專利名稱：一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種可改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑及其使用方法。
背景技術(shù)：
逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcripatase)是以RNA為模板,指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶，主要行使以下功能:依賴RNA或DNA為模板的DNA聚合作用；鏈轉(zhuǎn)換作用；降解RNA-DNA雜合體中的RNA的RNase H功能。因此逆轉(zhuǎn)錄酶常用于cDNA文庫的構(gòu)建。目前從鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus,簡稱AMV)中純化的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和從大腸桿菌(E.coli)中重組表達(dá)的莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoloneyMurine Leukemia Virus,簡稱M-MLV)中純化的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是兩種最為常用的逆轉(zhuǎn)錄酶。不管是AMV還是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，它們都有兩種主要的活性:RNA依賴的DNA合成酶活性和RNase H活性。其中RNase H活性會(huì)導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶催化效率低下，是合成全長cDNA所不希望具有的。一方面，RNase H同DNA合成酶相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA =DNA復(fù)合物中的RNA鏈，從而降低cDNA合成的產(chǎn)量，增加RNA模板的最小用量。另一方面，被RNase H活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了 cDNA合成的產(chǎn)量和長度。通常野生型M-MLV合成大于5kb的全長cDNA是不合適的。減弱或消除逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性能夠解決上述問題。目前，在構(gòu)建cDNA文庫和合成全長cDNA時(shí)使用最多的是通過基因重組技術(shù)得到的去除或削弱了 RNase H活性的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。也有文獻(xiàn)報(bào)道通過PEG修飾技術(shù)可得到RNase H活性去除了的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。關(guān)于既能減弱或去除逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性同時(shí)又不影響其RNA依賴的 DNA合成酶活性的非基因重組、非化學(xué)修飾技術(shù)，如添加劑技術(shù)還缺乏廣泛的研究成果和專利技術(shù)，相關(guān)的研究工作仍需要進(jìn)一步展開。另外,mRNA分子自身的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致部分mRNA難以合成第一鏈cDNA,進(jìn)而影響逆轉(zhuǎn)錄效率。比如，當(dāng)RNA分子的某些區(qū)域具有足夠的互補(bǔ)性而發(fā)生雜交并形成雙鏈RNA時(shí)，就能形成這些二級(jí)結(jié)構(gòu)。通常，可以通過提高RNA分子所處溶液的溫度來降低RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。因此，在許多情況中，希望在超過37°C的反應(yīng)條件下來逆轉(zhuǎn)錄RNA。然而，本領(lǐng)域已知的逆轉(zhuǎn)錄酶在大大超過37°C (如50°C)的溫度孵育時(shí)通常喪失活性。PCT專利《熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶及其用途》(專利申請(qǐng)?zhí)朇NO1810163.1)公開了一種通過突變或修飾技術(shù)增加了熱穩(wěn)定性、降低了末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、和/或增加了保真度的逆轉(zhuǎn)錄酶。該酶在加熱至50°C達(dá)5min后保留了至少95%的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。PCT專利《Production of Nucleic Acid》(專利申請(qǐng)?zhí)朩02009125006)公開了一種篩選蛋白的技術(shù)。通過該方法得到的逆轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas產(chǎn)品Maxima Reverse Transcriptase)在加熱至50°C達(dá)60min后保留了 90%以上的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。以上兩個(gè)專利均未涉及添加劑技術(shù)。
綜上所述，有必要繼續(xù)深入本領(lǐng)域研究，尋求除常用的基因重組技術(shù)之外的可用于改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑。本發(fā)明的另一目的在于提供一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方法。本發(fā)明的第一方面，提供一種能改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑，所述試劑為巰基封閉劑或二硫鍵還原劑或二者組合物。當(dāng)所述試劑僅含巰基封閉劑時(shí)，所述巰基封閉劑為碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸鈉、N-乙基馬來酰亞胺中的至少一種。其中，當(dāng)所述巰基封閉劑為碘乙酸時(shí)，最終使用濃度為1-lOmM，也可以是l_5mM。其中，當(dāng)所述巰基封閉劑為碘乙酰胺時(shí)，最終使用濃度為0.5-50mM,也可以是
0.5-lOmM。在另一優(yōu)選中，所述的巰基封閉劑為碘乙酸，最終使用濃度為1-lOmM，更優(yōu)選l-5mM，最優(yōu)選 2-4mM。在另一優(yōu)選中，所述的巰基封閉劑為碘乙酰胺，最終使用濃度為0.5-50禮，更優(yōu)選
0.5-10mM，最優(yōu)選 l-5mM。當(dāng)所述試劑僅含二硫鍵還原劑時(shí)，所述二硫鍵還原劑為2-巰基乙醇、半胱氨酸 鹽酸、二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦 鹽酸鹽、2-巰基乙胺 鹽酸、二硫赤酰糖醇中的至少一種。其中，當(dāng)所述二硫鍵還原劑為二硫蘇糖醇時(shí)，最終使用濃度為l_50mM，也可以是l_30mMo其中，當(dāng)所述二硫鍵還原劑為2-巰基乙醇時(shí)，最終使用濃度為5-300mM，也可以是5-100mMo其中，當(dāng)所述二硫鍵還原劑為三(2-羧乙基)膦_鹽酸鹽時(shí)，最終使用濃度為
0.lmM-20mM,也可以是 0.1mM-lOmM。在另一優(yōu)選中,所述的二硫鍵還原劑為二硫蘇糖醇,最終使用濃度為l_50mM,更優(yōu)選 l_30mM，最優(yōu)選 l-20mM。在另一優(yōu)選中，所述的二硫鍵還原劑為2-巰基乙醇，最終使用濃度為5-300mM，更優(yōu)選 5-200mM，最優(yōu)選 30-100mM。在另一優(yōu)選中，所述的二硫鍵還原劑為三(2-羧乙基)膦 鹽酸鹽，最終使用濃度為 0.l-20mM,更優(yōu)選 0.1-1OmM,最優(yōu)選 0.5_10mM。當(dāng)所述試劑為巰基封閉劑和二硫鍵還原劑的組合物時(shí)，所述巰基封閉劑選自碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸鈉、N-乙基馬來酰亞胺中的至少一種，所述二硫鍵還原劑選自2-巰基乙醇、半胱氨酸 鹽酸、二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦 鹽酸鹽、2-巰基乙胺 鹽酸、二硫赤酰糖醇中的至少一種。本發(fā)明的第二方面，提供一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方 法，包括以下步驟:將所述試劑配置成特定濃度的母液，然后將逆轉(zhuǎn)錄酶溶液加入到母液中，或?qū)⒛敢杭尤氲侥孓D(zhuǎn)錄酶溶液中，使所述試劑濃度達(dá)到最終使用濃度。
其中，所述試劑的母液濃度可以是最終使用濃度的2-100倍，也可以是最終使用濃度的2-20倍。在另一優(yōu)選中，所述的母液濃度為最終使用濃度的2-100倍，更優(yōu)選2-20倍，最優(yōu)選2-10倍。本發(fā)明的第三方面，涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明所公開的試劑和逆轉(zhuǎn)錄酶，涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明所公開的用于改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑，涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有通過本發(fā)明所公開的試劑和方法得到的逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明公開的試劑還可以任選多元醇、多糖的一種或多種。多元醇包括但不僅限于甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇、木糖醇等。多糖包括但不僅限于葡萄糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、菊糖。本發(fā)明公開的試劑還可以任選緩沖劑，任選非離子型去污劑，任選金屬鹽，任選還含有金屬離子螯合劑。本發(fā)明的其他方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了 50mM DTT處理后的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶50°C熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。其中，A:50mM DTT處理后的M-MLV。B:對(duì)照，M-MLV (RNase H-)(其他公司產(chǎn)品)。C:對(duì)照，M-MLV (思洛生物公司產(chǎn)品)。D:對(duì)照，M-MLV (其他公司產(chǎn)品)。圖2顯示了用30mM DTT處理后的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA合成的結(jié)果。其中，A、B、C對(duì)應(yīng)的cDNA長度分別為9kb、12kb、14kb。圖3顯示了用30mM DTT處理后的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增HCV基因組RNA的試驗(yàn)結(jié)果。其中，圖3(A)為擴(kuò)增曲線，圖3(B)為線性關(guān)系。圖4顯示了用60mM DTT處理后的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶分別在42°C、45°C、50°C、55°C、60°C下擴(kuò)增MS2基因組RNA的試驗(yàn)結(jié)果。其中，A:對(duì)照，M-MLV(RNase H-)(其他公司產(chǎn)品)，B:60mM DTT 處理后的 M-MLV。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將一定濃度范圍的巰基封閉劑或二硫鍵還原劑或二者組合物以適當(dāng)?shù)谋壤c逆轉(zhuǎn)錄酶溶液混合后，可以部分或全面改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶以下各項(xiàng)性能:(a) RNase H活性降低或顯著降低；(b) RNA或DNA依賴的DNA合成酶活性耐熱性能提高或顯著提高；(c)合成的cDNA更長、產(chǎn)量更高；(d)靈敏度提高。如本領(lǐng)域所知，巰基封閉劑可以抑制RNase H酶的活性，未見將巰基封閉劑用于抑制逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性以得到去除或削弱了 RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的報(bào)道。低濃度的還原劑起保護(hù)蛋白-SH的作用，可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的二硫鍵。而高濃度的還原劑可以破壞已經(jīng)形成的二硫鍵甚至可以還原大多數(shù)蛋白的半胱氨酸殘基。雖然不希望受理論約束，但認(rèn)為，通過本發(fā)明公布的試劑和方法可使逆轉(zhuǎn)錄酶部分巰基被封閉(如碘乙酰胺可烷基化組氨酸和半胱氨酸)，或者部分二硫鍵重新形成和排布，可能導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶的天然構(gòu)象被改變，最終表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)錄酶部分性能被改變。如本領(lǐng)域所知，通過基因重組、氨基酸修飾等技術(shù)可使逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域和合成酶結(jié)構(gòu)域的鏈接處的構(gòu)象、功能亞基與結(jié)構(gòu)亞基接觸面的構(gòu)象、RNase H活性中心引物捕獲(primer grip)結(jié)構(gòu)、a-螺旋和頸環(huán)(a-helix、loop)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變,促使RNase H活性中心對(duì)底物不敏感或無法準(zhǔn)確與底物契合，從而導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性下降或丟失(參考文獻(xiàn)作者及出處:Sharon J.Schultz, James J.Champoux, Virus Research:134(2008)86-103)。任選多元醇或(和)多糖可提高逆轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定性。多羥基化合物能夠與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，有助于蛋白質(zhì)優(yōu)先水化，形成溶劑層。糖是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑。多糖，尤其是二糖的存在能夠影響蛋白質(zhì)的重折疊過程，從而提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。同時(shí)，多羥基化合物和多糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與所選試劑本身及蛋白質(zhì)的種類有關(guān)。任選緩沖劑、非離子型去污劑、金屬鹽、金屬離子螯合劑對(duì)于維持逆轉(zhuǎn)錄酶活性、提高其穩(wěn)定性來說是必需的。根據(jù)不同的需要，本發(fā)明涉及的試劑可以配置成母液形式，在使用時(shí)進(jìn)行稀釋，也可制備成能夠直接與逆轉(zhuǎn)錄酶混合的各種形式。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn):(I)本發(fā)明公布的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方法是有別于基因重組技術(shù)和化學(xué)修飾技術(shù)之外的一種添加劑技術(shù)，主要通過添加特定的化學(xué)試劑來達(dá)到改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的目的。 (2)本發(fā)明公布的試劑和方法能有效的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶的性能，使之具有更強(qiáng)的延伸能力，更高的反應(yīng)靈敏度，可以使用較高的反轉(zhuǎn)錄溫度，克服了因模板RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)引起的反轉(zhuǎn)錄困難，適合用于構(gòu)建高比例的全長cDNA文庫和合成較長cDNA。(3)本發(fā)明所采用試劑的母液配置及存儲(chǔ)簡單方便，且用量小，成本低。(4)本發(fā)明公布的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方法可用于改進(jìn)M-MLV、AMV、HIV等逆轉(zhuǎn)錄酶的性能并批量生產(chǎn)，創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)用語和科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。實(shí)施例1按9:1的體積比將野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(思洛生物，包含ImM DTT)加入到以下描述的A試劑中。吹打混勻數(shù)分鐘后，按9: I的體積比將所得酶液加入到以下描述的B試劑中。按以下配方配制A試劑:
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑，其特征在于，所述試劑為巰基封閉劑或二硫鍵還原劑或二者組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑為巰基封閉劑。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述的巰基封閉劑為碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸鈉(Methyl methanethiosulfonat, MMTS)、N-乙基馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide, NEM)中的至少一種。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述巰基封閉劑為碘乙酸，最終使用濃度為1-lOmM。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述巰基封閉劑為碘乙酰胺，最終使用濃度為 0.5-50mM。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑為二硫鍵還原劑。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑，其特征在于，所述二硫鍵還原劑為2-巰基乙醇、半胱氨酸 鹽酸、二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦 鹽酸鹽、2-巰基乙胺 鹽酸、二硫赤酰糖醇中的至少一種。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于，所述二硫鍵還原劑為二硫蘇糖醇，最終使用濃度為l_50mM。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于，所述二硫鍵還原劑為2-巰基乙醇，最終使用濃度為5-300mM。
10.如權(quán)利要求7所述 的試劑，其特征在于，所述二硫鍵還原劑為三(2-羧乙基)膦 鹽酸鹽，最終使用濃度為0.l-20mM。
11.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑為巰基封閉劑和二硫鍵還原劑的組合物。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述巰基封閉劑選自碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸鈉、N-乙基馬來酰亞胺中的至少一種，所述二硫鍵還原劑選自2-巰基乙醇、半胱氨酸.鹽酸、二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦.鹽酸鹽、2-巰基乙胺.鹽酸、二硫赤酰糖醇中的至少一種。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的試劑，其特征在于，所述試劑任選還含有緩沖劑，任選還含有非離子型去污劑，任選還含有金屬鹽，任選還含有金屬離子螯合劑，任選還含有選自多元醇、多糖的一種或多種試劑。
14.如權(quán)利要求12所述的試劑，其特征在于，所述多元醇選自甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇、木糖醇中的至少一種。
15.如權(quán)利要求12所述的試劑，其特征在于，所述多糖選自葡萄糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、菊糖中的至少一種。
16.一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方法，其特征在于，包括步驟:將權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的試劑配置成特定濃度的母液，然后將逆轉(zhuǎn)錄酶溶液加入到母液中，或?qū)⒛敢杭尤氲侥孓D(zhuǎn)錄酶溶液中，使所述試劑濃度達(dá)到最終使用濃度。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述試劑的母液濃度為最終使用濃度的2-100 倍。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)、RSV(勞氏肉瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)，RAV (勞氏伴隨病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)、AMV (鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒)、HIV (人免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)中的至少一種。
19.如權(quán)利要求18所述的逆轉(zhuǎn)錄酶，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，用所述方法得到的逆轉(zhuǎn)錄酶具有選自下組的一項(xiàng)或多項(xiàng)特性: (a)RNase H活性降低或顯著降低； (b)RNA或DNA依賴的DNA合成酶活性耐熱性能提高或顯著提高； (c)合成的cDNA更長、產(chǎn)量更高； (d)靈敏度提聞。
21.—種試劑盒，所述試劑盒含有權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的試劑和逆轉(zhuǎn)錄酶。
22.—種試劑盒，所述試劑盒含有權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的用于改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑。
23.—種試劑盒，所述試劑盒含有通過權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的試劑和方法得到的逆轉(zhuǎn)錄酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的試劑，所述試劑的主要成分為巰基封閉劑或二硫鍵還原劑或二者組合物。本發(fā)明還公開了一種改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶性能的方法，包括將巰基封閉劑或二硫鍵還原劑或二者組合物入到所述的逆轉(zhuǎn)錄酶中。本發(fā)明公布的試劑及方法能夠有效地改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄酶的性能，使之具有更強(qiáng)的延伸能力，更高的反應(yīng)靈敏度，可以使用較高的反轉(zhuǎn)錄溫度，克服了因模板RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)引起的反轉(zhuǎn)錄困難，適合用于構(gòu)建高比例的全長cDNA文庫和合成較長cDNA。
文檔編號(hào)C12N9/12GK103184198SQ20111045359
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:思洛生物技術(shù)股份有限公司