專利名稱：植物基因組dna的循環(huán)提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中植物DNA分離提取和純化技術(shù)，尤其涉及一種植物基因組DNA的循環(huán)提取方法。
背景技術(shù)：
基因組DNA的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)；基因組DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，直接影響分子生物實(shí)驗(yàn)中與DNA有關(guān)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。植物物種間的異質(zhì)性往往限制了基因組DNA提取方法的適用范圍。用于植物基因組DNA提取的材料主要是葉片，葉片內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的復(fù)雜程度與基因組DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量密切相關(guān)。幼嫩葉片細(xì)胞分裂旺盛，DNA含量高，次生代謝產(chǎn)物積累量少，被公認(rèn)是基因組DNA提取的最佳材料；而植物的成熟葉片則相對(duì)積累了大量的次生代謝產(chǎn)物，不利于提取高質(zhì)量的基因組DNA。許多DNA提取的方法局限于從幼嫩植物葉片中提取高質(zhì)量和高產(chǎn)量的基因組DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種植物基因組DNA 的循環(huán)提取方法(簡稱方法)；本方法適用范圍廣，且能從成熟葉片中提取到高產(chǎn)量的基因組 DNA。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本方法包括步驟①將植物組織樣品在液氮速凍下磨成細(xì)粉后，取0. 3g轉(zhuǎn)入2mL離心管中；②加入500 μ 1預(yù)熱的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴40min ；③12000rpm常溫離心15min，轉(zhuǎn)移上清液到新的1. 5mL離心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-異戊醇，充分混勻后，常溫12000rpm離心15min，抽提1 2次，抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入兩倍體積的提前預(yù)冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，讓DNA沉淀充分析出，將析出的DNA沉淀轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mL70 %酒精的1. 5mL離心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1濃度為10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，該過程得到的DNA樣品，稱為IstDNA ；④步驟③中轉(zhuǎn)移上清液后離心管底部的組織樣品，繼續(xù)加入500 μ 1的3% CTAB 提取液進(jìn)行提取，該組織樣共循環(huán)提取4次，依此又得到3批次DNA樣品，分別稱為2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。所述100%酒精是指純的酒精溶液。所述70%酒精是指70mL純酒精用無菌純凈水定容到IOOmL的酒精溶液。本方法中組織樣循環(huán)提取4次，持續(xù)時(shí)間較長，但本方法步驟靈活，可視具體情況刪減循環(huán)次數(shù)。本方法所提取的成熟葉片DNA，IstDNA可能含有較多的次生代謝產(chǎn)物，DNA的產(chǎn)量
3可能較低，可直接棄掉第1次水浴后離心產(chǎn)生的上清液，直接進(jìn)行后3次DNA的提取。而 2" )ΝΑ、3^ΝΑ和4thDNA的產(chǎn)量相對(duì)高，濃度大致為100-500ng/l·! 1 ；質(zhì)量也高，滿足PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。本方法所使用的3% CTAB 提取液成分為3% CTAB, IOOmM Tris-HCl，20mM EDTA, 1. 4M NaCl，pH 值為 8. 0。所述的3%是指 3g/100mL。本方法所使用的TaiE 成分為=IOmM Tris-HCl,0. ImM EDTA，pH 8. O0工作原理葉片組織通過一次提取不能充分分離基因組DNA，故可通過多次提取的方式充分提取葉片內(nèi)所含的基因組DNA。具體是葉片組織樣加入DNA提取液后在65°C 下裂解細(xì)胞，離心轉(zhuǎn)移的上清再經(jīng)過氯仿異戊醇的萃取、酒精的沉淀，得到絮狀的DNA沉淀，最后利用70%乙醇洗滌DNA沉淀，得到第1次DNA沉淀，即IstDNA ；而離心轉(zhuǎn)移上清后位于離心管底部的組織樣可繼續(xù)加DNA提取液，進(jìn)行新一輪的基因組DNA提取，組織樣可循環(huán)提取4次，又得到3批次DNA樣本。本發(fā)明可分離到較高產(chǎn)量和質(zhì)量的植物基因組DNA，滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)基因組DNA濃度和純度的要求。2、植物基因組DNA的鑒定用本方法提取的植物基因組DNA樣品，可經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組 DNA,并經(jīng)PCR擴(kuò)增基因組DNA樣品鑒定DNA的質(zhì)量。3、本方法的用途本方法可以從多種植物葉片中提取到較高產(chǎn)量和質(zhì)量的基因組DNA。尤其可克服植株成熟葉片積累的大量次生代謝產(chǎn)物對(duì)基因組DNA提取的影響，能從植物成熟葉片中提取到符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求的基因組DNA。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果
①本方法中循環(huán)提取的步驟，1份組織樣可進(jìn)行4次基因組DNA提取，得到4次基因組DNA樣本，使基因組DNA產(chǎn)量顯著提高；②本方法適用的植物物種范圍較廣，且能從植物成熟葉片中提取到較好的基因組 DNA。本發(fā)明適用于植物基因組DNA的提取。


圖1是植物基因組DNA循環(huán)提取方法的流程圖，圖中1-植物組織，2-DNA提取液，3_組織樣，4_上清液，5-DNA沉淀。圖2是使用本方法提取的小麥、大麥、高粱和玉米成熟葉片鮮樣的基因組DNA電泳圖片；圖中W、B、S、C分別代表小麥、大麥、高粱和玉米，每個(gè)物種的組織樣是10個(gè)不同基因型葉片的混合樣，小麥和大麥設(shè)置2個(gè)重復(fù)，高粱和玉米設(shè)置3個(gè)重復(fù)；英文小寫字母 “a”和“b”分別代表DNA提取過程中加入組織樣的CTAB提取液的體積500 μ 1和1000 μ 1， 標(biāo)注在英文小寫字母a和b前的阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3、4分別代表lstDNA、2ndDNA、3rfDNA、4thDNA ； 10ng、50ng和IOOng是已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)λ DNA的上樣量，可根據(jù)其對(duì)應(yīng)的泳道的DNA條帶的亮度估算待測DNA的濃度；每個(gè)DNA樣本的上樣量原DNA溶液稀釋25倍后，取5 μ 1稀釋
4液上樣。圖3是利用1條ISSR引物擴(kuò)增小麥、大麥、高粱和玉米DNA樣本后的電泳圖片；圖中W、B、S、C分別代表小麥、大麥、高粱和玉米，阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3和4分別代表 IstDNAJndDNAJlrdDNA和4thDNA，ISSR引物是哥倫比亞大學(xué)開發(fā)的100條ISSR引物中編號(hào)為 873的引物；所使用marker為B031 (購買于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，圖中已標(biāo)出該marker的500bp和IOOObp條帶位置。英譯漢UCTAB =Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨；2> EDTA =Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, Zi二月安0 !；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明一、提取方法選用4個(gè)物種，分別是小麥、大麥、水稻和玉米(小麥和大麥各2個(gè)重復(fù)，水稻和玉米各3個(gè)重復(fù))，CTAB提取液的用量是500 μ 1。另外為了驗(yàn)證CTAB提取液的用量對(duì)DNA產(chǎn)量的影響，選用小麥和大麥兩個(gè)物種(各2個(gè)重復(fù))，使用ΙΟΟΟμ 1 CTAB提取液進(jìn)行基因組 DNA的提取。使用本方法進(jìn)行下述14次提取作業(yè)①將植物組織樣品在液氮速凍下磨成細(xì)粉后，取0. 3g轉(zhuǎn)入2mL離心管中；②加入500 μ 1預(yù)熱的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴40min ；③12000rpm常溫離心15min，轉(zhuǎn)移上清液到新的1. 5mL離心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-異戊醇，充分混勻后，常溫12000rpm離心15min，抽提1 2次，抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入兩倍體積的提前預(yù)冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，讓DNA沉淀充分析出，將析出的DNA沉淀轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mL70%酒精的1. 5mL離心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1濃度為10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，該過程得到的DNA樣品，稱為IstDNA ；④步驟③中轉(zhuǎn)移上清液后離心管底部的組織樣品，繼續(xù)加入500 μ 1的3% CTAB 提取液進(jìn)行提取，該組織樣共循環(huán)提取4次，依此又得到3批次DNA樣品，分別稱為2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。二、瓊脂糖凝膠電泳檢測本方法提取的基因組DNA如圖2，小麥和大麥進(jìn)行500 μ 1和1000μ 1提取液用量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，這兩個(gè)處理間每批次提取的基因組DNA產(chǎn)量差異不大，說明循環(huán)提取的方法比增加提取液用量的方法能有效的從植物組織中充分的提取基因組DNA。如圖2，采用上述方法所提取的DNA通過電泳檢測后，除了小麥的IstDNA可觀察到清晰的條帶外，其余3個(gè)物種都觀察不到條帶。4個(gè)物種的2nd和都觀察到清晰的條帶。 除高粱WhDNA沒有觀測到條帶外，小麥、大麥、玉米的WhDNA都觀測到清晰的條帶?？梢?，采用本發(fā)明方法所提取的小麥、大麥、高粱和玉米的基因組DNA產(chǎn)量高；而小麥、大麥、高粱和玉米四批次基因組DNA的差異可反應(yīng)出不同植物物種間葉片內(nèi)所含化學(xué)成分的異質(zhì)性；除小麥外，大麥、高粱和玉米基因組DNA的IstDNA瓊脂糖檢測不到，可反映成熟葉片內(nèi)較多的次生代謝產(chǎn)物嚴(yán)重影響了基因組DNA的提取。綜上所述可充分說明本發(fā)明方法適用的植物物種范圍較廣，且能從植物成熟葉片中提取到高產(chǎn)量的基因組DNA。三、PCR擴(kuò)增驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，大麥、高粱和玉米的IstDNAJndDNAJlrdDNA和4thDNA的ISSR擴(kuò)增電泳圖譜清晰、一致。小麥的2ndDNA JlrdDNA和fhDNA間擴(kuò)增電泳圖譜清晰、一致，而IstDNA稍異于其他三次電泳圖譜。說明本發(fā)明的基因組DNA提取方法從成熟葉片中得到的四批次DNA，PtDNA 中可能含有的次生代謝產(chǎn)物影響了 PCR擴(kuò)增，而后三次DNA質(zhì)量較高，滿足PCR的要求。
權(quán)利要求
1.一種植物基因組DNA的循環(huán)提取方法，其特征在于包括如下步驟①將植物組織樣品在液氮速凍下磨成細(xì)粉后，取0.3g轉(zhuǎn)入2mL離心管中；②加入500μ 1預(yù)熱的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴40min ；③12000rpm常溫離心15min，轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5mL離心管中，加入100μ 1的 24 1的氯仿-異戊醇，充分混勻后，常溫12000rpm離心15min，抽提1 2次，抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入兩倍體積的提前預(yù)冷到-20°C的100%酒精；放置于_20°C 冰柜30min，讓DNA沉淀充分析出，將析出的DNA沉淀轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mL70 %酒精的1. 5mL離心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，并用1μ 1濃度為10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，該過程得到的DNA樣品，稱為IstDNA ；④步驟③中轉(zhuǎn)移上清液后離心管底部的組織樣品，繼續(xù)加入500μ 1的3% CTAB提取液進(jìn)行提取，該組織樣共循環(huán)提取4次，依此又得到3批次DNA樣品，分別稱為2ndDNA、3rfDNA 和 4thDNA。
2.按權(quán)利要求1所述的一種植物基因組DNA的循環(huán)提取方法，其特征在于所述的 3% CTAB 提取液成分為3% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1. 4M NaCl，pH 值為8.0。
3.按權(quán)利要求1所述的一種植物基因組DNA的循環(huán)提取方法，其特征在于所述的 Ttl lE 成分為10mM Tris-HCl,0. ImM EDTA, pH 8. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物基因組DNA的循環(huán)提取方法，涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中植物基因組DNA分離提取技術(shù)。傳統(tǒng)基因組DNA提取步驟主要包括細(xì)胞的破碎、非DNA成分的抽提、DNA的析出、離子的去除、DNA的干燥和溶解。本方法在傳統(tǒng)基因組DNA提取步驟基礎(chǔ)上增加了組織樣品循環(huán)提取的步驟。具體是指1份組織樣可先后加入4次DNA提取液，進(jìn)行4次基因組DNA的分離過程，得到4次基因組DNA樣品。本方法適用的植物物種范圍較廣；能從植物葉片，尤其是成熟葉片中提取到高產(chǎn)量的基因組DNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102433324SQ201110453509
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者張玲玲, 彭俊華 申請人:中國科學(xué)院武漢植物園