專(zhuān)利名稱(chēng)：一種多種蛋白共表達(dá)載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的一種用于多種蛋白共表達(dá)的載體的構(gòu)建方法，屬生物和醫(yī)藥新技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為實(shí)現(xiàn)在同個(gè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多種蛋白，常用的手段是質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)，但質(zhì)粒的不相容性常會(huì)導(dǎo)致一種質(zhì)粒的丟失，同時(shí)是否能夠?qū)崿F(xiàn)兩個(gè)質(zhì)粒在陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率上一致也存在一定的困難。因此如果一個(gè)質(zhì)粒能夠表達(dá)多種蛋白將會(huì)有很大的優(yōu)勢(shì)。目前利用一種質(zhì)粒表達(dá)多種蛋白的常用手段為加入IRES(核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn))序列，對(duì)一種以上的蛋白進(jìn)行表達(dá)。目前常用的是EMCV的IRES序列，但是IRES介導(dǎo)的翻譯效率不可控，表達(dá)不太穩(wěn)定。利用關(guān)于多啟動(dòng)子的報(bào)道多是基于串聯(lián)多個(gè)啟動(dòng)子共同調(diào)控同一個(gè)蛋白的表達(dá)，目的是增強(qiáng)外源基因的表達(dá)率。本方法的思路在于在同一個(gè)質(zhì)粒中插入多個(gè)同樣的啟動(dòng)子序列及下游的PolyA序列，這樣就能保證所需表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上處于完全一致的水平。而后續(xù)的翻譯水平可以通過(guò)修飾AUG周?chē)男蛄羞M(jìn)行更精確的不同基因蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。因此，本方法能夠使得同一個(gè)載體上實(shí)現(xiàn)多種基因共表達(dá)，也使得各基因表達(dá)產(chǎn)物按照規(guī)定的比例進(jìn)行生成成為可能。通過(guò)本方法可以用于實(shí)現(xiàn)多種外源蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的按定量的比例進(jìn)行表達(dá)、也可以用于多種蛋白相互作用及示蹤定位等研究，具有很大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目 的在于提供一種多種蛋白共表達(dá)載體構(gòu)建的方法，從而可以多種蛋白的共表達(dá)。本發(fā)明利用在同一載體中插入多個(gè)同一的啟動(dòng)子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR.ALV-LTA等)及下游的polyA序列，這樣就能保證所需表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上處于完全一致的水平。而后續(xù)的翻譯水平可以通過(guò)修飾AUG周?chē)男蛄羞M(jìn)行更精確的不同基因蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。以這樣的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，多種蛋白將能實(shí)現(xiàn)按固定比例的定量表達(dá)。本發(fā)明所述的載體構(gòu)建的方法，主要為在同一載體中插入多個(gè)同一的啟動(dòng)子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保證各種基因在mRNA的水平一致性。本發(fā)明所述方法特征在于，以首先保證各種基因在mRNA的水平一致性，作為多種蛋白共同表達(dá)的基點(diǎn)。而后通過(guò)對(duì)AUG的優(yōu)化來(lái)實(shí)現(xiàn)多種基因能夠按固定比例進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是用同一的啟動(dòng)子及下游polyA序列來(lái)保證各個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)處于幾乎相同的環(huán)境，從而保證各種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA能處于一致的水平。該方法使得多種蛋白的共表達(dá)更加精確和穩(wěn)定，使得多種蛋白按設(shè)定比例進(jìn)行表達(dá)成為可能。


圖1雙啟動(dòng)子雙報(bào)告基因重組表達(dá)載體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。圖 2 重組質(zhì)粒 pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 酶切鑒定。Ml:M =Lambda DNA/Hind III Marker ；1:pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 經(jīng) XhoI, Sail 雙酶切后的 EGFP 條帶(720bp) ；2:pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 經(jīng) Xbal，MluI 雙酶切后的 DsRed 條帶(680bp) ；3:pC1-cmvDsRed-cmvEGFP經(jīng)Spel酶切,在201 Ibp出現(xiàn)特征性條帶,鑒定為順向連接雙啟動(dòng)子M2: DNAMarkerD。圖3、重組質(zhì)粒PC1-cmvDsRed-cmvEGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后紅綠熒光蛋白的表達(dá)情況。圖4、Western blot檢測(cè)紅綠熒光蛋白表達(dá)情況。1:轉(zhuǎn)染pCI_nEGFP的293T細(xì)胞中EGFP的相對(duì)表達(dá)量；2:轉(zhuǎn)染pC1-nDsRed的293T細(xì)胞中DsRed的相對(duì)表達(dá)量；3:轉(zhuǎn)染pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 的 293T 細(xì)胞中 EGFP 的相對(duì)表達(dá)量；4:轉(zhuǎn)染 pC1-cmvDsRed-cmvEGFP的293T細(xì)胞中DsRed的相對(duì)表達(dá)。實(shí)施例1pC1-cmvDsRed-cmvEGFP雙啟動(dòng)子載體的構(gòu)建a)pCI_EGFP 的構(gòu)建以Clontech的EGFPNl為模板，帶NheI酶切位點(diǎn)的正向引物EGFP-5 ^與帶NotI酶切位點(diǎn)的反向引物EGFP-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增EGFP編碼區(qū)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)NheI及NotI雙酶切回收之后，插回表達(dá)載體PCI的多克隆位點(diǎn)中，獲得pC1-EGFP質(zhì)粒。

b)pCI_DsRed 的構(gòu)建以Clontech的DsRedNl為模板，帶NheI酶切位點(diǎn)的正向引物DsRed-5'與帶NotI酶切位點(diǎn)的反向引物DsRed-3丨進(jìn)行PCR擴(kuò)增DsRed編碼區(qū)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)NheI及NotI雙酶切回收之后，插回表達(dá)載體PCI的多克隆位點(diǎn)中，獲得pC1-DsRed質(zhì)粒。c)雙啟動(dòng)子重組表達(dá)載體的構(gòu)建限制性?xún)?nèi)切酶BglII及BamH I雙酶切pC1-DsRed，割膠回收含有CMV啟動(dòng)子區(qū)的DsRed片段；限制性?xún)?nèi)切酶BglII單酶切pCI_EGFP，與含有CMV啟動(dòng)子區(qū)的DsRed片段在T4連接酶的作用連接(BamHI與BglII為同尾酶)。轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，酶切鑒定(圖2)，獲得含2個(gè)CMV啟動(dòng)子區(qū)的重組雙啟動(dòng)子雙報(bào)告基因的質(zhì)粒，命名為pC1-cmvDsRed-cmvEGFP，見(jiàn)圖1。實(shí)施例2pC1-cmvDsRed-cmvEGFP雙啟動(dòng)子載體表達(dá)分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染及觀(guān)察將293T 細(xì)胞按 2.0 X 105 個(gè) / 孔鋪 6 孔板，24h 后按照 TurboFect in vitroTransfection Reagent說(shuō)明書(shū)，每孔4 μ g質(zhì)粒,加入6 μ g的TurboFect 陽(yáng)離子復(fù)合物及無(wú)血清培養(yǎng)基共400 μ I室溫孵育二十分鐘，轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，48h后于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。每種載體設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯不，重組質(zhì)粒pC1-cmvDsRed-cmvEGFP轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞在倒置突光顯微鏡下均可觀(guān)察到不同強(qiáng)度的紅色及綠色熒光，見(jiàn)圖3。表明重組表達(dá)載體pC1-cmvDsRed-cmvEGFP在293T細(xì)胞中能夠同時(shí)且正確表達(dá)兩種信號(hào)蛋白。
Western Blot 分析收集轉(zhuǎn)染48h 后的 293T 細(xì)胞，用 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent抽提細(xì)胞全蛋白，采用Ant1-EGFP和Ant1-DsRed,按常規(guī)Western印跡方法進(jìn)行抗體雜交，檢測(cè)紅綠突光蛋白的表達(dá)。通過(guò)WesternBlot檢測(cè)紅綠突光蛋白的表達(dá)情況,如圖4所示，重組質(zhì)粒pC1-cmvDsRed-cmvEGFP中紅綠熒光蛋白的表達(dá)情況與熒光顯微鏡下觀(guān)察到的結(jié)果相一致。圖 4-A 顯示轉(zhuǎn)染了 pC1-nEGFP、pC1-nDsRed 及 pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 的 293T細(xì)胞中紅綠突光蛋白的Western Blot檢測(cè)的表達(dá)情況；通過(guò)圖像分析軟件“Image J”分析,結(jié)果如圖4-B所示,可見(jiàn)重組質(zhì)粒pC1-cmvDsRed-cmvEGFP能正確表達(dá)紅綠突光蛋白，且表達(dá)量與對(duì)照組pC1-nEGF P及pC1-nDsRed單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)相一致。
權(quán)利要求
1.一種新的多種蛋白共表達(dá)載體的構(gòu)建的方法，該方法為在同一載體中插入多個(gè)同一的啟動(dòng)子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保證各種基因以保證各種基因在轉(zhuǎn)錄水平上一致性。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，在同一載體中插入多個(gè)同一的啟動(dòng)子及下游的po IyA序列 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多種蛋白共表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本方法利用主要為在同一載體中插入多個(gè)同一的啟動(dòng)子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保證各種基因在轉(zhuǎn)錄水平上一致性。后續(xù)的翻譯水平可以通過(guò)修飾AUG周?chē)男蛄羞M(jìn)行更精確的不同基因蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。以這樣的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，多種蛋白將能實(shí)現(xiàn)按固定比例的定量表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103184233SQ20111045517
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者朱瑞宇, 金堅(jiān), 高明珠 申請(qǐng)人:無(wú)錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司