專利名稱：攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白及其重組表達(dá)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于融合蛋白及其重組表達(dá)方法與應(yīng)用，特別是涉及一種攜帶牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白及其重組表達(dá)方法與其在牛病毒性腹瀉病毒的ELISA檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)屬于黃病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，為單股正鏈RNA病毒，與羊邊界病病毒(Border diseasevirus, BDV)以及豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)(殷震，劉景華.動物病毒學(xué)[M].第2版.科學(xué)出版社，1997. 631-645)。BVDV感染往往是亞臨床性的或?qū)е螺p微和非特異性臨床癥狀。然而，經(jīng)胎盤感染可產(chǎn)出免疫耐受的持續(xù)性感染牛犢，這些持續(xù)感染動物終生帶毒，持續(xù)排毒，成為牛群中的重要傳染源，加重牛群的感染(ffeiland E. Ahl R.Stark et al. A second envelope lycoproteinmediate neutralization of a pestivirus hog cholera virus [J]Virol,1992, (66) 3677-3682)。BVDV的感染分布全球，雖然感染率不同，但感染往往在許多國家流行，持續(xù)性感染的牛(PI)最高可達(dá)到1-2%，抗體陽性的?？蛇_(dá)60-85% (Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus(BVDV) infections. Vet Microbiol, 1999,64 (2-3) :89-107)。長期以來，該病一直嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，同時BVDV還是牛源生物制品(血清、凍精、冷凍胚胎及疫苗等)的常在污染源，給畜牧業(yè)和相關(guān)商業(yè)領(lǐng)域造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”為病毒中和試驗(Edwards S. The diagnosis of bovine virus diarrhoea-mucosal disease in cattle. Rev Sci Tech,1990,9 (1) :115-30),此方法敏感且特異，但需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)且勞動量大。而ELISA方法檢測BVDV操作簡便， 費用低，可用于大批量樣本的檢疫，非常適用于臨床診斷和檢疫。傳統(tǒng)的ELISA試劑盒基于BVDV感染的細(xì)胞，但BVDV在組織中產(chǎn)生的蛋白量較低，很難獲得充足數(shù)量的純蛋白質(zhì)用于 BVDV 的診斷(Justewicz DM, Magar R, Marsolais G, et al. Bovine viral diarrhea virus-infected MDBK monolayer as antigen in enzyme—linked immunosorbent assay (ELISA) for the measurement of antibodies in bovine sera. Vet. Immunol. Immunopathol,1987，14(4) :377-384)。在病毒蛋白中，結(jié)構(gòu)蛋白EO和E2，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3已被確定為BVDV的主要免疫原(Bolin SR. Immunogens of bovine viral diarrhea virus. Vet. Microbiol, 1993, 37(3-4) :263-271)。非結(jié)構(gòu)蛋白NS3在瘟病毒屬內(nèi)保守，行使相似的功能，在病毒增殖過程中，NS3蛋白出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，直接參與病毒蛋白的加工過程。該蛋白具有蛋白酶活性 (Protease)和解旋酶活性(Helicase)。NS3蛋白是一種免疫優(yōu)勢蛋白，在自然感染或弱毒活疫苗免疫后的動物中都可以產(chǎn)生針對NS3蛋白的抗體(Brown LM, Papa RA, Frost MJ， et al. A single amino acid is critical for the expression of B—cell epitopes on the helicase domain of the pestivirus NS3protein. Virus Res，2002，84(1-2) 111-1 )，具有重要的診斷價值。同時，由于NS3蛋白本身的非結(jié)構(gòu)性質(zhì)，動物在接種傳統(tǒng)滅活疫苗后，NS3抗體的檢測可以區(qū)分疫苗接種或自然感染的動物。很多研究人員建議由 NS3作為診斷檢測試劑，便于疫苗接種或NS3血清學(xué)監(jiān)控天然感染(Sandvik T. Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattle.Vet Microbiol,1999,64(2-3) :123-34 ；Reddy JR, Kwang J, Okwumabua 0， et al.Application of recombinant bovine viral diarrhea virus proteins in the diagnosis of bovine viral diarrhea infection in cattle.Vet Microbiol,1997, 57(2-3) :119-33 ；Deregt D, Masri SA, Cho HJ, et al. Monoclonal antibodies to the p80/125gp53proteins of bovine viral diarrhea virus their potential use as diagnostic reagents. Can J Vet Res, 1990,54(3) :343-348)。近十多年來，國外已有表達(dá)NS3蛋白或其截短片段作為診斷抗原，建立ELISA診斷方法用于檢測牛群中BVDV抗體的報道。而且hth等在2006年通過多種重組ELISA方法的比較確定了 NS3抗原可以檢測到由病毒中和實驗和其它結(jié)構(gòu)蛋白ELISA方法判定為陰性的樣品中的抗BVDV抗體 (Chimeno Zoth S,Taboga 0. Multiple recombinant ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus antibodies in cattle sera. J Virol Methods,2006,138 (1-2) 99-108)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組診斷抗原，涉及一種攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白。本發(fā)明所提供的攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白，是在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的氨基(N)端連接有折疊酶DsbA 的融合蛋白。其中，所述DsbA自氨基端(N端)位與氧化還原功能相關(guān)的兩個半胱氨酸(Cys) 突變成絲氨酸(Ser)，目的是使目的基因與突變后的DsbA融合，實現(xiàn)胞內(nèi)可溶性有活性的高表達(dá)(表達(dá)量大于30% )。具體來講，所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白，命名為DsbA/BVDV NS3，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID No 1 ；2)將序列表中SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有絲氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ IDNo :1由563個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_215位為折疊酶DsbA的氨基酸殘基序列，自氨基端第218-561位為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的氨基酸殘基序列。編碼上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合蛋白的基因 (DsbA/BVDVNS3)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，它是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID No 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No 1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID No 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有絲氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. IXSSPE(或0. 1 X SSC) ,0. 1 % SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID No 2由1689個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1-1689位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第1-645 位堿基編碼折疊酶DsbA，自5’端第652-1683位堿基編碼牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增上述融合蛋白編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白 NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的重組表達(dá)方法。本發(fā)明所提供的上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的重組表達(dá)方法，是將含有上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中，經(jīng)表達(dá)、純化得到攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白。在上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的重組表達(dá)方法中，所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因可采用轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增得到，用于擴(kuò)增該基因的上、下游引物序列分別如序列表中SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。序列表中SEQ ID No :1由33個堿基組成，SEQ ID No 2由31個堿基組成，其中 SEQ ID No 1自5’端的第1位至第6位堿基為BagII酶切位點，SEQ ID No 2自5’端第1 位至第6位堿基為NheI酶切位點。用于構(gòu)建含有上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種攜帶折疊酶DsbA基因的原核表達(dá)載體 pET-DsbA。其中，以pET-DsbA為出發(fā)載體構(gòu)建的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體為pET-DsbA-NS3。所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因位于原核表達(dá)載體pET-DsbA多克隆位點處的BagII和Nhe I限制性酶切位點之間。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌具體可為BL21 (Rosetta)、BL21 (DE3)、BL21 (DE3, plysS)，E. coli JM109, E. coli HBlOl 或 E. coli ToplO 等，優(yōu)選為 BL21 (Rosetta)。其中，以大腸桿菌BL21 (Rosetta)為出發(fā)菌株構(gòu)建的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體pET-DsbA-NS3的工程菌為 BL21 (Rosetta) /DsbA_NS3。上述重組表達(dá)載體和工程菌均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有本發(fā)明攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。所述宿主為大腸桿菌時，需加入終濃度為0. 1-0.3% (優(yōu)選為0.2%)的葡萄糖和 0. 8mM-l. 2mM(優(yōu)選為ImM) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時間為1_5小時。所述對誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化的方法優(yōu)選為鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化。本發(fā)明提供了一種攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的融合蛋白是將牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的氨基(N)端連接折疊酶DsbA后得到的融合蛋白。所述DsbA去掉了信號肽，同時將 DsbA與氧化還原功能相關(guān)的兩個半胱氨酸(Cys)突變成絲氨酸(Ser)，經(jīng)過突變后的DsbA 與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合可實現(xiàn)NS3基因的胞內(nèi)可溶性有活性的高表達(dá)(表達(dá)量大于30%)。本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)方法中采用攜帶T7啟動子和 DsbA基因的pET-DsbA表達(dá)載體，同時選用凝血酶切割位點作為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)基因的插入位點，且由于該基因的編碼蛋白是非糖基化蛋白，因而表達(dá)的牛病毒性腹瀉病毒NS3免疫優(yōu)勢蛋白具有很好的抗原性，可用于牛病毒性腹瀉病毒的ELISA檢測，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為牛病毒性腹瀉病毒NS3蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2為克隆載體pMD18-T-NS3的PCR鑒定結(jié)果圖3為重組表達(dá)載體pET-DsbA_NS3的PCR鑒定結(jié)果
圖4重組表達(dá)載體pET-DsbA_NS3的測序結(jié)果圖5為攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的12% SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果圖6為攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白表達(dá)上清經(jīng)純化濃縮后的12% SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果圖7為間接ELISA測定牛病毒性腹瀉病毒抗體的結(jié)果
具體實施例方式實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白及其重組表達(dá)一、攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的擴(kuò)增1、引物設(shè)計
根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的mRNA序列，設(shè)計用于擴(kuò)增牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)基因的上、下游引物Pl和P2，其中在上游引物Pl中加入BagII 酶切位點，下游引物P2中加入NheI酶切位點，具體的引物序列為Pl AGATCTATGGTCAAGA AGATAACCAGCATGAAC(帶下劃線的堿基序列為BagII酶切位點)(序列表中SEQ ID No 3)， P2 :GCTAGCCTCCCTAAAGGATTTCGTCACGTTG (帶下劃線的堿基序列為NheI酶切位點)(序列表中 SEQ ID No 4)。2、牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3免疫優(yōu)勢區(qū)基因的擴(kuò)增用反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)的方法擴(kuò)增牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3免疫優(yōu)勢區(qū)基因，具體方法包括以下步驟1)將MDBK細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)培養(yǎng)的病毒懸液反復(fù)凍融3次，4°C、8000i 離心 20min,取上清，分別加入終濃度為10 %和3 %的PEG20000和NaCl，4°C磁力攪拌過夜。次日， 4°C、8000r離心30min，棄上清，沉淀用PBS重懸。分別配置30 %、；35%、40%、45 %的CsCl 溶液，制備CsCl濃度梯度，加入病毒濃縮液后，4°C、22000r/min離心16h，對濃縮的病毒液
進(jìn)行純化。2)取病毒濃縮液10 μ 1加入200 μ 1 PBS，加入400μ 1 Trizol，輕混lmin，室溫靜止IOmin,再加入400 μ 1氯仿，輕混lmin,室溫靜止IOmin,于4°C、12000g離心15min,吸取上層液，加入一倍體積以上的異丙醇，_30°C沉淀30min，于4°C、14000g離心lOmin，用滅菌 9μ 1 DEPC水重懸沉淀。3)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)得到牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3免疫優(yōu)勢區(qū)基因的cDNA，反應(yīng)體系為5 X RT-PCR buffer 4 μ 1，下游引物P22 μ 1，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，DEPC水4μ 1，42°C反轉(zhuǎn)錄lh，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 3μ 1,2XPCR buffer 12. 5 μ 1，上游引物 Pl 1“1，下游引物卩2 1μ 1, ddH20 8·5μ1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，共32個循環(huán)；最后 72°C延伸10min，4°C終止反應(yīng)。4)將步驟3)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段用北京天根公司的DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化，具體步驟為將DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，分離結(jié)果如圖1 所示(M :DL2000Marker ；a 陰性對照；b :DsbA/BVDV NS3 基因的 RT-PCR 產(chǎn)物)，經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得了約1032bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，EB染色以后，于長波紫外燈下切取含有該目的片段的瓊脂糖凝膠，放入一無菌1.5mL EP管中，加入400μ 1溶膠液，于50°C水浴5min， 期間輕彈EP管，凝膠完全溶化，然后將溶化的液體轉(zhuǎn)至一回收柱，于室溫靜置5min，SOOOr/ min離心lmin，倒掉收集管中的廢液，用洗滌液洗滌兩次，最后12000r/min離心lmin，回收柱轉(zhuǎn)至一干凈無菌1. 5mL EP管中，加10 μ 1洗脫液洗脫，于室溫放置5min，12000r/min離心lmin，收集管中即為回收的DNA片段。洗脫后的DNA貯存于4°C或_20°C。二、攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的重組表達(dá)1、克隆載體pMD18-T-NS3的構(gòu)建將步驟一純化的目的基因與克隆載體pMD18_T(購自大連寶生物工程有限公司)連接，20μ 1連接體系包括0.5μ 1 PMD18-T載體、4. 5μ 1目的基因純化產(chǎn)物和 5μ 1 Solution I，16°C過夜。反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Ε. coli T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示(M :DL2000Marker ；a:陰性對照；b PMD18-T-NS3PCR鑒定結(jié)果)，表明獲得了攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)基因的陽性克隆，將該攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)基因的重組克隆質(zhì)粒命名為 pMD 18-T-NS3。2、重組表達(dá)質(zhì)粒pET-DsbA_NS3的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化BL21 (Rosetta)感受態(tài)菌將pMD18-T-NS3質(zhì)粒進(jìn)行BagII、NheI雙酶切，表達(dá)載體pET-DsbA(購自晶美生物公司)進(jìn)行BamHI、NheI雙酶切，再將兩個載體的雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌BL21 (Rosetta)，提取質(zhì)粒DNA，以PI、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示(M :DL2000Marker ；a :pET-DsbA_NS3PCR鑒定結(jié)果；b 陰性對照)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了 1032bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再挑選陽性克隆，進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果如圖4所示，結(jié)果編碼攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合蛋白的基因(命名為DsbA/BVDV NS3)具有序列表中SEQ ID No :2的DNA序列，序列表中的SEQ ID No 2由1689個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1-1689位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第1-645位堿基編碼折疊酶DsbA，自5，端第652-1683位堿基編碼牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3 優(yōu)勢區(qū)。上述測序結(jié)果表明獲得了插入序列及位置均正確的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體，命名為pET-DsbA-NS3，將攜帶有 pET-DsbA-NS3的重組大腸桿菌工程菌命名為BL21 (Rosetta)/DsbA_NS3。3、攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取單個克隆的重組大腸桿菌工程菌BL21 (Rosetta) /DsbA_NS3，接種于3mL含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日按的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C 振搖培養(yǎng)池后(吸光光度為0. 6-0. 8)，加入IPTG (終濃度為l.Ommol/L)、葡萄糖(終濃度為0. 2% )，繼續(xù)于30°C振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)4h-6h，收集菌體。4、SDS-PAGE蛋白電泳檢測用12 % SDS-PAGE凝膠分離步驟3重組表達(dá)的蛋白，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，結(jié)果如圖5所示(a,b,c,d,e分別為pET_DsbA-NS3誘導(dǎo)5h，4h，3h，2h，Ih產(chǎn)物； f為空載體誘導(dǎo)汕；M為蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn)250kDa，150kDa，100kDa，80kDa，60kDa， 50kDa，40kDa，30kDa，25kDa，20kDa，15kDa, IOkDa)，經(jīng)表達(dá)獲得了 62. 9kDa 的重組蛋白，與
預(yù)期結(jié)果相符，表明牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合蛋白已獲得表達(dá)。5、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化取誘導(dǎo)菌液200mL收集菌體，用50mmol/L pH7. 4的PBS緩沖液約5mL懸浮菌體， 超聲法破碎菌體，超聲條件為功率200W，超聲3s、停2s為一個循環(huán)，共180個循環(huán)超聲破碎，超聲液離心12000r/min 15min，取上清，用針對His標(biāo)簽的鎳瓊脂糖凝膠柱純化，具體操作為將樣品加入經(jīng)緩沖液(0. 5mol/L NaH2P0419mL,0. 5mol/LNa2HP0481mL, NaCl 29. 3g， pH7. 4)洗滌的親和層析柱，用含lOOmmol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行階段洗脫，純化后的蛋白裝入透析袋，于透析液(PH7.4PBQ中，4°C透析20h。對純化蛋白進(jìn)行12 % SDS-PAGE凝膠分；離蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖6所示(a為pET-DsbA-NS3誘導(dǎo)產(chǎn)物純化后；b為pET-DsbA_NS3誘導(dǎo)產(chǎn)物純化前；M為蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn):250kDa, 150kDa, IOOkDa, 80kDa, 60kDa, 50kDa, 40kDa, 30kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa，IOkDa)，表明牛病毒性腹瀉病毒NS3蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)融合蛋白已得到純化。實施例2、間接ELISA法檢測牛病毒性腹瀉病毒抗體1、間接ELISA最佳反應(yīng)條件的選擇BVDV抗原最佳包被濃度與陰陽血清最佳稀釋度的選擇(采用方陣試驗進(jìn)行工作濃度的篩選)取純化的實施例1得到的重組NS3融合蛋白，用包被液(0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，PH9. 6)稀釋為8 μ g/mL、4 μ g/mL、2 μ g/mL、1 μ g/mL,加入酶標(biāo)板，100 μ L/孔，每個濃度作一行，4°C過夜，取出用 PBST (NaCl 8. 0g, KH2PO4 0. 2g, Na2HP04 1. 15g，KCl 0. 2g，Tween-20 0. 5mL，加去離子水至 lOOOmL，調(diào) pH 至 7. 4)洗滌 3 次；然后每孔加入250 μ L封閉液(PBST+1 %明膠)，37°C封閉2h，PBST洗滌3次；用PBST將牛陽性血清和陰性血清(標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)分別作1 20、1 40,1 80,1 160、
1 320稀釋，加入酶標(biāo)板中，每個稀釋度作一列，以PBST為空白對照，IOOyL/孔于37°C反應(yīng)lh，洗滌3次；加入1 1000兔抗牛IgG-HRP(北京經(jīng)緯博恒生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司UOOyL/孔，37 °C反應(yīng)lh，經(jīng)洗滌后加入TMB底物100 μ L，室溫避光作用10-15min，加入50 μ L 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定0D45(lnm。以陽性血清孔的OD值接近1. 0，P/N彡2. 1 的抗原、血清最大稀釋度作為抗原及待測血清的最適工作濃度。實驗確定包被抗原濃度為
2μ g/mL)，血清抗體最佳稀釋度為1 40。2、間接ELISA法測定牛病毒性腹瀉病毒血清抗體以方陣滴定所確定的抗原包被濃度Qy g/mL)作為包被抗原工作濃度，對收集的 6份牛血清樣品(經(jīng)牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒(INGEZIM公司產(chǎn)品)檢測為陽性) 進(jìn)行抗體檢測，同時設(shè)空白對照孔(PBST)和陰性對照孔(標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)。具體操作取純化的實施例1得到的重組NS3融合蛋白，以2 μ g/mL包被酶標(biāo)板， 將1 40稀釋的牛血清樣品和陰性對照血清加入酶標(biāo)板中，100μ L/孔，于37°C反應(yīng)lh，洗滌后加入1 1000兔抗牛IgG-HRP (北京經(jīng)緯博恒生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司)，100 μ L/ 孔，37°C反應(yīng)lh，洗滌后加入TMB底物100 μ L，室溫避光作用10_15min，加入50 μ L2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定結(jié)果如圖7所示(1-6為6份血清)，表明重組NS3蛋白能與?？寡瀹a(chǎn)生陽性反應(yīng)，克用于檢測牛病毒性腹瀉病毒血清抗體中。
權(quán)利要求
1.攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白，是在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的氨基(N)端連接有折疊酶DsbA的融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述DsbA自氨基端與氧化還原功能相關(guān)的兩個半胱氨酸(Cys)突變成絲氨酸(kr)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID No 1 ；2)將序列表中SEQID No=I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有絲氨酸蛋白酶活性和RNA解旋酶活性的蛋白質(zhì)。
4.編碼權(quán)利要求1或2或3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 1的DNA序列；3)與序列表中SEQID No :2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID No 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求4或5所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
7.—種重組表達(dá)權(quán)利要求1或2或3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白 NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求4或5或6所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中，經(jīng)表達(dá)、 純化得到攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白；所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因采用轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增得到，用于擴(kuò)增該基因的上、下游引物的核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的重組表達(dá)方法，其特征在于，用于構(gòu)建含有上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為任意一種攜帶折疊酶DsbA基因的原核表達(dá)載體pET-DsbA ；以ρΕΤ-DsbA為出發(fā)載體構(gòu)建的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體為 pET-DsbA-NS3 ；所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因位于原核表達(dá)載體pET-DsbA多克隆位點處的BagII和Nhe I限制性酶切位點之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白的重組表達(dá)方法，其特征在于，所述宿主為大腸桿菌；所述大腸桿菌具體為 BL21 (Rosetta)、BL21 (DE3)、BL21 (DE3, plysS)、E. coli JM109、E. coli HBlOl 或 E. coli ToplO，優(yōu)選為BL21 (Rosetta)；以大腸桿菌BL21 (Rosetta)為出發(fā)菌株構(gòu)建的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體 pET-DsbA-NS3 的工程菌為 BL21 (Rosetta)/DsbA_NS3。
10.權(quán)利要求1或2或3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白在牛病毒性腹瀉病毒的ELISA檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的融合蛋白及其重組表達(dá)方法與應(yīng)用。本發(fā)明的融合蛋白是將BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)的氨基(N)端連接折疊酶DsbA后得到的。經(jīng)過突變后的DsbA與BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)融合可實現(xiàn)NS3基因的胞內(nèi)可溶性有活性的高表達(dá)，表達(dá)量大于30％。本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)方法中采用攜帶T7啟動子和DsbA基因的pET-DsbA表達(dá)載體，選用凝血酶切割位點作為BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3優(yōu)勢區(qū)基因的插入位點，表達(dá)的牛病毒性腹瀉病毒NS3免疫優(yōu)勢蛋白具有很好的抗原性，可用于牛病毒性腹瀉病毒的ELISA檢測。
文檔編號C12N9/00GK102517260SQ20111044992
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者尹惠瓊, 張啟模, 楊姝, 王麗, 章金剛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所