovarian failure[J]. Current medicinal chemistry,2007,14(3) :353-357 ； Van Dooren MF, Bertoli-Avella AM, Oldenburg RA. Premature ovarian failure and gene polymorphisms[J]. Current opinion in obstetrics & gynecology,2009,21 (4) 313-317.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于Figla基因啟動(dòng)子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用，構(gòu)建包含F(xiàn)igla基因啟動(dòng)子序列的標(biāo)記基因，為多能性干細(xì)胞向卵母細(xì)胞分化提供新的篩選標(biāo)記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種Figla基因啟動(dòng)子序列，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示?；贔igla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的標(biāo)記基因，在SEQ. ID. NO. 1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列的下游連接熒光標(biāo)記基因。所述的基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的標(biāo)記基因，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。一種基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的表達(dá)載體，包含SEQ. ID. NO. 1所示的Figla 基因啟動(dòng)子序列，在Figla基因啟動(dòng)子序列的下游連接熒光標(biāo)記基因EGFP，在EGFP的下游連接抗生素篩選基因neor。所述的基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的表達(dá)載體為pFigla-EGFP表達(dá)載體，通過Mil和BamHI酶切位點(diǎn)將Figla基因啟動(dòng)子克隆到pEGFP-Ι表達(dá)載體。Figla基因啟動(dòng)子序列攜帶熒光標(biāo)記基因后轉(zhuǎn)染多能性干細(xì)胞，以其作為多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成雌性生殖細(xì)胞的篩選標(biāo)記的應(yīng)用。一種多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，包括以下步驟1)克隆如SEQ. ID. NO. 1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列，并將Figla基因啟動(dòng)子序列通過Mil和BamHI酶切位點(diǎn)將Figla基因啟動(dòng)子克隆到pEGFP-Ι表達(dá)載體，得到 pFigla-EGFP表達(dá)載體；2)將待轉(zhuǎn)染的多能性干細(xì)胞與pFigla-EGFP表達(dá)載體共同孵育，將pFigla-EGFP 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到多能性干細(xì)胞之中；轉(zhuǎn)染4 后傳代，使用包含200 μ g/mL G418的培養(yǎng)液篩選G418抗性的克隆，篩選 2周后，得到具有G418抗性的多能性干細(xì)胞克??；3)將處于對(duì)數(shù)生長期的G418抗性的多能性干細(xì)胞用胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法除去飼養(yǎng)層細(xì)胞，用誘導(dǎo)基礎(chǔ)液重懸多能性干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到不貼壁的皿中培養(yǎng)2 3d，然后將其轉(zhuǎn)入到鋪附有明膠的培養(yǎng)板中，添加0. 1 μ mol/L維甲酸貼壁誘導(dǎo) 5 6d ；誘導(dǎo)基礎(chǔ)液為H-DMEM培養(yǎng)基+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺 +1%體積濃度的非必需氨基酸+15%體積濃度的胎牛血清；誘導(dǎo)5 6d后，通過流式細(xì)胞儀分選純化出GFP陽性細(xì)胞，通過RT-PCR進(jìn)行生殖特異性基因表達(dá)的檢測(cè)，篩選的GFP陽性細(xì)胞即為分化的雌性生殖細(xì)胞。所述的傳代為將多能性干細(xì)胞接種到以10 μ g/mL絲裂霉素C處理池的2 5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待克隆增殖到65 70%時(shí)融合時(shí)傳代；培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15%體積濃度的FBS。所述的多能性干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞或成年組織來源的具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明提供了 Figla基因的啟動(dòng)子區(qū)的序列，F(xiàn)irstEF online分析該區(qū)域存在 1個(gè)CpG島，位于-155 -58bp。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示Figla基因_856bp至+69bp區(qū)域內(nèi)可能包含F(xiàn)igla基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域且參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子序列在多能性干細(xì)胞分化成雌性生殖細(xì)胞之后能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。進(jìn)一步，可以將該啟動(dòng)子序列用熒光蛋白基因標(biāo)記后作為多能性干細(xì)胞分化成雌性生殖干細(xì)胞的篩
5選標(biāo)記。2、本發(fā)明構(gòu)建了 pFigla-EGFP表達(dá)載體，將pFigla_EGFP轉(zhuǎn)染小鼠卵巢原代細(xì)胞， 標(biāo)記基因GFP (fluorescent green protein)表達(dá)，而轉(zhuǎn)染MEF細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞， 表明該表達(dá)載體具有雌性生殖細(xì)胞特異性啟動(dòng)的特點(diǎn)，是一種啟動(dòng)子特異性啟動(dòng)表達(dá)的載體。3、本發(fā)明將pFigla-EGFP轉(zhuǎn)染mESCs，構(gòu)建了攜帶pFigla-EGFP的mES細(xì)胞系，此 mESCs的生長特性未發(fā)生變化，克隆致密，邊緣光滑，呈堿性磷酸酶陽性，表達(dá)多能性標(biāo)記基因0ct4，Sox2, Klf4，Nanog和C_myc。懸浮培養(yǎng)3d可形成EBs，具有三胚層分化潛能，可形成畸胎瘤。4、攜帶pFigla-EGFP的mESCs可進(jìn)行體外分化，將懸浮培養(yǎng)3d的EBs移至鋪有明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)，多數(shù)EBs可在Mh內(nèi)貼壁生長。經(jīng)RA誘導(dǎo)，第2 3d時(shí)，在EBs生長暈周圍出現(xiàn)較多的圓形細(xì)胞，體積較大，為類原始生殖細(xì)胞。此時(shí)在熒光顯微鏡下可觀察到部分細(xì)胞表達(dá)GFP，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，GFP陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記基因Vasa和減數(shù)分裂特異性基因kp3，第6d時(shí)，通過流式細(xì)胞儀分選純化出GFP陽性細(xì)胞(5. 2% )，進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)Figla和GFP，而對(duì)照組不表達(dá)。生殖特異性基因Vasa，減數(shù)分裂特異性基因和Mra8，以及雌性生殖細(xì)胞特異性基因Figla和Zp3在GFP陽性細(xì)胞的表達(dá)顯著高于未分化的mESCs。5、攜帶pFigla-EGFP的mESCs可進(jìn)行體內(nèi)分化，在與卵巢細(xì)胞共培養(yǎng)的微環(huán)境下， 攜帶pFigla-EGFP的mESCs在體內(nèi)可以向生殖細(xì)胞分化。石蠟組織切片免疫熒光染色顯示， 在移植物中存在GFP陽性細(xì)胞，且同時(shí)表達(dá)Vasa，StraS和等生殖細(xì)胞的標(biāo)記基因，部分mESCs可分化發(fā)育為體積較大的類卵母細(xì)胞，表達(dá)Figla和Zp3。


圖1是Figla基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是重組質(zhì)粒pFigla-EGFP的質(zhì)粒圖譜；圖3是Mil和BamHI雙酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pFigla-EGFP ；圖4-1 4-2分別是熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒pFigla-EGFP的報(bào)告基因在MEF和卵巢原代細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果；圖5是轉(zhuǎn)染pFigla-EGFP的mESCs顯微觀察圖；圖6-1是轉(zhuǎn)染pFigla-EGFP的mESCs形成的EBs的顯微觀察，圖6_2為擴(kuò)增其三胚層基因之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果圖；圖7-1是熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染了 pFigla-EGFP的mESCs誘導(dǎo)后的報(bào)告基因GFP的表達(dá)結(jié)果；圖7-2是其mRNA的GFP基因擴(kuò)增之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果圖；圖8是免疫熒光染色顯示轉(zhuǎn)染了 pFigla-EGFP的mESCs體外分化后GFP及生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)結(jié)果；圖9是對(duì)轉(zhuǎn)染了 pFigla-EGFP的mESCs誘導(dǎo)后進(jìn)行流式細(xì)胞分選的結(jié)果；圖10是定量PCR檢測(cè)流式細(xì)胞儀分選的GFP陽性細(xì)胞的生殖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的結(jié)果；圖11是免疫熒光染色顯示轉(zhuǎn)染了 pFigla-EGFP的mESCs體內(nèi)分化后GFP及生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例證對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、Figla基因啟動(dòng)子序列的克隆DFigla基因5’端調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析以Figla基因翻譯起始密碼子ATG的第一個(gè)堿基A為+1，選取5'端上游2000bp 的DNA片段作為CpG島分析、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析、啟動(dòng)子分析及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析用序列。并利用在線啟動(dòng)子分析軟件(Promoter 2.0,Promoter ScanII,BDGP)獲取基因啟動(dòng)子區(qū)數(shù)據(jù)信息。Promoter 2. 0 Prediction (http://www. cbs. dtu. dk/services/Promoter/)予頁測(cè) Figla基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于_300bp ；PROMOTER SCAN(http://thr. cit. nih. gov/molbio/proscan/)查詢結(jié)果顯示上述 Figla基因調(diào)控區(qū)存在保守的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括AP-2，T-Ag，Spl，USF和RXR- α， Figla啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)示意如圖1所示。FirstEF online (http //rulai. cshl. org/tools/FirstEF/) ^1/ IS ^ 5 1 個(gè)CpG島，位于-155 -58bp(參見圖1)；綜合上述各生物信息學(xué)分析結(jié)果，提示_856bp至+69bp區(qū)域內(nèi)可能包含F(xiàn)igla基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域且參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。2)Figla啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因載體構(gòu)建利用I^rimer Premier 5. 0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含啟動(dòng)子的_856bp區(qū)域與 +69bp區(qū)域之間的序列，設(shè)計(jì)上、下游引物并選擇合適的限制性內(nèi)切酶，具體設(shè)計(jì)以下引物上游引物5 ‘ CGGTCGACCCCCATCTAGCCTCCACACG 3 ‘下游引物5‘ GCGGATCCGTCAAGACCACGGGCAGCAG 3 ‘上游引物中劃線部分為MlI酶切位點(diǎn)，下游引物中下劃線部分為BamHI酶切位占.
^ \\\ Figla基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μ L，其中包括10Xbuffer 1. 5μ L, MgCl2(25mmol/L) 1. 6μ L, dNTP(2· 5mmol/L) 1· 2 μ L，Taq DNA 聚合酶 0. 1 μ L，上、下游引物 (10 μ mol/L)各0. 3 μ L，0. 5 μ L小鼠基因組DNA (基因組提取試劑盒提取的小鼠皮膚組織， 獲得基因組DNA作為模板)，ddH209. 5 μ L。反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，共；35個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)延伸10min，4°C保存。回收并純化PCR產(chǎn)物，得到Figla啟動(dòng)子片段，然后將PCR產(chǎn)物、pEGFP-Ι真核表達(dá)載體分別用Mil和BamHI雙酶切后連接，將其克隆入pEGFP-Ι真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pFigla-EGFP。將重組載體pFigla-EGFP進(jìn)行MlI和BamHI雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，在925bp和4130bp處出現(xiàn)特異性條帶。
所構(gòu)建的pFigla-EGFP載體的質(zhì)粒圖譜如圖2所示，可以看到Figla啟動(dòng)子序列之后連接有EGFP綠色熒光蛋白基因，并且還帶有抗生素篩選基因nero。pFigla-EGFP載體的Mil和BamHI雙酶切鑒定結(jié)果如3所示，可以看到克隆到的 Figla啟動(dòng)子目標(biāo)片段和剩余的pEGFP-Ι載體骨架。測(cè)序后得到Figla啟動(dòng)子序列，核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。2、Figla啟動(dòng)子序列的特異性啟動(dòng)將pFigla-EGFP轉(zhuǎn)染原代小鼠卵巢細(xì)胞，報(bào)告基因GFP(f luorescent green protein)表達(dá)(圖4-2所示)，而轉(zhuǎn)染MEF，未發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞(圖4_1所示)，表明啟動(dòng)子特異性啟動(dòng)表達(dá)，啟動(dòng)子載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染方法為待轉(zhuǎn)染的原代小鼠卵巢細(xì)胞和MEF 以IX IO5的密度接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，24h后按照!^rmentas公司的TurboFect 轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行pFigla-EGFP重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。將6 μ g質(zhì)粒加入Iml opti-MEM培養(yǎng)液中，再加入 12 μ 1 TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，溫和混勻。室溫孵育20min后，將TurboFect/DNA混合物均勻加入培養(yǎng)皿內(nèi)。轉(zhuǎn)染后3-4h，更換為H-DMEM+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+15%體積濃度的胎牛血清。3、mESCs 的培養(yǎng)及 pFigla-EGFP 的轉(zhuǎn)染1)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染pFigla-EGFP將小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)接種到以10 μ g/mL絲裂霉素C處理2h的2 5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)作為飼養(yǎng)層(密度為1 2 X IO5個(gè)/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C、 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待mESCs克隆增殖約70%融合時(shí)傳代；培養(yǎng)液成分為H-DMEM+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15%體積濃度的胎牛血清；待轉(zhuǎn)染的mESCs細(xì)胞以IX IO5的密度接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，24h后按照!^rmentas 公司的TurboFect 轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行pFigla-EGFP重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。具體為將6μ g質(zhì)粒加入Iml opti-MEM培養(yǎng)液中，再加入12 μ 1 TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，溫和混勻。室溫孵育20min 后，將TurboFect/DNA混合物均勻加入培養(yǎng)皿內(nèi)。轉(zhuǎn)染后3_4h，更換為H-DMEM+0. lmmol/L β-巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15% FBS培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 后傳代，使用200 μ g/mL G418對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選2周得到 G418抗性克隆(在篩選前3代，有大量細(xì)胞死亡，集落也不致密，隨著繼續(xù)篩選，死亡細(xì)胞減少，集落形態(tài)逐漸與野生型ESCs接近集落隆起，細(xì)胞排列緊密，呈橢圓形或鳥巢狀，邊緣清楚，折光性強(qiáng))。將G418抗性克隆消化后以單個(gè)細(xì)胞接種96孔板，擴(kuò)增培養(yǎng)后得到單克隆的攜帶 pFigla-EGFP重組質(zhì)粒的mESCs。轉(zhuǎn)染pFigla-EGFP的mESCs顯微觀察圖如圖5所示。4、攜帶pFigla-EGFP的小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)的誘導(dǎo)分化將處于對(duì)數(shù)生長期重組的mESCs用0. 05%胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法除去MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞，1500r/min離心5min，用誘導(dǎo)基礎(chǔ)液重懸ESCs，轉(zhuǎn)移到不貼壁的皿中培養(yǎng)3d，以形成類胚體(EBs)；多數(shù)EBs可在Mh內(nèi)貼壁生長。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，EBs周圍的細(xì)胞逐漸向外移行生長；圖6-1是轉(zhuǎn)染pFigla-EGFP的mESCs形成的EBs的顯微觀察，圖6-2為擴(kuò)增其三胚層基因之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果誘導(dǎo)液成分為H-DMEM培養(yǎng)液+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺 +1%非必需氨基酸+15%體積濃度的胎牛血清；將經(jīng)過懸浮培養(yǎng)3d后的EBs以吸胚管轉(zhuǎn)入鋪有0. 1 %明膠鋪附的48孔培養(yǎng)板中， 添加維甲酸(RA)貼壁誘導(dǎo)。經(jīng)RA誘導(dǎo)，第2 3d時(shí)，在EBs生長暈周圍出現(xiàn)較多的圓形細(xì)胞，體積較大，為類原始生殖細(xì)胞，此時(shí)在熒光顯微鏡下可觀察到部分細(xì)胞表達(dá)GFP，具體如圖7-1所示，由于 Figla是特異性的在雌性生殖細(xì)胞進(jìn)行啟動(dòng)表達(dá)，EGFP基因被表達(dá)就表明是Figla啟動(dòng)子序列啟動(dòng)了 EGFP基因的表達(dá)，那么發(fā)出熒光的細(xì)胞就是已分化的雌性生殖細(xì)胞；圖7-2是其mRNA/K平的 GFP (上游弓丨物gacgggaactacaagacacg,下游弓丨物cgaaagggca gattgtgtg) 禾口 Figla(上游弓丨物ctctgctgcc cgtggtctt,下游弓丨物ctgctctgtg gtagaaacgg c)基因擴(kuò)增之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果圖；結(jié)果顯示經(jīng)RA誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)Figla和GFP，而作為對(duì)照的未發(fā)出熒光的mESCs組不表達(dá)Figla和GFP。進(jìn)一步對(duì)于GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果表明GFP陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記基因Vasa和減數(shù)分裂特異性基因(參見圖8)；在RA誘導(dǎo)第6d時(shí)，通過流式細(xì)胞儀分選純化出5. 2%的GFP陽性細(xì)胞，其具體的結(jié)果如9所示，結(jié)果表明mESCs在向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)后，5. 2%的細(xì)胞啟動(dòng)了 Figla基因的表達(dá)；進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)生殖特異性基因Vasa，減數(shù)分裂特異性基因和 StraS,以及雌性生殖細(xì)胞特異性基因Figla和Zp3在GFP陽性細(xì)胞的表達(dá)顯著高于未分化的mESCs，上述檢測(cè)結(jié)果如圖10所示。這表明攜帶pFigla-EGFP的mESCs可進(jìn)行體外分化，而且能夠分化成GFP表達(dá)的類雌性生殖細(xì)胞。這些表達(dá)GFP的細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞特異基因，證實(shí)GFP陽性細(xì)胞為類雌性生殖細(xì)胞。5、攜帶pFigla-EGFP的mESCs的體內(nèi)移植將消化收集到的mESCs與原代小鼠卵巢細(xì)胞混合，離心形成細(xì)胞團(tuán)塊，移至6 8 周齡白消安藥物處理的小鼠左側(cè)腎被膜下，1個(gè)月后處死小鼠，收集移植的細(xì)胞團(tuán)塊。移植的細(xì)胞團(tuán)塊經(jīng)石蠟組織切片染色及免疫熒光染色顯示，在移植物中存在GFP 陽性細(xì)胞，且同時(shí)表達(dá)Vasa，Stra8和Scp3，部分mESCs可分化發(fā)育為體積較大的類卵母細(xì)胞，表達(dá)Figla和Zp3。表明轉(zhuǎn)染pFigla-EGFP的mESCs在體內(nèi)與卵巢細(xì)胞共培養(yǎng)的微環(huán)境下可向雌性生殖細(xì)胞分化，上述檢測(cè)結(jié)果如圖11所示。
權(quán)利要求
1.一種Figla基因啟動(dòng)子序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2.一種基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的標(biāo)記基因，其特征在于，在SEQ. ID. NO. 1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列的下游連接熒光標(biāo)記基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的標(biāo)記基因，其特征在于，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。
4.一種基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，包含SEQ. ID. NO. 1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列，在Figla基因啟動(dòng)子序列的下游連接熒光標(biāo)記基因EGFP，在 EGFP的下游連接抗生素篩選基因neor。
5.如權(quán)利要求4所述的基于Figla基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體為pFigla-EGFP表達(dá)載體，通過MlI和BamHI酶切位點(diǎn)將Figla基因啟動(dòng)子克隆到 pEGFP-Ι表達(dá)載體。
6.Figla基因啟動(dòng)子序列攜帶熒光標(biāo)記基因后轉(zhuǎn)染多能性干細(xì)胞，以其作為多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成雌性生殖細(xì)胞的篩選標(biāo)記的應(yīng)用。
7.一種多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟1)克隆如SEQ.ID. NO. 1所示的Figla基因啟動(dòng)子序列，并將Figla基因啟動(dòng)子序列通過MlI和BamHI酶切位點(diǎn)將Figla基因啟動(dòng)子克隆到pEGFP-Ι表達(dá)載體，得到pFigla-EGFP 表達(dá)載體；2)將待轉(zhuǎn)染的多能性干細(xì)胞與pFigla-EGFP表達(dá)載體共同孵育，將pFigla-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到多能性干細(xì)胞之中；轉(zhuǎn)染4 后傳代，使用包含200 μ g/mL G418的培養(yǎng)液篩選G418抗性的克隆，篩選2周后，得到具有G418抗性的多能性干細(xì)胞克??；3)將處于對(duì)數(shù)生長期的G418抗性的多能性干細(xì)胞用胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法除去飼養(yǎng)層細(xì)胞，用誘導(dǎo)基礎(chǔ)液重懸多能性干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到不貼壁的皿中培養(yǎng)2 3d，然后將其轉(zhuǎn)入到鋪附有明膠的培養(yǎng)板中，添加0. lymol/L維甲酸貼壁誘導(dǎo) 5 6d ；誘導(dǎo)基礎(chǔ)液為H-DMEM培養(yǎng)基+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%體積濃度的非必需氨基酸+15%體積濃度的胎牛血清(FBS)；誘導(dǎo)5 6d后，通過流式細(xì)胞儀分選純化出GFP陽性細(xì)胞，通過RT-PCR進(jìn)行生殖特異性基因表達(dá)的檢測(cè)，篩選的GFP陽性細(xì)胞即為分化的雌性生殖細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，所述的傳代為將多能性干細(xì)胞接種到以10 μ g/mL絲裂霉素C處理池的2 5 代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待克隆增殖到65 70%時(shí)融合時(shí)傳代；培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1 %體積濃度的非必需氨基酸+lOng/mL白血病抑制因子+15%體積濃度的FBS。
9.如權(quán)利要求7所述的多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的篩選及分離純化方法，其特征在于，所述的多能性干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞或成年組織來源的具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了Figla基因啟動(dòng)子序列及其構(gòu)建的標(biāo)記載體和應(yīng)用，生物信息學(xué)分析結(jié)果提示Figla基因-856bp至+69bp區(qū)域內(nèi)可能包含F(xiàn)igla基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域且參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子序列在多能性干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化之后能夠啟動(dòng)下游標(biāo)記基因-EGFP的表達(dá)。進(jìn)一步，可以將該啟動(dòng)子序列調(diào)控的熒光基因(EGFP)標(biāo)記作為多能性干細(xì)胞分化成雌性生殖細(xì)胞的篩選標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102533764SQ20111044985
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者華進(jìn)聯(lián), 孫軍偉, 胡玥 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)