專利名稱：一種用于登革病毒分型的芯片的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種用于登革病毒分型的芯片。
背景技術：
登革病毒(dengue virus)屬于黃病毒科黃病毒屬中的一個血清型亞群，形態(tài)結構與乙腦病毒相似，但體積較小，約17 25nm。登革病毒基因組RNA約含有11000個核苷酸， 其5'端為I型帽子結構，3'端缺乏poly(A)尾，基因組的5'端和3'端均有一段非編碼區(qū)?；蚪M只有一個開放讀碼框，其5'端1/4編碼病毒3個結構蛋白0:、PrM和E)，3'端 3/4編碼7個非結構蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b*NS5)。根據(jù)病毒包膜蛋白E 的抗原性不同，登革病毒分為1 4個血清型(I、II、III、IV)。各型病毒之間抗原性有交叉，但與黃病毒科的其它抗原群無交叉性。病毒包膜蛋白E的抗原決定簇既可以誘導宿主產(chǎn)生保護性的中和抗體和血凝抑制抗體，還可能參與登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征 (DSS)的發(fā)生。目前對于登革病毒的檢測主要有病毒分離、血清學診斷和病毒核酸檢測。目前廣泛應用的主要是RT-PCR方法，該方法具有操作簡便、快捷；敏感性高；特異性強；對起始材料質(zhì)量要求低的特點，但存在假陽性高的缺點，基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法解決了這一問題，但仍然存在通量低的缺點。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種用于登革病毒分型的芯片。本實用新型提供的用于檢測登革病毒血清型的芯片，包括固體基質(zhì)和設置在所述固體基質(zhì)上的探針包被層。其中，所述探針包被層在所述固體基質(zhì)上的分布呈方陣陣列。所述方陣陣列的列間距為10. 8mm。本實用新型的芯片可同時對多個樣品進行檢測，實現(xiàn)了樣品的高通量檢測，節(jié)省了大量勞動成本，解決了現(xiàn)有技術通量低的問題。因此，本實用新型具有重要意義。本實用新型芯片可以將登革病毒分類直接鑒定為登革病毒、I型登革病毒、II型登革病毒、III型登革病毒和IV型登革病毒，實驗證明，該芯片取得了很好的效果，真陽性率達100%，真陰性率為100%。鑒別四型登革病毒的準確率達到100%。

圖1為芯片的結構示意圖。圖中標記如下1表示固體基質(zhì)，2表示探針包被層。圖2為每個方陣上探針層的排布方式。圖3為芯片使用檢測原理。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0013]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、芯片的結構芯片的結構如圖1所示。該芯片包括固體基質(zhì)1和設置在固體基質(zhì)1上的探針包被層2。并且，探針包被層 2在固體基質(zhì)1上的分布呈方陣陣列，方陣陣列的列間距為10. 8mm。實施例2、芯片的應用以本實施例為例，說明該芯片的具體應用方法。一、芯片上探針的種類探針層包括如下檢測探針層、陽性質(zhì)控探針層(PC)、陰性質(zhì)控探針層(NC)和磁標層；所述檢測探針層為如下所示1)、用于檢測登革病毒的通用探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 5所示；2)、用于檢測I型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO=I所示，3)、用于檢測II型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 2所示，4)、用于檢測III型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 3所示，5)、用于檢測IV型登革病毒的探針，其核心雜交序列為SEQ ID NO 4所示。陽性質(zhì)控探針的核心雜交序列為SEQ ID NO 16所示陰性質(zhì)控探針的核心雜交序列為SEQ ID NO 17所示；磁標的序列為SEQ ID NO 18所示；在每個探針的核心雜交序列的5'端連接有由15個T連接而成的直鏈DNA片段， 且在和每個檢測探針的核心雜交序列的5'端連接一個伯氨基。檢測探針、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針和磁標分別通過其5'端的伯氨基與片基上的醛基形成共價鍵，從而使其固定在片基上。每個方陣上探針層的排布方式如圖2所示。圖中I為檢測登革病毒I型的探針 DEN-1P，II為檢測登革病毒II型的探針DEN-2P，III為檢測登革病毒III型的探針DEN-3P， IV為檢測登革病毒IV型的探針DEN-4P，T為通用探針。PC為雜交陽性質(zhì)控探針，NC為雜交陰性質(zhì)控探針，B為磁標。固體基質(zhì)為醛基化的玻片片基，購自博奧生物有限公司(貨號420022)。二、制備方法將合成好的步驟一中的探針分別先溶解在雙蒸水中，得到各種探針溶液，分別轉 5μ L上述探針溶液到384孔板或96孔板中，分別加入5μ L 2Χ晶芯@基因芯片點樣液(博奧生物，產(chǎn)品目錄號440010)，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片點樣。雜交陽性質(zhì)控(PC)探針和雜交陰性質(zhì)控(NC)探針和磁標按照也先分別溶解在雙蒸水中至終濃度均為40 μ M，用于基因芯片點樣。將上述檢測登革病毒的通用及分型探針，同時設置雜交陽性質(zhì)控(PC)探針、雜交陰性質(zhì)控(NC)探針和磁標(Biotin)由博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯 ^martArrayei^lS 微陣列芯片點樣系統(tǒng)按點樣步驟點樣到醛基片基上。點好樣的片基在37°C水盒過夜，去離子水清洗2遍，將芯片放入硼酸鹽溶液(1. Og NaBH4+300ml PBS+100ml無水乙醇)中孵育5分鐘，去離子水清洗2遍，空氣中干燥后，即得到檢測登革病毒通用探針及分型探針的基因芯片。每1升PH7. 4的PBS緩沖液按照如下方法制備在 IOOOml 水中加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4，用 HCl 或 NaOH 調(diào)PH為7. 4，得到pH 7. 4的PBS緩沖液。制備完成后的芯片經(jīng)晶芯 LuxScan 10K微陣列芯片掃描儀在PMT/Power = 90/900的掃描參數(shù)下掃描，在同一張芯片內(nèi)，同一根針點樣，點直徑偏差小于20%。點陣整齊，無明顯連點現(xiàn)象，即證明芯片是合格的。結果表明步驟A制備的基因芯片合格。三、應用(一)使用到的試劑如下1、擴增樣品中目的條帶的引物對組合物，如I至V所示I、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示引物對；該引物對I型登革病毒的擴增產(chǎn)物可與探針DEN-I雜交。II、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示引物對；該引物對II型登革病毒的擴增產(chǎn)物可與探針DEN-2雜交。III、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 13所示引物對；該引物對III型登革病毒的擴增產(chǎn)物可與探針DEN-3雜交。IV、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15所示引物對；該引物對IV型登革病毒的擴增產(chǎn)物可與探針DEN-4雜交。V,SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示引物對；該引物對登革病毒基因組3’非轉錄區(qū)域(UTR)的擴增產(chǎn)物可與探針DEN-T雜交。上述引物對的上游引物5’端用生物素(Biotin)標記。在正向引物的5'端都加上了 I^stI的酶識別位點(CTGCAG)，反向引物的5'端加上了 McI酶識別位點(GAGCTC)，并都在酶切位點5'端加上了保護堿基。加上酶切位點和保護堿基可以提高PCR反應擴增效率。2、鏈霉親和素包被的磁珠購自北京思爾成生物(112-06D)。3、雜交液含有3 X SSC，0.2% (質(zhì)量百分含量)SDS，25% (質(zhì)量百分含量)甲酰胺，5XDenhardt' s的溶液。SSC為含有0. 15M氯化鈉以及0. 015M檸檬酸鈉的緩沖液； Denhardt' s溶液為含有0.02% (質(zhì)量百分含量)聚蔗糖、0.02% (質(zhì)量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮以及0. 02% (質(zhì)量百分含量)BSA的混合溶液。聚蔗糖的數(shù)均分子量(或重均分子量)為4X 105。4、芯片清洗液芯片清洗液洗液I 含2XSSC，0.2% (質(zhì)量百分含量)SDS的水溶液；洗液II 0. 2 X SSC的水溶液。5、信號反應緩沖液由羊血清、TEN緩沖液和(質(zhì)量百分含量)BSA-PBS溶液按照4 10 1的體積比混合而成的溶液。每1升TEN緩沖液按照如下方法制備將10mM、 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 緩沖液、Im mol EDTA 和 2. Omol NaCl 混合，用 10mM、pH7. 5 的 Tris-HCl 緩沖液補足體積。每1升(質(zhì)量百分含量)BSA-PBS溶液按照如下方法制備將Ig BSA 溶于PH 7. 4的PBS緩沖液中，用PBS緩沖液補足體積。PBS緩沖液(pH 7.4)按照如下方法制備在 IOOOml 水中加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4，用 HCl 或 NaOH 調(diào) PH為7. 4，得到PBS緩沖液。[0056]6、雜交陽性對照樣品其核苷酸序列具體為SEQ ID NO 18所示，且該DNA片段的 5’端生物素標記。用去離子水調(diào)定濃度為lug/ul。(二)應用原理如圖3所示，具體過程是用生物素標記的引物對樣品進行擴增，如果該樣品中含有登革病毒，則其相應的引物可擴增得到生物素標記的相應型別的登革病毒基因片段，將擴增得到的產(chǎn)物與芯片雜交，然后用鏈霉親和素包被的磁珠進行標記，如果探針跟擴增產(chǎn)物可以雜交結合，則結合上的生物素標記的擴增產(chǎn)物可被鏈霉親和素包被的磁珠標記，反應結果可以直接肉眼觀察，或采用普通光學照相裝置照相成像觀察結果，也可以用晶芯 LuxScan 10K/A微陣列芯片掃描儀在Power/PMT = 90/800下進行掃描圖像。如果在相應的位置有成像反應點則可確定該樣品中是否含有該探針檢測的登革病毒并可以對其進行分型；反之，則沒有。(三)應用II型登革病毒陽性樣本感染I型登革病毒而未感染其他型別登革病毒的人的血清標本，取自深圳市疾病預防控制中心，均經(jīng)過患者的同意；鑒定方法參見KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal,2009,1, 23 :1-8)。II型登革病毒陽性樣本感染II型登革病毒而未感染其他型別病毒的人的血清標本，取自廣東省疾病預防控制中心，均經(jīng)過患者的同意；鑒定方法參見KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal, 2009,1, 23 :1-8)·具體步驟如下1、病毒RNA提取及PCR擴增目標基因1)病毒總RNA提取分別取5份I型登革病毒陽性樣本和5份II型登革病毒陽性樣本，每份分別取 IOOul，加入200ul TRIzol試劑，劇烈振蕩60秒，加入IOOul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫防治5分鐘，然后于12000g離心15分鐘，將水相轉移到新離心管內(nèi)，加入500ul異丙醇，4°C， 12000g離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌RNA沉淀，然后12000g離心2分鐘，干燥10 分鐘，將沉淀溶于DEPC水中。2)反轉錄采用Omniscript RT kit試劑盒(北京華美生科生物技術有限公司，貨號Qiagen-205111)進行反轉錄，具體方法為將隨機引物2 μ L，dNTP Mix(IOmM)(各 2. 5mM) 1 μ L，樣品總RNA(lng至5 μ g)6 μ L混勻，65°C加熱變性5分鐘，冰浴5分鐘；然后加入 10 X First-Strand Buffer 2 μ L, MgCL2 (25mM) 4 μ L，DTT (0· 1M) 2 μ L, RNaout 1 μ L,混勻，25°C加熱 anin，然后加入 superscript II 反轉錄酶(5U/uL) 1 μ L，混勻，25°C IOmin, 42°C 50min,70°C 15min，得到反轉錄的 cDNA。3)PCR擴增通用型登革病毒基因片段和四型登革病毒基因片段以上述步驟2)得到的cDNA為模板，用引物對進行PCR擴增反應。PCR 反應體系為10 X PCR Buffer 2μ L,25mM MgCL22 μ L, 2. 5mM dNTP mix 1.6 μ L，登革病毒基因片段通用擴增引物的下游引物(5μΜ)和四型登革病毒基因片段擴增引物的下游引物(5 μ M) 0.5 μ L，登革病毒基因片段通用擴增引物的上游引物(生物素標記40 μ Μ)和四型登革病毒基因片段擴增引物的上游引物(生物素標記40 μ Μ) 0. 5 μ L，登革病毒陽性樣本反轉錄得到的 CDNA 2 μ L，LA-TagE (5U/ML) 0. 2 μ L, H2O 11. 2 μ L。PCR擴增程序為先 94°C IOmin ；然后 94°C 30sec，51°C 30sec，72°C 30sec，40 個循環(huán)；最后 72 °C 5min。2、PCR產(chǎn)物芯片雜交根據(jù)堿基互補配對的原則，在適當?shù)姆磻獥l件下，帶有生物素標記的PCR產(chǎn)物與芯片上的互補探針結合形成穩(wěn)定的雙鏈，再與鏈霉親和素包被的磁珠反應，通過鏈霉親和素與生物素的親和作用，對芯片上的雜交結果進行磁珠標記后，得到檢測分析結果。具體方法如下所述1)芯片雜交將基因芯片放到雜交盒中，取7.8ul雜交液，0.2ul雜交陽性對照樣品，分別和7ul 步驟2得到通用及分型登革病毒陽性樣本PCR產(chǎn)物混合，用移液器混勻后3000rpm離心 30s，95°C熱變性:3min (在PCR儀中)。冰浴驟冷lmin。然后用移液器通過雜交盒的蓋片上的小孔注到基因芯片的點陣上，使其覆蓋芯片上的點陣。確認雜交液覆蓋芯片上的點陣后， 蓋緊雜交盒蓋，放入42°C恒溫水浴鍋中，雜交2小時，使樣品與探針充分反應。注雜交細菌PCR產(chǎn)物時，需兩體系PCR產(chǎn)物混合后雜交。每個點陣15yL。一張芯片共4個點陣，可雜交四份樣本。2)芯片清洗芯片清洗使用不同離子強度的溶液依次漂洗芯片，以除去游離的及非特異性結合的樣品。將步驟2)雜交結束后的芯片，快速從雜交盒中拿出(蓋片可以重復利用)，將芯片轉移到盛放預熱至42°C的洗液I的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗％iin，以洗去沒有與探針特異結合的樣品。在洗液I中清洗結束后，迅速用鑷子將芯片轉移到盛放預熱至42°C的洗液II的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗^iin。然后，將芯片放在50mL錐形離心管中 1500rpm離心1分鐘。3、信號反應1)將步驟2經(jīng)雜交后的芯片每個點陣點12 μ L羊血清，37 °C孵育30分鐘，然后用 lXPBS(pH 7. 4)(配方為在 1000ml 水中分別加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4,用HCl或NaOH調(diào)PH為7. 4)清洗2次，1500rpm離心1分鐘。2)信號反應鏈霉親和素標記取清洗后的鏈霉親和素包被的磁珠與鏈霉親和素雜交緩沖液以 1 3的體積比混合，然后點到步驟1)處理過的芯片上，點樣量為12ul/點陣，37°C雜交10 分鐘。然后用 IXPBS(1000ml 水中分別加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4, 用HCl或NaOH調(diào)PH為7. 4得到的溶液)清洗2次，1500rpm離心1分鐘，即得到全部反應完畢的芯片。4、結果分析芯片雜交結果可以用肉眼直接辨別，達到了直觀可視化檢測要求。結果也可以采用直接光學成像設備照相，如CCD照片、普通相機照片等顯示。結果表明，5份I型登革病毒陽性樣本的結果均為I型登革病毒陽性；5份II型登革病毒陽性樣本的檢測結果均為II 型登革病毒陽性。(四)、應用II按照步驟(三)的方法對I型登革病毒陽性樣本(感染I型登革病毒而未感染其他型登革病毒的人的血清標本)，平行四次同時檢測，比較四次檢測結果，考察芯片檢測方法是否穩(wěn)定，結果顯示，檢測結果都為I型登革病毒陽性其他型登革病毒陰性，四次結果之間并無顯著性差異，證明芯片檢測方法相當穩(wěn)定。(五)、應用III以DNA模板起始量為基準對該芯片的檢測靈敏度進行了初步研究。取I型登革病毒陽性樣品，提取病毒RNA經(jīng)反轉錄后，將cDNA依次進行梯度稀釋(100ng，50ng，25ng， IOng)，按步驟一的方法用試劑盒進行雜交檢測。cDNA量檢測結果顯示，熒光信號檢測靈敏度為模板量25ng，本發(fā)明的芯片檢測當模板量降至25ng時缺失一個位點，檢測靈敏度為模板量50ng。結果表明本發(fā)明的方法可視化芯片檢測靈敏度為cDNA模板量50ng。(六)、應用IV取臨床檢測樣本25例(人血清樣品，由廣東省疾控中心提供，均經(jīng)過患者同意)，用試劑盒檢測，操作同步驟一，同時用PCR方法進行檢測(PCR檢測方法參見KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal,2009,1, 23 :1-8)。結果如下表1所示，結果表明，本發(fā)明的檢測方法對登革病毒進行檢測的真陽性率為5/5 = 100%，真陰性率為20/20 = 100%，對登革病毒進行分型檢測的準確率達到 100%。表1.實際樣品的檢測結果
權利要求1.一種用于檢測登革病毒血清型的芯片，其特征在于它包括固體基質(zhì)和設置在所述固體基質(zhì)上的探針包被層。
2.根據(jù)權利要求1所述的芯片，其特征在于所述探針包被層在所述固體基質(zhì)上的分布呈方陣陣列。
3.根據(jù)權利要求2所述的芯片，其特征在于所述方陣陣列的列間距為10.8mm。
專利摘要本實用新型公開了一種用于登革病毒分型的芯片。該用于檢測登革病毒血清型的芯片，它包括固體基質(zhì)和設置在所述固體基質(zhì)上的探針包被層。本實用新型的芯片可同時對多個樣品進行檢測，實現(xiàn)了樣品的高通量檢測，節(jié)省了大量勞動成本，解決了現(xiàn)有技術通量低的問題。因此，本實用新型具有重要意義。
文檔編號C12M1/34GK202193789SQ2011202570
公開日2012年4月18日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權日2011年7月20日
發(fā)明者冬冰, 劉春曉, 史蕾, 徐云慶, 楊燕秋, 趙純中, 顧大勇 申請人:深圳市檢驗檢疫科學研究院