專利名稱：一種制備抗腫瘤化合物Rasfonin 的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備抗腫瘤化合物Rasfonin的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤又稱為癌癥，是威脅人類健康生存的重大惡性疾病。世界衛(wèi)生組織在第18屆國際抗癌聯(lián)盟大會上的報告表明，今后20年新發(fā)腫瘤患者人數(shù)將由目前每年1000萬增加到1500萬，每年由惡性腫瘤而死亡的人數(shù)也將由600萬增加至1000萬，占世界死亡總數(shù)的12%。癌癥正在成為新世紀(jì)人類的第一大殺手。經(jīng)過各國科學(xué)家們40多年的努力，新的抗腫瘤藥物不斷出現(xiàn)，腫瘤的化學(xué)藥物治療出現(xiàn)飛速的發(fā)展，患者生命明顯延長，生活質(zhì)量得到明顯改善，特別是對白血病、淋巴瘤等的治療有了突破性進(jìn)展。但對危害人類健康最嚴(yán)重的、占惡性腫瘤90%以上的惡性腫瘤 如宮頸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌及胰腺癌等還缺乏有效治療藥物。此外，抗腫瘤藥物的高昂價格、臨床治療中產(chǎn)生的耐藥性及給患者帶來的毒副作用等都表明，人類迫切需要研究與開發(fā)新型、高效的抗癌藥物。2000年，由來自日本千葉大學(xué)和東京大學(xué)的研究者們分別從真菌Taleromycessp. 3656-A1 [參見，Journal of Antibiotics (抗生素雜志)· 2000，53，848-850]和真菌 Trichurus terrophilus[參 JAL,120th Annual Meeting of the PharmaceuticalSociety of Japan (第120屆日本藥學(xué)學(xué)會年會)· Gifu, March 2000, p. 68.]的固體發(fā)酵提取物中分離到一個具有顯著腫瘤和免疫抑制活性的化合物，命名為Rasfonin。據(jù)報道，Rasfonin對癌基因ras誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞株有顯著的抑制活性(IC5tl為0. 16 μ g/mL)[參見，Journal of Antibiotics (抗生素雜志)· 2000, 53,848-850],并分別對刀豆蛋白A (Con A)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖有顯著的免疫抑制活性(IC5tl分別為 0. 7 和 0. 5 μ g/mL)[參見，Chemical & Pharmaceutical Bulletin(生物學(xué)與藥學(xué)通報).2005，53，923-929]，由此可見，化合物Rasfonin具有潛在抗癌作用，但是由于從自然資源中獲得足夠量的Rasfonin十分困難，所以，在很長一段時間內(nèi)一直沒有人能成功研究和開發(fā)該化合物。直到2005和2006年，Rasfonin才分別被日本的Ishibashi研究組[參見，Tetrahedron (四面體雜志)· 2005，61，1827-1833]和美國的Boeckman研究組[參見，Journal of the American Chemical Society (美國化學(xué)會會志)· 2005,128，11032-11033]全合成，但合成方法非常復(fù)雜，包含了復(fù)雜的有機(jī)反應(yīng)，反應(yīng)步驟分別是23步和16步，產(chǎn)量非常微小，無法進(jìn)一步進(jìn)行抗癌機(jī)理的深入研究。因此，開發(fā)能夠大量制備抗腫瘤化合物Rasfonin的方法，是研究其抗癌機(jī)理和評價其能否成為新抗癌藥物的首要條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株矛束霉(Doratomyces sp.)。本發(fā)明所提供的真菌為矛束霉(Doratomyces sp. )XZ059，其保藏編號為CGMCCNo.5526。該菌株已于2011年12月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5526，分類命名為矛束霉(Doratomyces sp.)，菌株名稱為 XZ059。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備抗腫瘤化合物Rasfonin的方法。本發(fā)明所提供的制備Rasfonin的方法，包括如下步驟a)將Doratomyces sp.進(jìn)行固體(稻米)發(fā)酵，得到發(fā)酵培養(yǎng)物；b)向所述發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中加入乙酸乙酯進(jìn)行提取，得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到粗提物；c)將所述粗提物進(jìn)行減壓硅膠柱層析分離而得到活性組分溶液，將所述活性組分溶液用高效液相色譜分離得到化合物Rasfonin。所述Rasfonin的化學(xué)式如式I所示
權(quán)利要求
1.矛束霉(Doratomycessp.) XZ059，其保藏編號為 CGMCC No. 5526。
2.一種制備抗腫瘤化合物Rasfonin的方法,包括如下步驟 a)將Doratomycessp.進(jìn)行固體(稻米)發(fā)酵，得到發(fā)酵培養(yǎng)物； b)向所述發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中加入乙酸乙酯進(jìn)行提取，得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到粗提物； c)將所述粗提物進(jìn)行減壓硅膠柱層析分離而得到活性組分溶液，將所述活性組分溶液用高效液相色譜分離得到化合物Rasfonin。
所述Rasfonin的化學(xué)式如式I所示
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基是稻米； 所述發(fā)酵的條件為溫度為25°C，靜置培養(yǎng)，時間為40d。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發(fā)酵后，包括如下提取步驟用不溶于水的且在25°C是液態(tài)的有機(jī)溶劑對所述含有Rasfonin的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行浸泡提取三次，得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到粗提物8. Og ； 所述不溶于水的且在25°C是液態(tài)的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述得到粗提物后，將粗提物用正己烷-二氯甲烷-甲醇體系進(jìn)行減壓硅膠柱層析，所用流動相為正己烷二氯甲烷(v/v) = 100 0,99 1,97 3,95 5,92 8,90 10,85 15,80 20，75 25,70 30,60 40,50 50,40 60,30 70,20 80，10 90,0 100 ;二氯甲烷甲醇(v/v) = 200 1,100 1,100 I. 5，100 2，100 2. 5，100 3，100 4，100 5,0 100;共計26個梯度，每個梯度的洗脫體積均為400mL，將每個梯度的洗脫液減壓蒸餾，按照極性由小到大的順序?qū)⒋痔嵛锓殖?6個組分，在活性跟蹤[測試26個組分對乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和肺癌細(xì)胞(A549)的抑制活性]指導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)在二氯甲烷甲醇=100 2. 5 (v/v)作為流動相洗脫得到的組分有抑制活性，收集活性組分(400mg)； 所述用減壓硅膠柱分離純化中，所用的填料為薄層層析硅膠H ; 所述減壓娃膠柱的大小為高40cm和直徑6cm ； 所述減壓硅膠柱中裝125g硅膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用減壓硅膠柱分離純化后，包括高效液相色譜分離的步驟；所述高效液相色譜分離條件是采用Agilent 1260型半制備高壓液相色譜儀，Agilent C18反相半制備色譜柱(5 y m、9. 4x250mm)，流速2. OmL/min，用甲醇和水作為流動相，以甲醇與水的體積比為75 25的混合溶液進(jìn)行等度洗脫，洗脫時間為25min，收集保留時間為17. 45min的洗脫峰，得到抗腫瘤化合物 Rasfonin 共 200mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述用減壓硅膠柱分離純化中，是將所述含有Rasfonin的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物進(jìn)行分離純化； 所述高效液相色譜分離中，是將所述用二氯甲烷和甲醇的體積比為100 2. 5的混合溶液洗脫下來的溶液濃縮組分進(jìn)行分離。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備抗腫瘤化合物Rasfonin的方法及其專用菌株。該菌株為矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059，其保藏編號為CGMCC No.5526。本發(fā)明的菌株矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059具有產(chǎn)生抗腫瘤化合物Rasfonin的功能。本發(fā)明制備抗腫瘤化合物Rasfonin的方法，收率高(8.0g粗提物經(jīng)過分離純化而得到200mg純化合物Rasfonin，其純度為99％以上，收率為2.5％)，而且本發(fā)明方法操作簡單、成本低廉、省時省力。
文檔編號C12P17/06GK102807955SQ20111045315
公開日2012年12月5日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者車永勝, 李彥 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所