專利名稱：利用合成的、確定的膠原模擬表面進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用模擬膠原包被的表面的表面來增強(qiáng)細(xì)胞粘附、增殖和功能的方法。更特別地，本發(fā)明涉及利用無異種的、合成的表面的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)模型依賴于細(xì)胞在體外以與體內(nèi)相當(dāng)?shù)姆绞秸掣?、增殖和功能的能力?具體而言，在體內(nèi)應(yīng)用前，多種培養(yǎng)模型在體外利用角質(zhì)形成細(xì)胞或肝細(xì)胞來檢驗(yàn)化合物。 例如，角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物用來預(yù)測皮膚刺激而肝細(xì)胞培養(yǎng)物用來預(yù)測肝毒性。利用膠原包被的細(xì)胞培養(yǎng)表面支持細(xì)胞粘附和細(xì)胞功能存在一定的問題，因?yàn)橛脕戆坏哪z原一般來自于人或其他動(dòng)物來源，因此通常具有差的確定性。此外，利用衍生自人或其他動(dòng)物的此類膠原在人類治療應(yīng)用中可能存在極大的問題其中可能產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)，其導(dǎo)致移植細(xì)胞的排斥。盡管分離的人膠原能夠用來包被此類表面，但是相關(guān)費(fèi)用很高并且仍可能導(dǎo)致免疫原性應(yīng)答。另外，與重組膠原一樣，由于其中存在的污染物的差異性，不同批次的分離的膠原可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的差異性。另外，細(xì)胞培養(yǎng)的差異性也可能是由分離的和重組的膠原一般均采用的自我包被過程本身導(dǎo)致的。因此，需要利用無異種的、合成的、化學(xué)確定的模擬膠原的表面來增強(qiáng)細(xì)胞粘附、增殖和功能的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了利用無異種的、合成的、化學(xué)確定的表面用于細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種表面能夠提供與膠原包被的表面相當(dāng)?shù)募?xì)胞粘附和功能性。特別是，角質(zhì)形成細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附性與膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的細(xì)胞粘附性是相當(dāng)?shù)?。此外，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的增殖是相當(dāng)?shù)?。而且，肝?xì)胞中的CYP450的基礎(chǔ)活性和誘導(dǎo)與膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的是相當(dāng)?shù)?。這種方法是特別理想的，因?yàn)槠渲惺褂玫谋砻姹苊饬伺c人或其他動(dòng)物來源的膠原相關(guān)的問題人或其他動(dòng)物來源的膠原具有差的確定性并且還可能在治療應(yīng)用中引發(fā)免疫應(yīng)答。同樣，這種方法在細(xì)胞培養(yǎng)檢驗(yàn)中是尤其優(yōu)選的，因?yàn)榕囵B(yǎng)條件在化學(xué)上更加明確。一方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞培養(yǎng)的方法，所述方法包括將細(xì)胞懸液與表面接觸，并且在適合細(xì)胞培養(yǎng)的條件下孵育細(xì)胞，其中所述表面的至少一部分之上含有化合物包被， 所述化合物包含氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)，其中表示羥脯氨酸；其中細(xì)胞與該表面的粘附與懸浮細(xì)胞與膠原包被的表面的細(xì)胞粘附相當(dāng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，粘附至表面的細(xì)胞數(shù)量是其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的對(duì)照表面的至少2倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞，粘附至表面的細(xì)胞數(shù)量是其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的對(duì)照表面的至少3倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞，粘附至表面的細(xì)胞數(shù)量是沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的對(duì)照表面的至少10倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粘附至表面的肝細(xì)胞中細(xì)胞色素P45(13A4的基礎(chǔ)活性水平與粘附至膠原包被的表面上的肝細(xì)胞中的細(xì)胞色素P45(I3A4的基礎(chǔ)活性水平相當(dāng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞色素Ρ45(Ι3Α4的誘導(dǎo)與粘附至膠原包被的表面上的肝細(xì)胞的細(xì)胞色素P45tl 的誘導(dǎo)水平相當(dāng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面是細(xì)胞培養(yǎng)容器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面是微載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱中于37°C孵育。在一個(gè)實(shí)施方案中，孵育細(xì)胞至少M(fèi)小時(shí)。另一方面，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞。通過下面詳細(xì)描述的研究將更好地理解本發(fā)明的這些和其他特征。


圖IA顯示粘附至其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養(yǎng)表面的人肝細(xì)胞(擬次170)的圖像。圖 IB 顯示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的組織培養(yǎng)表面的人肝細(xì)胞(批次170)的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖IC顯示粘附至具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養(yǎng)表面的人肝細(xì)胞(批次94)的圖像。圖 ID 顯示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的組織培養(yǎng)表面的人肝細(xì)胞(批次94)的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖IE顯示粘附至其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養(yǎng)表面的人肝細(xì)胞(197批次)的圖像。圖 IF 顯示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的組織培養(yǎng)表面的人肝細(xì)胞(批次197)的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖IG顯示其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的組織培養(yǎng)表面上存在的人肝細(xì)胞的圖像。圖2顯示來源于三個(gè)不同供體的粘附至其上具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXAERGP PGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)(其中X1表示羥脯氨酸)包被的表面(用“M”表示)，或具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面(用“C”表示)的人肝細(xì)胞中的細(xì)胞色素 P4503A4(CYP3A4)誘導(dǎo)的基礎(chǔ)水平和酶活性水平(以pmol/分鐘/毫克蛋白質(zhì)表示)以及倍數(shù)誘導(dǎo)。圖3A顯示在確定的、無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中粘附至具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養(yǎng)表面的人角質(zhì)形成細(xì)胞的圖像。
圖;3B顯示在確定的、無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中粘附至具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX !GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)包被的表面的人角質(zhì)形成細(xì)胞的圖像，其中&表
示羥脯氨酸。圖3C顯示在確定的、無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中存在于沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的組織培養(yǎng)表面的人角質(zhì)形成細(xì)胞的圖像。圖 4 的圖顯示了存在于具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXiGERGPPGPPGPPGPPGPPGPC^S EQ ID NO :1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面(用“Mimetic”表示)，或具有膠原(即 BD BioCoat膠原1)包被的表面(用“BD BioCoat Coll”表示)上的人角質(zhì)形成細(xì)胞的MTS 定量檢驗(yàn)后490nm處的吸光度水平。圖5A顯示在確定的培養(yǎng)基中粘附至具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPP GPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)包被的表面的人角質(zhì)形成細(xì)包的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖5B顯示在確定的培養(yǎng)基中粘附到具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養(yǎng)表面的人角質(zhì)形成細(xì)胞的圖像。圖5C顯示在確定的培養(yǎng)基中存在于沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的組織培養(yǎng)表面的人角質(zhì)形成細(xì)胞的圖像。圖 6 的圖顯示了存在于具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC( SEQ ID NO :1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面(用“A”表示)，或具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面(用“B”表示)，或沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的組織培養(yǎng)表面(用“C”表示)上的人角質(zhì)形成細(xì)胞的MTS定量檢驗(yàn)后490nm處的吸光度水平。圖 7A 顯示其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)包被的表面上存在的人胰腺癌細(xì)胞的圖像，其中表示羥脯氨酸。圖7Β顯示其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養(yǎng)表面上存在的人胰腺癌細(xì)胞的圖像。圖7C顯示其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的組織培養(yǎng)表面上存在的人胰腺癌細(xì)胞的圖像。圖 8 的圖顯示了存在于其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPG PC (SEQ ID NO :1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面(用“Mimetic”表示)，或其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面(用“Coll”表示)，或沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的組織培養(yǎng)表面(用“TC”表示)上的人胰腺癌細(xì)胞的MTS定量檢驗(yàn)后490nm處的吸光度水平。
具體實(shí)施例方式本文使用的下列術(shù)語應(yīng)具有如下記載的定義。就比較本發(fā)明的化合物包被的細(xì)胞培養(yǎng)表面與膠原包被的細(xì)胞培養(yǎng)表面而言，本文使用的術(shù)語“模擬”和“模擬物”指被評(píng)估的一個(gè)或多個(gè)功能特征的相對(duì)相似性。理想地， 定量分析將顯示出在至少一種功能特征方面至少90%的相似性?？梢岳贸Ｒ?guī)的重組技術(shù)或合成技術(shù)(例如固相合成)生產(chǎn)用于包被表面的本發(fā)明中所使用的化合物。類似地，可以利用常規(guī)技術(shù)將此類化合物純化到適合于給定應(yīng)用的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物的純度水平為至少90%。有利地，合成此類化合物可以提供至少95%或更高的純度水平。理想地，此類化合物的純度水平為97%或更高。在某些應(yīng)用中，例如治療，尤其優(yōu)選的是，此類化合物是合成的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以置換本文描述的用于包被表面的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而不損害由此產(chǎn)生的化合物在包被細(xì)胞培養(yǎng)的表面以模擬膠原包被的表面的一種或多種功能特性時(shí)的能力。例如，可以保守置換本發(fā)明公開的用于包被表面的化合物的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。 保守置換定義為氨基酸的側(cè)鏈被具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性的側(cè)鏈代替，所述側(cè)鏈來源于遺傳編碼的氨基酸或非遺傳編碼的氨基酸。具有相似側(cè)鏈的此類氨基酸家族在本領(lǐng)域是公知的。這些氨基酸包括例如具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)，具有非帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。對(duì)于需要膠原的一種或多種功能特性的細(xì)胞培養(yǎng)，本發(fā)明的利用包含氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)的化合物進(jìn)行修飾的表面(其中&表示羥脯氨酸)是有用的。利用本文描述的化合物修飾的表面可以采用被動(dòng)(即非共價(jià)的)包被、化合物的共價(jià)固定或化合物的任何其他沉積方式。用于細(xì)胞培養(yǎng)的利用本文描述的化合物修飾的表面包括細(xì)胞培養(yǎng)容器和微載體。 本發(fā)明使用的合適的細(xì)胞培養(yǎng)容器對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的。合適的容器的例子包括但不限于，平皿、燒瓶、多孔板和顯微鏡載玻片。適用于細(xì)胞培養(yǎng)的微載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也是眾所周知的。例如見Nie，Biotechnol. Prog.，25(1) :20-31 (2009) 有利地，利用本發(fā)明的表面進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞適用于治療應(yīng)用(例如傷口愈合)，并且避免了利用來自不同來源的分離的膠原時(shí)固有的問題，否則，來自不同來源的分離的膠原可能引發(fā)免疫原性應(yīng)答，甚至導(dǎo)致移植細(xì)胞的排斥。實(shí)施例利用商業(yè)上可獲得的訂制肽合成服務(wù)合成具有氨基酸序列g(shù)pcgppgppgppgppgppg Fx1Gergppgppgppgppgppgpc(seq id no a)的化合物，其中&表示羥脯氨酸。然后將該化合物添加到適合細(xì)胞培養(yǎng)的表面上。為了研究該化合物修飾的表面的增強(qiáng)細(xì)胞粘附、增殖和功能達(dá)到與膠原包被的表面相當(dāng)?shù)乃降哪芰?，在相同的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞接種到上述兩種表面并對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測。 簡言之，按照供應(yīng)商的指導(dǎo)培養(yǎng)人肝細(xì)胞、人角質(zhì)形成細(xì)胞或人胰腺癌細(xì)胞。按照使用供應(yīng)商的指導(dǎo)，用肝細(xì)胞純化試劑盒(BD Biosciences Cat No. 454500) 純化從BD Biosciences (BD Biosciences Cat No. 454550)獲得的凍存的可誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞。簡單的說，按照供應(yīng)商的指導(dǎo)將細(xì)胞以3xl05個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到M孔板上的 BD BioCoat 膠原 1 上，或以具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXAERGPPGPPGPPGPPGPP GPC(SEQ ID NO 1)的化合物包被的表面上，其中&表示羥脯氨酸。細(xì)胞在5% CO2濃度的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。2-4小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，按照供應(yīng)商的指導(dǎo)每孔加400 μ 1 H印atostim完全培養(yǎng)基(BD Biosciences Cat No. 355056)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重新培養(yǎng)。
人(新生兒的)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞購于hvi trogen公司(Cat#C-001-5C)，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，在添加了 EDGS(含動(dòng)物成分)或者S7(無動(dòng)物成分)補(bǔ)充物的Epilife 培養(yǎng)基中，在以動(dòng)物來源的膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面或以具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)的化合物(其中 ^C1 表示羥脯氨酸)包被的表面上進(jìn)行培養(yǎng)。簡單的說，將細(xì)胞以25，000/cm2的密度接種后在5% CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細(xì)胞并捕捉圖像。鋪板后的第四至第五天用MTS檢驗(yàn)定量分析細(xì)胞粘附到表面的情況。簡言之，吸去培養(yǎng)基后在M孔板的每個(gè)孔中加入300 μ 1含有MTS (ftOmega目錄序號(hào)G3582)的完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37°C，5% CO2 的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。孵育后，將0. Iml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入BD Falco 96孔板中并測量490nm處的吸光值。從ATCC獲得的PANC-1 (人胰腺癌細(xì)胞系)細(xì)胞用添加了 10 %胎牛血清的 DMEM(Invitrogen Cat No. 11885-084)培養(yǎng)基在37°C,5% CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了進(jìn)行接種，除去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞，然后向裝有細(xì)胞的T-75燒瓶中加入 3ml 0. 25%的胰蛋白酶-EDTA。顯微鏡下檢查燒瓶，一旦細(xì)胞從表面脫離，加入IOml培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶。將細(xì)胞特移到15ml BD i^ilcon管中然后以200x g離心10分鐘。除去上清后用含有200μ g/ml BSA的DMEM(Invitrogen目錄序號(hào)#11885-084)洗滌細(xì)胞沉淀一次。然后將細(xì)胞重懸于含有200 μ g/ml BSA的DMEM中，以50，000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到每孔有0. 5ml培養(yǎng)基的對(duì)孔板中。培養(yǎng)表面為作為陽性對(duì)照的BD BioCoat膠原1，或通過具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)的肽進(jìn)行修飾的表面，其中&表示羥脯氨酸。此外，BD組織培養(yǎng)處理表面作為陰性對(duì)照。細(xì)胞在5% CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。接種后孵育M-48小時(shí)之后，使用顯微鏡觀察細(xì)胞并捕捉圖像。值得注意的是，在具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)的化合物(其中&表示羥脯氨酸)進(jìn)行包被的表面和用膠原(即BD BioCoat膠原1)進(jìn)行包被的表面上培養(yǎng)時(shí)，二者的細(xì)胞粘附、擴(kuò)散和增殖是相當(dāng)?shù)?；而在沒有包被的組織培養(yǎng)處理表面培養(yǎng)的細(xì)胞的粘附、擴(kuò)散和增殖顯著降低。這種模式在人肝細(xì)胞(見圖1A-G)、人角質(zhì)形成細(xì)胞(見圖3和5)和人胰腺癌細(xì)胞(見圖7)中是明顯的。除了上述提到的視覺分析，還在鋪板后第4天至第5天利用MTS分析法對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行量化分析。簡單的說，吸去培養(yǎng)基后在M孔板的每個(gè)孔中加入300μ 1含有 MTS(Promega目錄序號(hào)G3582)的完全培養(yǎng)基。在37°C，5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞1 小時(shí)。孵育后，將0. Iml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入BD Falco 96孔板中并測量490nm處的吸光值。
與上述視覺觀察相符的是，用 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC ( SEQ ID NO 1)(其中\(zhòng)表示羥脯氨酸)包被的表面或用膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的細(xì)胞數(shù)量是相當(dāng)?shù)模褂脹]有任何包被的組織培養(yǎng)表面上的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。這種模式在人角質(zhì)形成細(xì)胞(見圖4和6)和人胰腺癌細(xì)胞(見圖8)中是明顯的。
按照供應(yīng)商(BD Biosciences)的流程說明、包括推薦的誘導(dǎo)濃度，使用利福平作為誘導(dǎo)劑，在人肝細(xì)胞在鋪板后18到M小時(shí)進(jìn)行CYP3A4誘導(dǎo)。陰性對(duì)照中僅使用DMS0。 誘導(dǎo)期間將細(xì)胞在37°C，5% CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育M小時(shí)士6小時(shí)。該誘導(dǎo)步驟在隨后的兩天進(jìn)行重復(fù)，一共3天時(shí)間。
新鮮鋪板的肝細(xì)胞誘導(dǎo) 72小時(shí)士8小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基并用預(yù)溫的 H印ato-STIM培養(yǎng)基洗細(xì)胞，然后用睪酮作為底物進(jìn)行CYP3A4酶檢驗(yàn)。按照供應(yīng)商(BD Biosciences)的說明配制睪酮反應(yīng)混合物。吸去培養(yǎng)基后，往M孔板的每個(gè)孔中加入 400μ1睪酮反應(yīng)混合物。將細(xì)胞在37°C，5% CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，從每個(gè)孔中取出300 μ 1轉(zhuǎn)入印pendorf管中在冰上儲(chǔ)存。往每個(gè)管中加入150 μ 1 乙腈以終止反應(yīng)。樣品在室溫下14，OOOrpm離心5分鐘，然后將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)管中。然后對(duì)上清進(jìn)行HPLC分析。用6-β -睪酮繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后從中量化細(xì)胞產(chǎn)生的6-β -睪酮的量。將剩下的反應(yīng)混合物從平板中移出后，用PBS+1 % SDS裂解細(xì)胞，用BCA試劑盒 (Pierce)確定細(xì)胞裂解液中的總蛋白的量。酶活性用pmol產(chǎn)物/分鐘/毫克蛋白表示。如圖2 所示，在具有膠原(即 BD BioCoat 膠原 1)或 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXpER GPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面上，CYP3A4的基礎(chǔ)活性水平以及倍數(shù)誘導(dǎo)是相當(dāng)?shù)?。在不偏離本廣泛發(fā)明思想基礎(chǔ)上對(duì)上述實(shí)施方案進(jìn)行的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的。因此，本發(fā)明不限于公開的特定實(shí)施方案，而應(yīng)該覆蓋如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的所有改變。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)的方法，所述方法包括將細(xì)胞懸液與表面接觸并在適合細(xì)胞培養(yǎng)的條件下孵育細(xì)胞，所述表面的至少一部分之上包括化合物包被，該化合物包含氨基酸序列GPC GPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)，其中 \ 表示羥脯氨酸；其中細(xì)胞對(duì)該表面的粘附與細(xì)胞懸液對(duì)膠原包被的表面的細(xì)胞粘附相當(dāng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中粘附至所述表面的細(xì)胞數(shù)量是其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的對(duì)照表面的至少2倍。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中粘附至所述表面的細(xì)胞數(shù)量是其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的對(duì)照表面的至少3倍。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中粘附至所述表面的細(xì)胞數(shù)量是其上沒有任何細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)包被的對(duì)照表面的至少10倍。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中粘附至所述表面的肝細(xì)胞的細(xì)胞色素P45(i3A4的基礎(chǔ)活性水平與粘附至膠原包被的表面的肝細(xì)胞的細(xì)胞色素Ρ45(Ι3Α4的基礎(chǔ)活性水平相當(dāng)。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中細(xì)胞色素Ρ45(Ι3Α4的誘導(dǎo)與粘附至膠原包被的表面的肝細(xì)胞的細(xì)胞色素P45tl的誘導(dǎo)水平相當(dāng)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面是細(xì)胞培養(yǎng)容器。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面是微載體。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞在37°C，5%CO2的恒濕培養(yǎng)箱中孵育。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞至少孵育24小時(shí)。
14.利用權(quán)利要求1的方法培養(yǎng)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用模擬膠原包被的表面的表面增強(qiáng)細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞功能的方法。有利地，該方法采用了無異種的、合成的、化學(xué)確定的表面。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102586172SQ201110462549
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者D·薩克斯納, E·J·亞伯拉罕, X·K·陳 申請人:貝克頓·迪金森公司