專利名稱：一種熱帶假絲酵母突變菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，特別涉及一種假絲酵母突變菌株及其應用。
背景技術：
L-阿拉伯糖醇是ー種稀有的戊糖醇，分子式為C5H12O5，分子量為152. 15，味甜，白色結晶性粉末，易溶于水和90%沸乙醇，不能還原斐林氏試劑。糖醇是指糖(包括四碳糖、 五碳糖、六碳糖或其聚合體)的還原性羰基經(jīng)過加氫后生成的ー類多元醇。由于加氫作用， 其失去了還原性。多數(shù)糖醇在人體中的代謝第一歩可以不經(jīng)過胰島素，所以可以用作糖尿病人、反應性低血糖及其其他胰島素分泌失常的病人的營養(yǎng)甜味劑；由于大部分糖醇不容易被造成齲齒的口腔鏈球菌所利用，所以大量用于口腔保健，預防齲齒；大部分糖醇具有良好的ロ感與甜味，且熱值很低，可以作為蔗糖替代品，以降低因蔗糖攝入過多而造成的肥胖癥、心血管病等時下較為常見的各種“三高”病癥的發(fā)生率。越來越多的稀有糖醇已經(jīng)被開發(fā)出來，更廣泛的應用于食品醫(yī)藥等行業(yè)，發(fā)揮著越來越重要的作用。L-阿拉伯糖醇作為一種稀有的五碳糖醇，具有上述的優(yōu)點且因為更難被微生物利用以及擁有類似于水溶性膳食纖維的效果，對脂肪的吸收有一定的抑制作用， 因此其功效更佳，但由于L-阿拉伯糖醇目前較昂貴的價格限制了它的廣泛使用。目前，L-阿拉伯糖醇的生產(chǎn)主要以L-阿拉伯糖為原料，在高溫高壓的條件下催化加氫得到。眾所周知，這種傳統(tǒng)的化工生產(chǎn)方法，有著許多明顯的缺點，該化學法需要高溫、 高壓、易燃易爆的高壓氫氣以及對溶液純度要求很高的鎳催化劑、繁雜的分離和凈化工藝， 以及基本建設投資及操作費用高，并且污染嚴重。這就促使我們努力探索出了以L-阿拉伯糖為底物，利用特殊的菌種進行生物發(fā)酵，最后得到產(chǎn)物為L-阿拉伯糖醇。該生物轉化法對環(huán)境較為友好，反應過程較為溫和，是ー種廉價的制備方法，將對今后L-阿拉伯糖醇的大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)以及推動更廣泛的市場應用起到重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種假絲酵母突變菌株。本發(fā)明的第二目的在干，提供該假絲酵母突變菌株的應用方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種假絲酵母突變菌株(Candida sp.) FYATl 104，保藏號為CGMCC No. 4761，于2011年4月11日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵政編碼為 100101)。進ー步地，本發(fā)明提供了該假絲酵母突變菌株FYAT1104在制備L-阿拉伯糖醇中的應用。更ー步地，本發(fā)明提供了 L-阿拉伯糖醇的發(fā)酵方法，所用發(fā)酵菌株為假絲酵母突變菌株FYATl 104，其保藏編號為CGMCCNo. 4761。上述方法具體包括試管斜面培養(yǎng)種子和培養(yǎng)瓶液體發(fā)酵。
所述試管斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括酵母粉1 5g/L，蛋白胨1 5g/L，葡萄糖10 25g/L0所述試管斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)條件優(yōu)選為溫度為28 32°C，pH值為3. 5 5. 5，培養(yǎng)是時間為14 20h。所述培養(yǎng)瓶液體發(fā)酵的培養(yǎng)基配方包括葡萄糖10 20g/L，L-阿拉伯糖50 100g/L，甘油 10 20g/L，氮源 5 40g/L。其中，所述的氮源為玉米漿、酵母粉或蛋白胨中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的氮源為玉米漿，其含量為20 40g/L。所述培養(yǎng)基的氮源為酵母粉，其含量為5 10g/L。所述培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨，其含量為10 20g/L。所述培養(yǎng)瓶液體發(fā)酵的條件優(yōu)選為種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)液的體積比為10%， pH值為4. 2 5. 0，發(fā)酵溫度為28 32°C，通氣量為0. 5 lvvm，發(fā)酵時間為2 4天。所述方法還包括發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵條件優(yōu)選為通氣量0. 5vvm，溫度培養(yǎng)30°C，pH 值為4. 2 5.0。本發(fā)明還提供了由上述方法制備的L-阿拉伯糖醇。本發(fā)明的積極效果在于本發(fā)明提供的保藏的菌株，菌株性能穩(wěn)定；利用該菌株發(fā)酵得到的L-阿拉伯糖醇轉化率高，培養(yǎng)瓶發(fā)酵轉化率可達到87. 3% ；發(fā)酵罐發(fā)酵轉化率可即達到90. 4%。


圖1為本發(fā)明葡萄糖標準品HPLC色譜圖；圖2為本發(fā)明L-阿拉伯糖醇標準品HPLC色譜圖；圖3為本發(fā)明L-阿拉伯糖標準品HPLC色譜圖；圖4為本發(fā)明甘油標準品HPLC色譜圖；圖5為本發(fā)明起始發(fā)酵醪HPLC色譜圖；圖6為本發(fā)明搖瓶發(fā)酵56h時發(fā)酵醪HPLC色譜圖；圖7為本發(fā)明5L發(fā)酵罐48h時發(fā)酵醪HPLC色譜圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1菌種分離及鑒定YPA液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量體積百分比的組分酵母粉，2%蛋白胨，2% L-阿拉伯糖；pH值為5.5 ；121°C滅菌20min。YPA固體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量體積百分比的組分酵母粉，2%蛋白胨，2% L-阿拉伯糖，1. 5%瓊脂粉；pH值為5. 5 ； 121°C滅菌20min。從安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司的木糖母液中取Iml樣品，于100ml YPA液體培養(yǎng)基中，30°C、220rpm搖瓶培養(yǎng)12h。取Iml培養(yǎng)物于1. 5ml印pendorf管中，8000rpm 常溫離心5min，用無菌雙蒸水洗滌數(shù)次后，再用無菌ddH20稀釋到10_2 10_7倍，取每個稀釋梯度0. 15ml涂布于YPA固體培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)2天后獲得單菌落。選擇菌落數(shù)在20個左右的平板，挑選較大的菌落若干株，保存于YPA固體培養(yǎng)基斜面上，并分別編號。 通過鏡檢，確定大部分菌種為酵母。菌種鑒定用18S rDNA基因序列分析技術進行分類鑒定。取10株酵母，提取DNA 用18S rDNA通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接測序，測序結果提交GenBank通過核酸序列比對，對微生物種屬進行鑒定，鑒定結果表明，其中一株為假絲酵母屬菌株。實施例2菌株馴化、誘變、篩選本實施例中所述菌株均在YPA液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，于搖床培養(yǎng)條件為30°C， 220rpm，2 天。1、菌株馴化將搖瓶種子轉接至高濃度L-阿拉伯糖的YPA培養(yǎng)基(L-阿拉伯糖濃度為15% ) 中，于搖床培養(yǎng)30°C，220rpm，2天；而后，稀釋至10_4，涂布于高濃度L-阿拉伯糖的YPA固體培養(yǎng)基(L-阿拉伯糖濃度為200g/L)上，30°C生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2天；挑取生長較大的菌落，搖瓶種子，繼續(xù)培養(yǎng)。重復此步驟，馴化10次后，挑選較大菌落，保存?zhèn)溆谩?、紫外誘變?nèi)”緦嵤├牟襟E(1)中的馴化菌株一環(huán)，接種于100ml YPA液體培養(yǎng)基中， 30°C、220rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12h。取5ml培養(yǎng)液，用生理鹽水洗滌3次(室溫下8000rpm、 離心^iin)后，用2ml生理鹽水制成懸浮液。將懸浮液置于帶有磁力攪拌器的平皿上，使細胞可以均勻地吸收紫外光線。紫外誘變條件20W紫外燈，距離25cm，照射時間^iin (此時的致死率為69. 3% )。3、制霉菌素篩選(1)離心去上清(8000rpm、％iin)后，加入YPA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，暗箱培養(yǎng)富集菌體。(2)離心去上清(8000rpm,4min)后，用生理鹽水(0. 9%的NaCl)洗3次。力口 IOml 不含任何碳源的YNB液體培養(yǎng)基，移入三角瓶中振蕩培養(yǎng)過夜。(3)在三角瓶中加入50% (W/V)的L-阿拉伯糖醇至總濃度為1%，培養(yǎng)12小時后，加入制霉菌素至終濃度為40U/mL，振蕩培養(yǎng)4h。(4)離心(8000rpm、^iin)除上清，用生理鹽水洗3次。用無菌水稀釋至適當濃度后，涂布于選擇性平板YATG (各成分質(zhì)量體積比為0.7% YNB、1 % L-阿拉伯糖醇、0. 01 % 葡萄糖、1.5%瓊脂糖)上。(5)將上述平板于30°C培養(yǎng)數(shù)日后觀察，長出后不久停止生長且較小的菌落即是目的菌落。(6)挑出(5)中目的菌落，按上述步驟重復篩選4次。最終得到一株熱帶假絲酵母突變株FYAT1104，它能代謝L-阿拉伯糖，形成L-阿拉伯糖醇。此菌株保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 4761。 另保藏菌株FYAT1104于甘油管和斜面試管中備用。實施例3HPLC檢測發(fā)酵液組份
1、發(fā)酵液樣品處理取IOml發(fā)酵液于離心管中，IOOOOrpm室溫離心5分鐘去細胞及沉淀，取上清稀釋至合適濃度，超聲波除泡，過濾膜過濾除雜質(zhì)后，做高效液相色譜測定各組份含量。2、發(fā)酵液組份測定采用高效液相色譜測量發(fā)酵液中各組份含量。色譜條件按以下條件，色譜儀Agilent 1200 HPLC高效液相色譜；色譜柱87H3型離子交換色譜柱；色譜柱溫60°C ；流動相4mmol/L H2SO4 ；流速0. 3mL/min ；檢測器示差折光檢測器；進樣量 25 μ L/ 次。3、外標測各組份含量葡萄糖標準品高效液相色譜圖見圖1 ；L-阿拉伯糖醇標準品高效液相色譜圖見圖2 ;L-阿拉伯糖標準品高效液相色譜圖見圖3 ；甘油標準品高效液相色譜圖見圖4。實施例4產(chǎn)L-阿拉伯糖醇搖瓶發(fā)酵實驗11、種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基配方酵母粉lg/L，蛋白胨2g/L，葡萄糖10g/L，pH4.0。種子培養(yǎng)接種斜面試管菌株FYAT1104，保藏編號為CGMCCNo. 4761，于種子培養(yǎng)基中，溫度為30°C培養(yǎng)時間為20h，使OD6tltlnm在6。2、發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，L-阿拉伯糖50g/L，甘油10g/L，添加一定的氮源，PH4.2。相對應發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的氮源及其組份分別為以下3種玉米漿20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L。3、發(fā)酵條件及結果發(fā)酵采用搖瓶發(fā)酵方式。種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)液的體積比為10%，裝液量 50ml/250ml，通氣量為 0. 5vvm，220rpm、30°C搖瓶發(fā)酵 3 天。對應本實施例中發(fā)酵培養(yǎng)基配方中不同氮源的配方，發(fā)酵結果見表1 (以L-阿拉伯糖轉化率計，即單位L-阿拉伯糖轉化為L-阿拉伯糖醇的百分比)，以3次結果的平均值計量。表1不同氮源L-阿拉伯糖轉化率
氮源種類玉米漿20g/L酵母粉5g/L蛋白胨10g/L轉化率82. 3484. 5784. 62實施例5產(chǎn)L-阿拉伯糖醇搖瓶發(fā)酵實驗21、種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基配方酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L，葡萄糖25g/L，pH3. 5。種子培養(yǎng)接種斜面試管菌株FYAT1104，保藏編號為CGMCCNo. 4761，于種子培養(yǎng)基中，溫度為32°C，培養(yǎng)時間為18h，使OD6tltlnm在7。2、發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，L-阿拉伯糖50g/L，甘油10g/L，添加一定的氮源，PH5.0。相對應發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的氮源及其組份分別為以下3種玉米漿40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
3、發(fā)酵條件及結果發(fā)酵采用搖瓶發(fā)酵方式。種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)液的體積比為10%，裝液量 50ml/250ml，通氣量為 0. 8vvm，220rpmJ8°C搖瓶發(fā)酵 2 天。對應本實施例中發(fā)酵培養(yǎng)基配方中不同氮源的配方，發(fā)酵結果見表2(以L-阿拉伯糖轉化率計，即單位L-阿拉伯糖轉化為L-阿拉伯糖醇的百分比)，以3次結果的平均值計量。表2不同氮源L-阿拉伯糖轉化率
權利要求
1.一種假絲酵母突變菌株(Candida sp.) FYATl 104，其保藏編號為CGMCC No. 4761。
2.權利要求1所述的假絲酵母突變菌株FYAT1104在制備L-阿拉伯糖醇中的應用。
3.—種L-阿拉伯糖醇的發(fā)酵方法，其特征在干，所用發(fā)酵菌株為假絲酵母突變菌株 FYATl 104，其保藏編號為 CGMCC No. 4761。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該方法包括試管斜面培養(yǎng)種子和培養(yǎng)瓶液體發(fā)酵。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在干，所述試管斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括酵母粉 1 5g/L，蛋白胨1 5g/L，葡萄糖10 25g/L。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在干，所述試管斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度為 28 32°C，pH值為3. 5 5. 5，培養(yǎng)時間為14 20h。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在干，所述培養(yǎng)瓶液體發(fā)酵的條件為種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)液的體積比為10%，pH值為4. 2 5. 0，發(fā)酵溫度為觀 32°C，通氣量為0. 5 lwm，發(fā)酵時間為2 4天。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在干，所述培養(yǎng)瓶液體發(fā)酵的培養(yǎng)基包括葡萄糖 10 20g/L, L-阿拉伯糖50 100g/L，甘油10 20g/L，氮源5 40g/L。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在干，所述的氮源為玉米漿、酵母粉或蛋白胨中的 ー種或幾種。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在干，所述氮源為蛋白胨，其含量為10 20g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種假絲酵母突變菌株(Candida sp.)FYAT1104，其保藏編號為CGMCC No.4761。本發(fā)明提供的保藏的菌株，菌株性能穩(wěn)定；利用該菌株發(fā)酵得到的L-阿拉伯糖醇轉化率高，培養(yǎng)瓶發(fā)酵轉化率可達到87.3％；發(fā)酵罐發(fā)酵轉化率可即達到90.4％。
文檔編號C12N1/16GK102533571SQ20111046164
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權日2011年12月30日
發(fā)明者李榮杰 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司