專(zhuān)利名稱(chēng)：富含多糖多酚植物高質(zhì)量細(xì)胞核dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物功能基因組學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種富含多糖多酚植物高質(zhì)量細(xì)胞核DNA的提取方法；本方法快速、便捷，適用于高通量測(cè)序或構(gòu)建文庫(kù)。
背景技術(shù)：
隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本大幅度的降低，基因組測(cè)序和重測(cè)序已成為植物基因組學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。高質(zhì)量細(xì)胞核DNA(脫氧核糖核酸)獲取是高通量測(cè)序的基礎(chǔ)。目前，用于高通量測(cè)序或者構(gòu)建基因組文庫(kù)的細(xì)胞核DNA —般采用SDS法 (十二烷基苯磺酸鈉)、CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)或基于硅膠基質(zhì)的吸附離心柱等方法提取。對(duì)于植物的DNA提取，以上幾種方法均被廣泛使用。但由于植物特別是水生植物、木本植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物,嚴(yán)重困擾DNA的提取。采用常規(guī)DNA提取方法無(wú)法獲得純度高、質(zhì)量?jī)?yōu)的細(xì)胞核DNA。此外，植物多糖、多酚的組分與含量隨植物生長(zhǎng)周期和環(huán)境條件以及物種而異，目前尚缺乏一種適用于絕大多數(shù)植物種類(lèi)或組織材料細(xì)胞核DNA提取方法。
高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)于DNA的完整性以及核外DNA (如線粒體DNA和葉綠體DNA等) 的污染極為敏感，這是因?yàn)槎喾拥任镔|(zhì)會(huì)氧化基因組DNA雙鏈，造成基因組完整性的破壞以及序列長(zhǎng)度的降低，多糖類(lèi)物質(zhì)和DNA的理化性質(zhì)接近，容易造成核酸的共沉淀而使得率降低；核外DNA的存在造成測(cè)序有效覆蓋度的降低，不久大大增加研究成本，而且嚴(yán)重干擾結(jié)果的分析。可見(jiàn)，不管對(duì)于de novo (首次)測(cè)序或重測(cè)序，多酚氧化和核外DNA的存在都會(huì)嚴(yán)重干擾基因組序列的拼裝。為了去除如葉綠體DNA之類(lèi)的核外遺傳物質(zhì)，現(xiàn)有的幾種基因組提取方法均需要對(duì)植物材料進(jìn)行黃化處理，但黃化處理的負(fù)面作用是造成材料的生長(zhǎng)狀態(tài)變差，往往又會(huì)誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物如多酚增多，從而加重多酚氧化的程度。而且即便經(jīng)過(guò)黃化處理,也很難去掉高等植物細(xì)胞中線粒體DNA的污染。對(duì)于高大的多年生木本植物以及多數(shù)水生植物而言，很難獲得大量的黃化幼嫩葉片；因此，開(kāi)發(fā)一種能夠利用植物在自然生長(zhǎng)條件下的葉片等組織為材料，進(jìn)行高純度、高質(zhì)量細(xì)胞核DNA的提取方法，已成為當(dāng)前果樹(shù)、水生植物等經(jīng)濟(jì)作物基因組學(xué)研究的迫切需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有植物基因組核酸提取方法存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種富含多糖多酚植物高質(zhì)量細(xì)胞核DNA的提取方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
為了適應(yīng)次生代謝旺盛、植株體積較大和不便于預(yù)處理的木本或水生材料，本方法采取了全新的預(yù)處理步驟，先粗分離材料的細(xì)胞核。
一、富含多糖多酚植物高質(zhì)量細(xì)胞核DNA的提取(簡(jiǎn)稱(chēng)方法)
具體地說(shuō)，本方法包括下列步驟
①液氮研磨植物材料(避免過(guò)度研磨)；
②HB抽提緩沖液重懸，渦旋混勻后過(guò)濾；
③離心，沉淀使用抽提緩沖液I洗三次，重懸；
④使用抽提緩沖液2，RnaseH, 65攝氏度水浴30分鐘；
⑤氯仿-異戊醇抽提一次，異丙醇沉淀；
⑥冰預(yù)冷75%乙醇洗沉淀1-2次，TE溶解。
其中①到③為預(yù)處理步驟(分離植物材料的細(xì)胞核)。
工作機(jī)理
由于細(xì)胞核直徑較大，和線粒體、葉綠體等細(xì)胞器的沉降系數(shù)差異較遠(yuǎn)，比較易于離心分離；同時(shí)由于多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物主要位于液泡、線粒體、過(guò)氧化物酶體乃至細(xì)胞質(zhì)中，在分離細(xì)胞核的過(guò)程中被洗去，而其他的細(xì)胞整體裂解方法中，次生代謝產(chǎn)物無(wú)法去除，對(duì)后續(xù)的核酸提取步驟產(chǎn)生干擾。因而本方法尤其適用于多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物含量較高的植物材料，此類(lèi)雜質(zhì)的存在和含量對(duì)所抽提得到的基因組DNA的產(chǎn)量與質(zhì)量均無(wú)明顯的影響。
二、用途
適用于廣泛植物種的健康組織，或細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整的凍存組織，特別適合于后續(xù)研究為高通量測(cè)序等用途。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果
①預(yù)處理步驟能有效去除線粒體、葉綠體等細(xì)胞器DNA ；
②避免植物材料中大量存在的多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物對(duì)核酸提取步驟產(chǎn)生干擾；
③抽提緩沖液I和2中均加入山梨醇，它能調(diào)節(jié)滲透壓，在預(yù)處理過(guò)程中可防止細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的過(guò)早破裂，從而減少基因組DNA損失，提高DNA產(chǎn)量。


圖I是本方法的流程圖；圖中
I到3為預(yù)處理步驟，分離細(xì)胞核；
4為抽提步驟，從細(xì)胞核中抽取基因組DNA ；
5為DNA的純化和沉淀回收步驟；
6為DNA的最終回收步驟。
圖2是本方法所得的蘋(píng)果基因組DNA電泳圖；其中
M-分子量標(biāo)準(zhǔn)品(最大電泳條帶約15000堿基對(duì))；
A、B、C-本方法所提取的第1、2、3蘋(píng)果基因組DNA;
D-普通CTAB法所提取的蘋(píng)果基因組DNA。
縮略語(yǔ)
SDS Sodium Dodecyl Sulfate,十二燒基苯橫酸鈉；
CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,十六燒基三甲基溴化銨；
PEG6000 PolyEthlene Glycol 6000,聚乙二醇 6000 ;
EDTA EthyleneDiamine Tetraacetic Acid,乙二胺四乙酸；
Tris :Tris (Hydroxymethyl) aminomethane,三輕甲基氨基甲燒；
RNase H :RNA 酶 H。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明
一、采用本方法提取蘋(píng)果的基因組DNA的實(shí)施例
I、步驟如下
①使用液氮速凍，研缽和研棒研磨約20克蘋(píng)果葉片(或凍存葉片)，迅速轉(zhuǎn)移到500毫升冰預(yù)冷燒杯中。
②使用200毫升冰預(yù)冷的HB抽提緩沖液(使用前加￠-巰基乙醇至總體積的0. 1%，體積/體積比)浸泡，用磁力攪拌泵渦旋混勻20分鐘，抽提體系用冰降溫。
使用雙層粗紗布和漏斗過(guò)濾，濾過(guò)液收集到250毫升離心管中(也可使用50毫升離心管)。
③使用固定角轉(zhuǎn)子在冷凍離心機(jī)上以1，800g，4攝氏度離心20分鐘。
棄去上清，將細(xì)胞核沉淀用少量預(yù)冷抽提緩沖液I輕柔重懸。補(bǔ)足預(yù)冷抽提緩沖液I體積到30毫升，輕柔混勻后轉(zhuǎn)到50毫升離心管內(nèi)，重復(fù)此沉淀-重懸步驟3次(l，800g，4攝氏度離心15分鐘)。
④小心棄去上清，將沉淀用5毫升抽提緩沖液2和10微升RNase H(10mg/mL)重懸。
水浴65攝氏度保溫30分鐘。
⑤加入5毫升氯仿抽提液(氯仿異戊醇=24 1，體積/體積比)，輕柔顛倒混勻。
室溫離心，12，000g，15分鐘。
吸取上清液4. 5毫升，加入冰預(yù)冷異丙醇3毫升。
混勻，放置于-20度沉淀I小時(shí)。
4度離心。12，OOOg 15分鐘。
⑥棄去上清，加入5毫升冰預(yù)冷75%乙醇(75毫升無(wú)水乙醇加蒸餾水至總體積100毫升)洗1-2次，4度離心，12，OOOg 5分鐘。
棄去上清，室溫晾干半小時(shí)，加入500微升滅菌TE溶解。
2、所使用的緩沖液配方
I) HB抽提緩沖液
0. 5M sucrose (鹿糖)；
IOmM Tris-HCl(pH7. 0)；
80mM KCl ；
IOmM EDTA ；
ImM spermidine (亞精胺，臨用前加入)；
Imm spermine (精胺，臨用前加入)。
2)抽提緩沖液I
50mm Tris-HCl(pH8. 0)
5mm EDTA (用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 8. 0)
350mm sorbitol (山梨醇)
100g/L PEG60000
0. I %巰基乙醇(體積/體積比，臨用前加入)
3)抽提緩沖液2:
50mm Tris-HCl (pH8. 0)
5mm EDTA (用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 8. 0)
350mm sorbitol (山梨醇)
lOg/L SDS
710mm NaCl
0. I % CTAB
0. I %巰基乙醇(體積/體積比，臨用前加入)。
4) TE 緩沖液
10mm Tris-HCl (pH8. 0)
Imm EDTA (用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 8. 0)。
5) 75% 乙醇
75%為乙醇在溶液中所占的體積比，具體配制方法為75毫升無(wú)水乙醇加蒸餾水至總體積100暈升。
3、檢測(cè)結(jié)果
(以下為檢測(cè)步驟，不屬于本方法的提取步驟):
取2微升所提取的DNA在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳，比電壓降約5伏/厘米，電泳 I小時(shí)后用溴化乙啶染色，在凝膠成像系統(tǒng)中用紫外線照射成像。所得DNA分子量完整(> 15，000堿基對(duì))，對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)品，估計(jì)其濃度約50納克/微升，如圖2所示，電泳帶型清晰銳利，無(wú)明顯拖尾，可見(jiàn)較好的去除了蛋白和多糖等雜質(zhì)。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得所得DNA在260納米和280納米的吸光度比值約等于I. 9，說(shuō)明本方法所得基因組DNA具備較高純度。
二、采用本方法提取李樹(shù)、桃子以及獼猴桃的基因組DNA均獲得成功，步驟與結(jié)果類(lèi)上述，從略。
權(quán)利要求
1.一種富含多糖多酚植物高質(zhì)量細(xì)胞核DNA的提取方法，其特征在于 預(yù)先提取植物的細(xì)胞核，具體步驟如下①液氮研磨植物材料；②HB抽提緩沖液重懸，渦旋混勻后過(guò)濾；③離心，沉淀使用抽提緩沖液I洗三次，重懸；④使用抽提緩沖液2，RnaseH,65攝氏度水浴30分鐘；⑤氯仿-異戊醇抽提一次，異丙醇沉淀；⑥冰預(yù)冷75%乙醇洗沉淀1-2次，TE緩沖液溶解。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種富含多糖多酚植物高質(zhì)量細(xì)胞核DNA的提取方法，涉及植物功能基因組學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明包括下列步驟①液氮研磨植物材料；②HB抽提緩沖液重懸，渦旋混勻后過(guò)濾；③離心，沉淀使用抽提緩沖液1洗三次，重懸；④使用抽提緩沖液2，RnaseH，65攝氏度水浴30分鐘；⑤氯仿-異戊醇抽提一次，異丙醇沉淀；⑥冰預(yù)冷75%乙醇洗沉淀1-2次，TE緩沖液溶解。本發(fā)明預(yù)處理步驟能有效去除線粒體、葉綠體等細(xì)胞器DNA；避免植物材料中大量存在的多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物對(duì)核酸提取步驟產(chǎn)生干擾；適用于廣泛植物種的健康組織，或細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整的凍存組織，特別適合于后續(xù)研究為高通量測(cè)序。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102533728SQ201110456519
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者王魯, 谷超, 韓月彭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢植物園