專利名稱：去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白a、純化方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肺炎鏈球菌表面蛋白A的部分序列替換的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A，表達(dá)，純化方法及用途。
背景描述
肺炎球菌(Str印tococcus pneumoniae)，又稱肺炎鏈球菌，是有莢膜的革蘭氏陽(yáng)性雙球菌。多糖莢膜是主要的毒力因子，根據(jù)莢膜的組成差異，已鑒定出約90個(gè)不同的肺炎球菌血清型。肺炎球菌可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥、中耳炎等疾病，在2歲以下嬰幼兒和老年人中發(fā)病率最高，已成為世界范圍內(nèi)引起死亡的重要原因之一。據(jù)WHO 2005年估計(jì)， 全球每年有160萬(wàn)人死于各類肺炎球菌疾病，其中包括70-100萬(wàn)5歲以下的兒童，多數(shù)死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。在我國(guó)，肺炎也是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的頭號(hào)殺手之一。HIV感染以及與免疫缺陷相關(guān)的其他疾病大大增加了感染肺炎球菌疾病的可能性。日益增加的肺炎球菌耐藥性問(wèn)題也使開發(fā)疫苗以控制肺炎球菌性疾病變得更為迫切。當(dāng)前，甲型Hmi流感在全球肆虐，由其引發(fā)的呼吸道并發(fā)感染肺炎往往導(dǎo)致極大的死亡率，各國(guó)政府在大力投入開發(fā)該流感疫苗的同時(shí)倡導(dǎo)接種肺炎球菌疫苗。為了降低肺炎球菌感染與攜帶率，保障人民健康，預(yù)防與遏制疾病蔓延，接種肺炎球菌疫苗非常必要。WHO在2007年建議發(fā)展中國(guó)家將肺炎球菌結(jié)合疫苗納入國(guó)家免疫計(jì)劃。
目前市場(chǎng)上供應(yīng)的肺炎球菌疫苗產(chǎn)品主要為多糖疫苗和結(jié)合疫苗。其中23價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗的抗原為胸腺非依賴型，對(duì)嬰幼兒及老年人的免疫效果弱，主要用于有肺炎球菌性疾病高風(fēng)險(xiǎn)的大齡兒童和成年人，不能用于2歲以下的兒童。蛋白多糖結(jié)合疫苗如7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗(PCV-7)，在各年齡組的免疫原性都很強(qiáng)，但目前只批準(zhǔn)用于5歲以下兒童，且其只覆蓋的7個(gè)血清型，僅占亞洲地區(qū)致病血清型的55%，使得應(yīng)用過(guò)程中可能出現(xiàn)血清型的替換。目前PCV-7的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)價(jià)860元/劑，2歲以下幼兒需接種3-4次， 價(jià)格較高。國(guó)內(nèi)外肺炎疫苗市場(chǎng)巨大，開發(fā)新型高效且低成本的疫苗勢(shì)在必行，國(guó)內(nèi)外正在加緊研制重組蛋白疫苗及DNA新型疫苗。重組蛋白疫苗的開發(fā)主要集中在I^pA、PsaA和溶血素等重要候選蛋白上，其中I3SpA是最具有潛力且研究最多的候選蛋白之一。
PspA，肺炎球菌表面蛋白A，廣泛存在于90種肺炎球菌血清型中，不同血清型的肺炎球菌I^spA蛋白分子質(zhì)量不同，介于60 lOOKa。I^spA分子可分為兩大家族，五個(gè)亞群 (clade)。I^spA主要由五個(gè)域組成從N端到C端依次分為信號(hào)肽、超螺旋區(qū)、組氨酸富集區(qū)、膽堿結(jié)合區(qū)和C端尾巴。超螺旋區(qū)是一個(gè)重要的抗原決定區(qū)域。單克隆抗體識(shí)別的位點(diǎn)在N端，該區(qū)具有高度可變性。在不同血清型中，PspA的C端疏水區(qū)具有保守結(jié)構(gòu)。I^pA 主要作用是與乳鐵蛋白結(jié)合使之喪失功能并抑制補(bǔ)體活化，降低Ob在肺炎球菌表面的沉淀從而干擾補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬調(diào)理作用。該蛋白具有高效的免疫原性，在小鼠中研究證明， I3SpA蛋白可以激發(fā)對(duì)肺炎球菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
Sanofi Pasteur (賽諾菲-巴斯德)和 University of Alabama at Birmingham(UAB)合作研發(fā)I^spA疫苗，并完成了兩個(gè)疫苗產(chǎn)品的臨床一期實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明有非常好的保護(hù)作用。但在采用PspA(RX-l亞型)作為保護(hù)性抗原進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，同時(shí)也在部分試驗(yàn)者身上觀察到抗人體心肌肌球蛋白的抗體短暫升高?？剐募〉鞍卓贵w在人體中正常存在，目前尚且缺乏顯示抗心肌肌球蛋白抗體可導(dǎo)致疾病的臨床證據(jù)，但是仍存在安全隱患，對(duì)I3SpA疫苗的應(yīng)用推廣帶來(lái)巨大障礙，降低I^spA和心肌蛋白交叉反應(yīng)非常必要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服野生型肺炎表面蛋白A作為抗原的不足，提供一種去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的用途。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的基因。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有表達(dá)人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A，是序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
上述去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A在制備預(yù)防肺炎鏈球菌感染的疫苗中的應(yīng)用。
表達(dá)去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的基因，是所述表達(dá)序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表達(dá)序列表SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
含有表達(dá)去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體，將序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表達(dá)載體PET9a中得到重組載體1 ；或?qū)⑿蛄斜鞸EQ ID No. 4所示基因插入到表達(dá)載體PET9a中得到重組載體2。
含有去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株，將所述重組載體1導(dǎo)入到大腸桿菌E. Coli BL21中或?qū)⑺鲋亟M載體2導(dǎo)入到大腸桿菌E. Coli BL21中得到含有去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株。
去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法，包括如下步驟
(1)發(fā)酵含有去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株；
(2)將菌株發(fā)酵液7200rpm離心15分鐘，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩爾/升 tris重懸沉淀，勻漿細(xì)胞破碎，8000rpm離心30分鐘，取上清液；
(3)批次吸附將Q sepharose fast flow與步驟(2)獲得的上清液混合攪拌吸附2小時(shí)，緩沖體系為pH = 8. 0的20毫摩爾/升tris ；以3_5倍所述步驟(2)獲得的上清液體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將吸附產(chǎn)物洗脫，以3-5 倍樣品體積的含350-450毫摩爾/升的氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，得到Elute產(chǎn)物；
(4)將Elute產(chǎn)物用pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(5) Q柱準(zhǔn)備以3-5倍的柱體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡Q柱；
(6)上樣將步驟(4)得到的產(chǎn)物上樣Q柱；
(7)以3-5倍柱體積的含有50-150毫摩爾氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用3-5倍柱體積的含有160-300毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；
(8)將步驟(7)獲得的產(chǎn)物以PH = 4.0的20毫摩爾/升檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(9) SP柱準(zhǔn)備以3-5倍的柱體積的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡SP柱；
(10)上樣將步驟⑶獲得的產(chǎn)物上樣SP柱；
(11)以3-5倍柱體積的含有250-350毫摩爾/升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用3-5倍柱體積的含有450-550毫摩爾/ 升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；得到純度 90%以上的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
一種去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A具有不弱于野生型肺炎鏈球菌表面蛋白A(RX-1亞型)的抗原性和保護(hù)性，而降低了肺炎鏈球菌表面蛋白A(RX-1亞型)和人體心肌肌球蛋白的同源性。使其安全的應(yīng)用于疫苗的開發(fā)。


圖1為來(lái)源于肺炎不同菌株的16個(gè)氨基酸，去取代野生型肺炎表面蛋白(RX-1亞型)序列中與人心肌肌球蛋白具有高度同源性的16個(gè)氨基酸，形成的新的肺炎表面蛋白 (RX-1亞型)的突變株。而后將突變株及野生型自身序列，經(jīng)I^irCOil2類似軟件分析，其 16個(gè)氨基酸所形成α -螺旋結(jié)構(gòu)的可能性，對(duì)于形成的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，其分析圖譜。
Α:野生型肺炎表面蛋白PspA-RX-I，B 肺炎表面蛋白PspA-RX-l_BG9739 (SEQ ID No. 1)，C 肺炎表面蛋白 PspA-RX-l-BG3^6 (SEQ ID No. 2)，D 肺炎表面蛋白 PspA-RX-1-self。
圖 2為肺炎表面蛋白 A(PspA-RX-I， PspA-RX-l-BG9739(Mutantl)， PspA-RX-l-BG3296 (Mutant2))純化的 SDS-PAGE 電泳圖。
從右向左1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；2為I3SpA-RX-I ；3為 ^ρΑ-ΚΧ-1_Β69739 ；4為 PspA-RX-l-BG3296
圖 3 為小鼠免疫肺炎表面蛋白 PspA-RX-I，PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3^6 而產(chǎn)生的抗體水平。
圖 4 為免疫肺炎表面蛋白 PspA-RX-I，PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3^6 的小鼠，經(jīng)肺炎鏈球菌毒攻試驗(yàn)的保護(hù)率。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1
①，通過(guò)序列同源性軟件分析確定了 PspA-RX-I亞型蛋白中16個(gè)氨基酸序列與人心肌肌球蛋白一段序列具有高度同源性，這樣若使用I^pA-RX-I作為免疫性抗原的話，存在免疫安全隱患。這16個(gè)氨基酸序列為EAKAKLEEAEKKATEA
②，采用Paircoil2類似軟件分析這16個(gè)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)，并從其他亞型的 I^spA分子中挑選出不同的16個(gè)氨基酸片段對(duì)野生型的PspA-RX-I的16個(gè)氨基酸序列進(jìn)行替換，形成新的 PspA-RX-I 序列，即 PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3296,再通過(guò)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬，將模擬的結(jié)構(gòu)與野生型PspA-RX-I的結(jié)構(gòu)對(duì)比預(yù)測(cè)，我們選擇了相對(duì)于野生型I3SpA-RX-I結(jié)構(gòu)變化最小的兩個(gè)I3SpA-RX-I的突變株Ι^ρΑ-ΚΧ-1-Β69739， PspA-RX-l-BG3296
③，PspA-RX-I野生型序列中的16個(gè)氨基酸EAKAKLEEAEKKATEA，分別被 EAEKKVTEARQKLDAE (來(lái)源于肺炎鏈球菌BG9739)和EAI^QNKLAAKKAELAKK (來(lái)源于肺炎鏈球菌 BG3296)取代。
得到去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A，分別用序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或用序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
實(shí)施例2
表達(dá)去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的基因，是所述表達(dá)序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表達(dá)序列表SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
SEQ ID No. 3 所示基因是 PspA-RX_l_BG9739 基因用 DNA2. 0 優(yōu)化了的 DNA 序列；
SEQ ID No. 4 所示基因是 PspA_RX-l_BG3^6 基因用 DNA2. 0 優(yōu)化了的 DNA 序列。
實(shí)施例3
含有表達(dá)去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體，將序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表達(dá)載體PET9a中得到重組載體1 ；或?qū)⑿蛄斜鞸EQ ID No. 4所示基因插入到表達(dá)載體PET9a中得到重組載體2。
實(shí)施例4
含有去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株，將所述重組載體1導(dǎo)入到大腸桿菌E. Coli BL21中或?qū)⑺鲋亟M載體2導(dǎo)入到大腸桿菌E. Coli BL21中得到含有去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株。
在BL21大腸桿菌中重組表達(dá)。在加入IPTG后，目的蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。
實(shí)施例5
去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法(SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 都是分別采用本實(shí)施例的方法純化)，包括如下步驟
(1)發(fā)酵實(shí)施例4制備的含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株；
(2)將所述菌株發(fā)酵液7200rpm離心15分鐘，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩爾/升tris重懸沉淀，勻漿細(xì)胞破碎，8000rpm離心30分鐘，取上清液；
(3)批次吸附將Q sepharose fast flow與步驟(2)獲得的上清液混合攪拌吸附2小時(shí)，緩沖體系為pH = 8. 0的20毫摩爾/升tris ；以4倍所述步驟(2)獲得的上清液體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液將吸附產(chǎn)物洗脫，以4倍樣品體積的含400毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，得到Elute產(chǎn)物；
(4)將Elute產(chǎn)物用pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(5) Q柱準(zhǔn)備以4倍的柱體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡Q柱；
(6)上樣將步驟(4)得到的產(chǎn)物上樣Q柱；
(7)以3-5倍柱體積的含有100毫摩爾氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用4倍柱體積的含有250毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；
(8)將步驟(7)獲得的產(chǎn)物以PH = 4.0的20毫摩爾/升檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(9) SP柱準(zhǔn)備以4倍的柱體積的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡SP柱；
(10)上樣將步驟⑶獲得的產(chǎn)物上樣SP柱；
(11)以4倍柱體積的含有300毫摩爾/升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用4倍柱體積的含有500毫摩爾/升氯化鈉的pH =4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；得到純度90%以上的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白。(圖2)。
實(shí)施例6 將 PspA-RX-1，PspA-RX+BG9739 (SEQ ID No. 1)禾口 PspA-RX-l-BG3296 (SEQ ID No. 2)各50ug，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。0，14天各免疫兩次。用磷酸鋁佐劑最為陰性對(duì)照。在28天采血進(jìn)行抗體測(cè)量，并用500CFU的肺炎鏈球菌進(jìn)行靜脈注射。監(jiān)測(cè)小鼠的存活能力。其抗體水平圖3。該數(shù)據(jù)顯示，用PspA-RX-l-BG9739和 PspA-RX-l-BG3296進(jìn)行免疫，可以產(chǎn)生Anti-RX-I的抗體，其水平在統(tǒng)計(jì)上不低于用野生型RX-I抗原進(jìn)行免疫的水平。
小鼠存活的天數(shù)為圖4所示。顯示出Mutantl和Mutant 2具有和RX-1野生型蛋白相同的保護(hù)力。而磷酸鋁佐劑不具有保護(hù)力。
我們?cè)贗^pA-RX-I亞型蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)16個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽片段。其序列為EAKAKLEEAEKKATEA。該序列和人的心肌肌球蛋白的序列有高度相似。
本發(fā)明針對(duì)野生型PspA-RX-I抗原決定簇與人體心肌肌球蛋白的具有高度同源性的16個(gè)氨基酸在保證結(jié)構(gòu)變化影響最小的情況下進(jìn)行氨基酸替換。新生產(chǎn)的兩個(gè)分子具有不弱于野生型I3SpA-RX-I的抗原性和保護(hù)性，而降低了 PspA-RX-I和人蛋白的同源性。 使其安全的應(yīng)用于疫苗的開發(fā)。
我們從其他亞型的I^spA分子中挑選出不同的16個(gè)氨基酸片段進(jìn)行分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬(采用Paircoil2類似軟件，圖1)。對(duì)比預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們選擇了結(jié)構(gòu)變化最小的兩個(gè)PspA-RXl的突變株。其中PspA野生型序列中的16個(gè)氨基酸EAKAKLEEAEKKATEA，分別被EAEKKVTEARQKLDAE (來(lái)源于肺炎鏈球菌BG9739)和EAI^QNKLAAKKAELAKK (來(lái)源于肺炎鏈球菌BG3^6)取代。
我們通過(guò)與UAB 大學(xué)合作，以 PspA-RX-1, PspA_RX-l_BG9739 (SEQ ID No. 1)和 PspA-RX-l-BG3296 (SEQ ID No. 2)進(jìn)行動(dòng)物免疫性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)替換16個(gè)氨基酸以后形成的兩個(gè)突變 PspA-RX-l-BG9739(SEQ ID No. 1)和 PspA-RX-l_BG3296 (SEQ ID No. 2)與野生型 PspA-RX-I具有相同的毒攻保護(hù)性
實(shí)施例7
去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法，包括如下步驟
(1)發(fā)酵實(shí)施例4制備的含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株；
(2)將所述菌株發(fā)酵液7200rpm離心15分鐘，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩爾 /升tris重懸沉淀，勻漿細(xì)胞破碎，8000rpm離心30分鐘，取上清液；
(3)批次吸附將Q sepharose fast flow與步驟⑵獲得的上清液混合攪拌吸附2小時(shí)，緩沖體系為pH = 8. 0的20毫摩爾/升tris ；以3倍所述步驟(2)獲得的上清液體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液將吸附產(chǎn)物洗脫，以3倍樣品體積的含350毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，得到Elute產(chǎn)物；
(4)將Elute產(chǎn)物用pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(5) Q柱準(zhǔn)備以3倍的柱體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡Q柱；
(6)上樣將步驟(4)得到的產(chǎn)物上樣Q柱；
(7)以3倍柱體積的含有50毫摩爾氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用3倍柱體積的含有160毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4的20 毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；
(8)將步驟(7)獲得的產(chǎn)物以pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(9) SP柱準(zhǔn)備以3倍的柱體積的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡SP柱；
(10)上樣將步驟⑶獲得的產(chǎn)物上樣SP柱；
(11)以3倍柱體積的含有250毫摩爾/升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用3倍柱體積的含有450毫摩爾/升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；得到純度90%以上的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白。
實(shí)施例8
去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法，包括如下步驟
(1)發(fā)酵實(shí)施例4制備的含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株；
(2)將所述菌株發(fā)酵液7200rpm離心15分鐘，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩爾 /升tris重懸沉淀，勻漿細(xì)胞破碎，8000rpm離心30分鐘，取上清液；
(3)批次吸附將Q sepharose fast flow與步驟(2)獲得的上清液混合攪拌吸附2小時(shí)，緩沖體系為pH = 8. 0的20毫摩爾/升tris ；以5倍所述步驟(2)獲得的上清液體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液將吸附產(chǎn)物洗脫，以5倍樣品體積的含450毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，得到Elute產(chǎn)物；
(4)將Elute產(chǎn)物用pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(5) Q柱準(zhǔn)備以5倍的柱體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡Q柱；
(6)上樣將步驟(4)得到的產(chǎn)物上樣Q柱；
(7)以5倍柱體積的含有150毫摩爾氯化鈉的pH = 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用5倍柱體積的含有300毫摩爾/升氯化鈉的pH = 5. 4 的20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；
(8)將步驟(7)獲得的產(chǎn)物以pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；
(9) SP柱準(zhǔn)備以5倍的柱體積的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡SP柱；
(10)上樣將步驟⑶獲得的產(chǎn)物上樣SP柱；
(11)以5倍柱體積的含有350毫摩爾/升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用5倍柱體積的含有550毫摩爾/升氯化鈉的pH = 4. 0的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；得到純度90%以上的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白。
權(quán)利要求
1.去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A，其特征是所述去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A是序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A在制備預(yù)防肺炎鏈球菌感染的疫苗的應(yīng)用。
3.表達(dá)權(quán)利要求1所述去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的基因，其特征是所述表達(dá)序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表達(dá)序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
4.含有表達(dá)人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體，其特征是將序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表達(dá)載體PET9a中得到重組載體1 ；或?qū)⑿蛄斜鞸EQ ID No. 4所示基因插入到表達(dá)載體PET9a中得到重組載體2。
5.含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株，其特征是將所述重組載體1導(dǎo)入到大腸桿菌E. Coli BL21中或?qū)⑺鲋亟M載體2導(dǎo)入到大腸桿菌E. Coli BL21 中得到含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株。
6.去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法，其特征是包括如下步驟(1)發(fā)酵權(quán)利要求4制備的含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株；(2)將所述菌株發(fā)酵液7200rpm離心15分鐘，收集沉淀，用pH= 8. O 20毫摩爾/升 tris重懸沉淀，勻漿細(xì)胞破碎，8000rpm離心30分鐘，取上清液；(3)批次吸附將Qsepharose fast flow與步驟(2)獲得的上清液混合攪拌吸附2 小時(shí)，緩沖體系為pH = 8. O的20毫摩爾/升tris ；以3_5倍所述步驟(2)獲得的上清液體積的pH = 5. 4的濃度為20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將吸附產(chǎn)物洗脫，以 3-5倍樣品體積的含350-450毫摩爾/升的氯化鈉pH = 5. 4的濃度為20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，得到Elute產(chǎn)物；(4)將Elute產(chǎn)物用pH= 5. 4的20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；(5)Q柱準(zhǔn)備以3-5倍的柱體積的pH = 5. 4的20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡Q柱；(6)上樣將步驟(4)得到的產(chǎn)物上樣Q柱；(7)以3-5倍柱體積的含有50-150毫摩爾氯化鈉的pH= 5. 4的20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用3-5倍柱體積的含有160-300毫摩爾/升氯化鈉的 PH = 5. 4 20毫摩爾/升檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；(8)將步驟(7)獲得的產(chǎn)物以pH= 4.0 20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理；(9)SP柱準(zhǔn)備以3-5倍的柱體積的pH = 4. 0 20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡SP柱；(10)上樣將步驟⑶獲得的產(chǎn)物上樣SP柱；(11)以3-5倍柱體積的含有250-350毫摩爾/升氯化鈉的pH= 4. 0 20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫，再用3-5倍柱體積的含有450-550毫摩爾/升氯化鈉的PH = 4.0 20毫摩爾/升檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Elute洗脫；得到純度90%以上的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A、純化方法及用途，所述去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A是序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的一種去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A具有不弱于野生型肺炎鏈球菌表面蛋白A(RX-1亞型)的抗原性和保護(hù)性，而降低了肺炎鏈球菌表面蛋白A(RX-1亞型)和人體心肌肌球蛋白的同源性。使其安全的應(yīng)用于疫苗的開發(fā)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102516373SQ20111045504
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者宇學(xué)峰, 朱濤, 程昆明, 邵忠琦 申請(qǐng)人:天津康希諾生物技術(shù)有限公司