專利名稱：一種提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物量積累及提取領(lǐng)域，具體地，涉及提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法。
背景技術(shù)：
金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類低分子質(zhì)量、高巰基含量、能結(jié)合金屬離子具有獨特性能的蛋白質(zhì)。研究證明，MT可以廣泛的存在于各種生物體中，包括各種微生物，高等動、植物和人類的各種組織、器官。在經(jīng)過合適的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液培養(yǎng)之后，采用層析的方法可以分離提取到金屬硫蛋白。金屬硫蛋白分子呈橢圓形，平均分子質(zhì)量為6500U，分兩個結(jié)構(gòu)域，每個分子含 7 12個金屬原子，具有特殊的光吸收。有研究發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白具有很強的抗氧化活性，其清除超氧陰離子自由基的能力約為谷胱甘肽的25倍。目前商品化的金屬硫蛋白大多從兔肝中誘導(dǎo)提取。由于其生產(chǎn)成本高技術(shù)難度大導(dǎo)致價格昂貴。對此，各國科學(xué)家展開了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)在一些低等植物中也存在金屬硫蛋白，而低等植物來源更廣泛，生長周期更短，可以更加有效的拓寬金屬硫蛋白的來源以及降低其生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述生產(chǎn)成本高技術(shù)難度大的問題，本發(fā)明對怎樣提高螺旋藻中金屬硫蛋白含量方面進行了大量研究，發(fā)明人通過對螺旋藻生長條件的優(yōu)化，從而得到了一種提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法。具體地，本發(fā)明的目的在于，提供一種提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法。該方法包括下述步驟1)將螺旋藻接種到培養(yǎng)基中，在沈 35°C，pH = 8. 25-9的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，使其達到對數(shù)生長期，培養(yǎng)3 10天可達到對數(shù)生長期；2)將步驟(1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到沈 351，？!1控制在9 11，鋅離子濃度達到0.01 0. 09mol/L，培養(yǎng)7 14天，獲得富含金屬硫蛋白的
螺旋藻。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的方法包括下述步驟1)將螺旋藻接種到傳統(tǒng)的Z氏培養(yǎng)基中，在32°C，pH = 9的培養(yǎng)10天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到30°C，pH控制在 11，鋅離子濃度達到0. 03mol/L，培養(yǎng)10天，獲得富含金屬硫蛋白的螺旋藻。上述方法的步驟1)中接種的濃度為10ml/L。在培養(yǎng)過程中采用的Zarrouk氏(Z氏)培養(yǎng)基的配制方法如下碳酸氫鈉16. Sg/ L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，硝酸鈉2. 4g/L，硫酸鉀1. Og/L，氯化鈉1. Og/L，七水合硫酸鎂0. 2g/ L, 二水合氯化鈣0. 04g/L,七水合硫酸亞鐵0. 2g/L，EDTA 二鈉0. 08g/L,混合均勻。
上述方法中采用質(zhì)量濃度為0. lmol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH值。上述步驟幻中的鋅離子來源于硫酸鋅、氯化鋅、葡萄糖酸鋅，優(yōu)選硫酸鋅。所述步驟1)中接種量為10ml/L本發(fā)明使用藻種為鈍頂螺旋藻，在中科院水生生物研究所淡水藻種庫和螺旋藻企業(yè)均可選購。本發(fā)明還提供了上述方法在提高螺旋藻金屬硫蛋白含量中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的提高螺旋藻金屬硫蛋白的含量的方法，金屬硫蛋白的來源從傳統(tǒng)主要來源為動物，拓寬到藻類，顯著降低了金屬硫蛋白的生產(chǎn)成本。利用螺旋藻提取金屬硫蛋白具有突出優(yōu)點，生長迅速，積累量大，加工容易，利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的螺旋藻細胞的金屬硫蛋白的含量比傳統(tǒng)養(yǎng)殖方法增加了 100%以上。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。以下實施例中采用的Z氏培養(yǎng)基的配制方法如下碳酸氫鈉16. 8g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，硝酸鈉2. 4g/L，硫酸鉀1. Og/L,氯化鈉 1. Og/L,七水合硫酸鎂0. 2g/L，二水和氯化鈣0. 04g/L,七水合硫酸亞鐵0. 2g/L，EDTA 二鈉 0. 08g/L，混合均勻。實施例中所采用的螺旋藻為鈍頂螺旋藻，獲自中科院水生生物研究所淡水藻種庫。實施例11)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在，pH = 8. 25的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到^TC，pH控制在 9，加入葡萄糖酸鋅，使鋅離子濃度達到0. 01mol/L,培養(yǎng)7天，獲得富含金屬硫蛋白的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為11.6g/100g。實施例21)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在38°C，pH = 9的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到35°C，pH控制在 11，加入氯化鋅，鋅離子濃度達到0. 09mol/L，培養(yǎng)14天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為9.0g/100g。實施例31)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在32°C，pH = 8. 8的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到30°C，pH控制在 11，加入硫酸鋅，鋅離子濃度達到0. 07mol/L，培養(yǎng)10天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋
4藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為14.4g/100g。實施例41)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在30°C，pH = 8. 6的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)8天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到30°C，pH控制在 11，加入硫酸鋅，使鋅離子濃度達到0. 04mol/L，培養(yǎng)10天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為16.2g/100g。實施例51)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在32°C，pH = 9的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到30°C，pH控制在 11，加入硫酸鋅，使鋅離子濃度達到0. 03mol/L，培養(yǎng)10天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為17.6g/100g。比較例11)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在25°C，pH = 8. 2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，在溫度仍為25°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)14天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為 8.7g/100g。。比較例21)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為10ml/L，在39°C，pH = 9. O的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天，使其達到對數(shù)生長期。2)將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，在溫度仍為36°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)15天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為 10.恥/lOOg。。比較例3傳統(tǒng)的養(yǎng)殖方法為1)將螺旋藻接種到Z氏培養(yǎng)基中，接種濃度為20ml/L，在25°C，pH = 8的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18天，獲得金屬硫蛋白含量增高的螺旋藻。螺旋藻金屬硫蛋白的含量為8. 7g/100g。由上述結(jié)果可知，本發(fā)明提供的方法能夠大大提高螺旋藻金屬硫蛋白的含量。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明具體實施方式
及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作出一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟1)將螺旋藻接種到培養(yǎng)基中，在26 38°C，pH= 8. 25 9的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，使其達到對數(shù)生長期；2)將步驟(1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到沈 35°C，pH控制在9 11，鋅離子濃度達到0.01 0. 09mol/L，培養(yǎng)7 14天，獲得富含金屬硫蛋白的螺旋藻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，其特征在于，所述步驟1)為將螺旋藻接種到培養(yǎng)基中，在32°C，pH= 9的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，使其達到對數(shù)生長期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，其特征在于，所述步驟2)為將步驟1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到30°C，pH控制在11，鋅離子濃度達到0. 03mol/L，培養(yǎng)10天，獲得富含金屬硫蛋白的螺旋藻。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，其特征在于，所述步驟2)中的培養(yǎng)基為Z氏培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，其特征在于，所述步驟2)中的鋅離子來源為硫酸鋅、氯化鋅、葡萄糖酸鋅中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，其特征在于，所述步驟 2)中的鋅離子來源為硫酸鋅。
7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法在提高螺旋藻金屬硫蛋白含量方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高螺旋藻金屬硫蛋白含量的方法，所述方法包括下述步驟1)將螺旋藻接種到培養(yǎng)基中，在26-38℃，pH＝8.25-9的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3-10天，使其達到對數(shù)生長期；2)將步驟(1)中達到對數(shù)生長期的螺旋藻繼續(xù)培養(yǎng)，溫度調(diào)節(jié)到25～35℃，pH控制在9～11，鋅離子濃度達到0.01～0.09mol/L，培養(yǎng)7-14天，獲得富含金屬硫蛋白的螺旋藻。本發(fā)明提供的方法大幅度地擴大了金屬硫蛋白的來源以及降低了金屬硫蛋白的生產(chǎn)成本，利用螺旋藻提取金屬硫蛋白具有突出優(yōu)點，生長迅速，產(chǎn)量大，加工容易，利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的螺旋藻細胞的金屬硫蛋白的含量比傳統(tǒng)養(yǎng)殖方法增加了100％以上。
文檔編號C12N1/38GK102517244SQ20111046082
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者常蓉, 李博生 申請人:北京林業(yè)大學(xué)