專利名稱：一種重組胰蛋白酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組胰蛋白酶的制備方法。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme)是一種絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.4)。在無脊椎和脊椎動物中作為消化酶而廣泛存在。不同物種的胰蛋白酶分子大小有一定差異，牛胰蛋白酶由223個氨基酸殘基組成，分子量為23300，等電點為10.1-10.5。胰蛋白酶在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的，通過胰液而分泌，在腸道中受腸激酶作用分解成為具有活性的胰蛋白酶。它是肽鏈內(nèi)切酶，可從肽鏈中賴氨酸或精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷肽鏈。因為胰蛋白酶是特異性最強的蛋白酶之一，在消化道內(nèi)，它不僅起消化酶的作用，而且還能限制性分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，對這些酶原起活化作用；在蛋白質(zhì)研究及工業(yè)上，它作為重要的工具酶，在蛋白質(zhì)測序、動物細胞培養(yǎng)前對組織的處理、胰島素等蛋白藥物的生產(chǎn)、皮革與生絲處理以及食品工業(yè)上發(fā)揮廣泛的作用；在臨床上，還可用于清除膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。目前胰蛋白酶主要從豬、牛的胰臟中提取，因其動物源性，存在未知病毒和外源因子污染的風(fēng)險，在制藥行業(yè)的應(yīng)用受到很大的限制；另外通過動物臟器提取的胰蛋白酶，因分離純化不徹底，存在一些雜質(zhì)，如糜蛋白酶，對其特異性切割賴氨酸和精氨酸位點產(chǎn)生影響，在蛋白藥物的生產(chǎn)和分析中的應(yīng)用也受到較大的限制。通過重組工程菌表達胰蛋白酶原，可以生廣聞純度與聞活力的膜蛋白酶，可以滿足蛋白質(zhì)研究與藥物蛋白生廣的需要。本領(lǐng)域需要提供新的胰蛋白酶的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量和富有創(chuàng)造性的工作，構(gòu)建了包含胰蛋白酶原基因的重組細胞株并經(jīng)優(yōu)化表達條件、純化最終獲得了與胰蛋白酶序列一直的重組胰蛋白酶，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是，提供一種包含胰蛋白酶原基因的表達載體。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是，提供一種包含胰蛋白酶原基因的工程菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題之三是提供一種重組胰蛋白酶的制備方法。本發(fā)明提供了一種包含牛胰蛋白酶原基因的表達載體，其特征在于牛胰蛋白酶原基因序列為Seq ID N0.16_710。優(yōu)選地，包含牛胰蛋白酶原基因的表達載體，其特征在于，牛胰蛋白酶原基因Seq ID N0.16-710插入質(zhì)粒pET_22b (+)的Mcsl/Xhol酶切位點。

牛胰蛋白酶原基因序列在本領(lǐng)域是已知的，公布在Genebank中，具體參見Seq.1D N0.16-710，其編碼Seq.1D N0.2的牛胰蛋白酶原序列。獲得該序列的方法在本領(lǐng)域也是已知的，例如可以采用人工合成的方法合成該序列。為插入質(zhì)粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位點，在合成牛胰蛋白酶原cDNA時，兩端分別添加了 Mcsl/Xhol酶切位點，Seq.ID N0.11-8和711-716，參見序列表。本發(fā)明提供了一種包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其包含前述的表達載體。優(yōu)選地，包含牛胰蛋白酶原基因序列的工程菌，其特征在于，由將前述表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)而獲得。轉(zhuǎn)化方法在本領(lǐng)域是公知的，例如電穿孔法、CaCl2轉(zhuǎn)化法等。本發(fā)明還提供了一種重組牛胰蛋白酶的制備方法，包括如下步驟:(I)培養(yǎng)包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并誘導(dǎo)牛胰蛋白酶原基因表達；(2)收集菌體；(3)破碎菌體；(4)收集包涵體，洗滌包涵體；(5)包涵體變性和復(fù)性；(6)膜蛋白酶原活化；(7)活化的胰蛋白酶純化。所述的“收集菌體”的方法包括但不限于離心包括連續(xù)離心、過濾等。所述的“破碎菌體”的方法，包括但不限于高壓勻漿、滲透壓沖擊、凍融、超聲波破碎等。所述的“收集包涵體”的方法，包括但不限于離心。

所述的“洗滌包涵體”的方法，包括但不限于包涵體用純化用書或者合適的緩沖液重懸、離心、再重懸離心等2 3個循環(huán)操作。包涵體變性和復(fù)性的方法可以按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法進行。優(yōu)選地，重組牛胰蛋白酶的制備方法，步驟(I)培養(yǎng)包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并誘導(dǎo)牛胰蛋白酶原基因表達，進一步具體為:接種重組工程菌陽性克隆200μ1到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜，按4% -10%接種量接過夜菌于500ml的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對數(shù)期，接種到裝有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為:發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度300rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，控制攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧始終在30%以上，培養(yǎng)基配方如下:發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L,補料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過程中pH調(diào)控；當培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡、溶氧迅速上升時開始補料，控制補料速度、轉(zhuǎn)速、通氣保證控制溶氧在30%以上；補料4hr-6hr后，降溫至20_30°C，調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5，加入終濃度為0.lmmol/L的IPTG進行有氧誘導(dǎo)，溶氧不低于20%，繼續(xù)培養(yǎng)4_10h后出罐，收集菌體。更優(yōu)選地，重組牛胰蛋白酶的制備方法，進一步，步驟(5)包涵體的變性和復(fù)性操作為:包涵體溶解緩沖液:8mol/L 尿素 +10mmol/L EDTA+25mmol/L Tris-HCl, PH7.5，按重量體積比1: 5 15溶解過夜；溶解后的包涵體經(jīng)離心，稀釋到蛋白濃度0.1 0.5mg/ml稀釋到蛋白濃度0.2mg/ml,在復(fù)性緩沖液(0.2mol/L尿素+10mmol/L GaCl2+50mmol/LTris-HCl, GSH: GSSG = lmmol/L: 0.3mmol/L, PH10)中，4°C復(fù)性過夜得復(fù)性的胰蛋白酶原。所述的“胰蛋白酶原活化”包括前述復(fù)性的胰蛋白酶原經(jīng)腸激酶(I: 200，腸激酶(g):胰蛋白酶原(g))在室溫下酶解1-10小時后即可得到具有活性的粗胰蛋白酶酶液。
所述的“活性胰蛋白酶的純化”包括疏水層析、離子交換步驟。本發(fā)明的重組牛胰蛋白酶具有和牛胰蛋白酶相同的序列，可以安全的用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)，解決重組蛋白藥物生產(chǎn)與研究中可能存在的外源因子等風(fēng)險與非特異性切害1]問題。


圖1.牛胰蛋白酶原cDNA序列，1-8和711-716為Mcsl/Xhol酶切位點。圖2.牛胰蛋白酶原氨基酸序列，1-10為信號肽序列，11-234為成熟的牛胰蛋白酶。圖3重組質(zhì)粒構(gòu)建與酶切驗證圖。圖4.重組胰蛋白酶工程菌生長曲線圖。圖5.重組胰蛋白酶工程菌表達,I為一級種子、2為二級種子，3為誘導(dǎo)前，4為出
罐全菌。圖6.重組胰蛋白酶工程菌破碎后電泳圖，I為破碎后上清、2和3為破碎后沉淀(包涵體)。圖7.重組胰蛋白酶離子交換層析純化。圖8.重組胰蛋白酶疏水層析純化。圖9.重組胰蛋白酶電泳分析，其中:1為包涵體溶解、2為重組胰蛋白酶酶切、3為重組胰蛋白酶復(fù)性超濾后、4為純化重組胰蛋白酶。圖10.重組胰蛋白酶活性測定。圖11.胰蛋白酶原基因測序結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例詳細說明本發(fā)明，這些具體實施例均為說明性的，不以任何方式限制本發(fā)明的保護范圍。在以下具體實施例中，除有特別說明的之外，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)手冊的教導(dǎo)或者試劑、設(shè)備提供商的說明書進行之。本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照這些教導(dǎo)并結(jié)合本發(fā)明的公開的內(nèi)容可以實現(xiàn)本發(fā)明。實施例一重組牛胰蛋白酶的制備一、工程菌的構(gòu)建人工合成牛胰蛋白酶原的cDNA序列，兩端引入Mcsl/Xhol酶切位點，具體序列如下(參見附圖1和許列表Seq.1D N0.1。其中6-710編碼圖2 (Seq.1D N0.2和3)的牛胰蛋
白酶原。TGGCCATGGCGTTCCCGAGTGACGACGATGACAAAATTGTGGGCGGTTACACCTGTGCCGAAAATAGCGTGCCGTATCAAGTTAGCCTGAATGCGGGCTATCATTTTTGCGGCGGTTCACTGATTAACGATCAATGGGTGGTTTCGGCGGCCCATTGTTATCAGTACCACATTCAAGTTCGTCTGGGTGAATATAATATCGATGTCCTGGAAGGCGGTGAACAGTTCATCGACGCCTCAAAAATTATCCGCCACCCGAAATACAGCTCTTGGACCCTGGATAACGACATTCTGCTGATCAAACTGAGCACCCCGGCCGTCATTAATGCACGTGTGTCTACGCTGCTGCTGCCGTCAGCATGCGCTTCGGCAGGTACCGAATGTCTGATCTCCGGCTGGGGTAACACGCTGAGTTCCGGTGTGAATTATCCGGATCTGCTGCAGTGCCTGGTTGCTCCGCTGCTGAGTCATGCTGACTGTGAAGCGTCCTACCCGGGCCAAATTACGAACAATATGATCTGCGCGGGTTTTC
TGGAAGGCGGTAAAGATAGCTGCCAGGGTGACTCTGGCGGTCCGGTCGCATGTAACGGCCAGCTGCAAGGTATTGTT
AGCTGGGGCTACGGTTGTGCACAGAAAGGCAAACCGGGTGTCTATACGAAAGTGTGTAACTATGTGGACTGGATTCA
GGAAACCATTGCGGCGAACTCATAACTCGAG
上述cDNA,通過Mcsl/Xhol酶切位點插入到質(zhì)粒pET_22b (+)(購自invitrogen)相應(yīng)酶切位點中，構(gòu)建成的重組質(zhì)粒。構(gòu)建圖與酶切后電泳圖如圖3所示。插入胰蛋白酶原基因的重組質(zhì)粒ρΕΤ-ρι.οΤΥΡ通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建重組胰蛋白酶工程菌。經(jīng)測序，工程菌中的序列與設(shè)計一致，圖11。二、工程菌的高密度發(fā)酵重組工程菌發(fā)酵，接種重組工程菌陽性克隆200 μ I到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜，按4%。接種量接過夜菌于500ml的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對數(shù)期，接種到裝有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為:發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度300rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，不斷提高攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量(轉(zhuǎn)速最大lOOOrpm，通氣量最大30L/min)以維持溶氧始終在30%以上，培養(yǎng)基配方如下:發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L,補料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過程中pH調(diào)控。當培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，通過控制泵的轉(zhuǎn)速合理控制補料速度，同時在補料速度、轉(zhuǎn)速、通氣三者的合理控制下，保證控制溶氧在30%以上。補料4h后，降溫至23°C，調(diào)節(jié)pH至7.1，加入終濃度為0.lmmol/L的IPTG進行有氧誘導(dǎo)(即保證溶氧不低于20% )8h后出罐。出罐后離心得菌體濕重167g/L，發(fā)酵過程中菌體生長曲線及相關(guān)取樣點電泳如4和5，表達量達全菌蛋白的60%以上。發(fā)酵結(jié)束離心收集的菌體按重量體積比1: 10加入破碎緩沖液(25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA)，高壓均質(zhì)機700bar破碎后收集沉淀和上清電泳如6，包涵體純度胰蛋白酶原超過85%。三、胰蛋白酶原的純化發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，按重量體積比1: 10加入破碎緩沖液(25mmol/LTis-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5),高壓均質(zhì)機700bar條件下破碎兩遍,離心收集包涵體沉淀,包涵體濕重為30g/L發(fā)酵液。將沉淀按重量體積比1: 10加入洗滌緩沖液(2mol/L尿素+1.5% Triton)，室溫磁力攪拌I小時，離心收集的沉淀用洗滌緩沖液洗滌兩次。再用包涵體溶解緩沖液(8mol/L 尿素+10mmol/L EDTA+25mmol/L Tris-HCl, PH7.5)按重量體積比1: 10溶解過夜。溶解后的包涵體經(jīng)離心、超濾去除雜質(zhì)后(如圖4所示)，稀釋到蛋白濃度 0.2mg/ml,在復(fù)性緩沖液(0.2mol/L 尿素+10mmol/L GaCl2+50mmol/L Tris-HCl,GSH: GSSG = lmmol/L: 0.3mmol/L, PH10)中，4°C復(fù)性過夜，復(fù)性后的胰蛋白酶原經(jīng)腸激酶(I: 200)在室溫下酶解5小時后即可得到具有活性的粗酶液。粗酶液經(jīng)疏水層析(圖8)，條件是:疏水層析條件:緩沖液A-20mM Tris-HCl+1.5M(NH4)2S04, ρΗ8.0 ;緩沖液B-20mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ；0-100% B線性梯度50CV ;離子交換(圖7)，條件是:緩沖液A-20mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ;緩沖液 B_20mM Tris-HCl+lM NaCl, ρΗ8.0 ；0-100% B 線性梯度30CV ；即可得到具有高純度和活性胰蛋白酶產(chǎn)品。純化的胰蛋白酶經(jīng)電泳分析，純度達到95%以上(圖9)。效果例重組牛胰蛋白酶的活性以苯甲酰L-精氨酸乙酯(英文縮寫為BAEE)為底物，用紫外吸收法進行測定。苯甲酰L-精氨酸乙酯在波長253nm下的紫外吸收遠遠弱于苯甲酰L-精氨酸(英文縮寫為BA)。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L-精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加。取2個光程為I厘米的帶蓋石英比色皿，分別加入25°C預(yù)熱過的2.8ml底物溶液。向一只比色皿中加入0.2ml 0.0Olmol/LHCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點。再在另一比色皿中加入0.2ml待測酶液，立即混勻并記時，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀3 4min?？刂艫A253/min在0.05 0.100左右為宜。繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線(圖10)，從曲線上求出反應(yīng)起始點吸光度隨時間的變化率 ΔA253/min0 胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為:以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25°C，反應(yīng)體積
3.0ml，光徑I厘米的條件下，測定AA253/min，每分鐘使Λ A253/min增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一個BAEE單位。
Δ A253./min χ稀譯倍數(shù) 胰蛋白酶溶液的活力單位(ΒΑΕΕ單位/ ml) =0-00ixSliKi]PAMDs '
_酸活力_
胰蛋白酶比活力(BAEE單位/mg )=胰酶濃度(mg/_x酶液加入體積 經(jīng)測定，純化后的重組胰蛋白酶的每毫克為10500BAEE單位活性。
權(quán)利要求
1.一種包含牛胰蛋白酶原基因的表達載體，其特征在于牛胰蛋白酶原基因序列為SeqID N0.16-710。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達載體，其特征在于，牛胰蛋白酶原基因SeqID N0.16-710插入質(zhì)粒pET-22b (+)的Mcsl/Xhol酶切位點。
3.一種包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其包含權(quán)利要求2所述的表達載體。
4.一種包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其特征在于，由將權(quán)利要求2所述的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3而獲得。
5.一種重組牛胰蛋白酶的制備方法，包括如下步驟: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求3或4任一所述的牛胰蛋白酶原基因的工程菌并誘導(dǎo)牛胰蛋白酶原基因表達； (2)收集菌體； (3)破碎菌體； (4)收集包涵體，洗滌包涵體； (5)包涵體變性和復(fù)性； (6)胰蛋白酶原活化； (7)活化的胰蛋白酶純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其特征在于:步驟(I)培養(yǎng)包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并誘導(dǎo)牛胰蛋白酶原基因表達具體為:接種重組工程菌陽性克隆200 μ I到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜，按4% -10%接種量接過夜菌于500ml的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對數(shù)期，接種到裝有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為:發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度300rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，控制攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧始終在30%以上，培養(yǎng)基配方如下:發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過程中pH調(diào)控；當培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡、溶氧迅速上升時開始補料，控制補料速度、轉(zhuǎn)速、通氣保證控制溶氧在30 %以上；補料4hr-6hr后，降溫至20_30°C，調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5，加入終濃度為.0.lmmol/L的IPTG進行有氧誘導(dǎo)，溶氧不低于20%，繼續(xù)培養(yǎng)4_10h后出罐，收集菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其特征在于，包涵體變性和復(fù)性的條件是:包涵體溶解緩沖液:0.2mol/L 尿素 +10mmol/LEDTA+25mmol/LTis-HCL，PH7.5，按重量體積比 1: 5 15溶解過夜；溶解后的包涵體經(jīng)離心，稀釋到蛋白濃度0.1 0.5mg/ml，在復(fù)性緩沖液:.0.2mol/L 尿素 +10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG = lmmol/L: 0.3mmol/L,PHlO中，4°C復(fù)性過夜。
全文摘要
本發(fā)明一種重組胰蛋白酶的制備方法涉及基因工程領(lǐng)域。提供了包含胰蛋白酶原的表達載體和工程菌，本發(fā)明的方法包括將帶有重組胰蛋白酶原基因序列的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細胞中，構(gòu)建重組工程菌，經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)表達重組胰蛋白酶原，經(jīng)復(fù)性、腸激酶酶切轉(zhuǎn)化和分離純化后得到具有活性的胰蛋白酶。本發(fā)明的特點是重組胰蛋白酶制備工藝簡單，成本低。
文檔編號C12N1/21GK103184236SQ20111045345
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者文良柱, 溫傳斌, 朱亮 申請人:江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司