專利名稱：攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及動物細(xì)胞生物反應(yīng)器工程，具體來說涉及一種適用于動物細(xì)胞的自懸浮培養(yǎng)或者是微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
[0002]目前，用于動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的反應(yīng)器多為機械攪拌式生物反應(yīng)器，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝也基本都是攪拌式反應(yīng)器的分批式、流加式、灌注式培養(yǎng)工藝，是當(dāng)前動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及生物醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)的主流技術(shù)。攪拌式反應(yīng)器通過攪拌槳的持續(xù)攪拌均勻分布營養(yǎng)、氣體(氧氣等)及熱量，為動物細(xì)胞提供相對穩(wěn)定的生長環(huán)境。[0003]但是攪拌式生物反應(yīng)器在實際運行中依然存在一些缺點[0004]1)培養(yǎng)過程中，持續(xù)運轉(zhuǎn)的攪拌槳葉對所培養(yǎng)的動物細(xì)胞具有不可消除的剪切力損傷，一般轉(zhuǎn)速越大，剪切力損傷越大。隨著細(xì)胞密度的提高，生物體對氧氣的需求增加，應(yīng)用提高攪拌轉(zhuǎn)速從而提高傳氧速率的策略可能會直接導(dǎo)致細(xì)胞因高剪切力而大量死亡。[0005]2)空氣、氧氣及二氧化碳在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)著溶氧及pH兩個重要參數(shù)。 氣體在培養(yǎng)液中的溶解需要攪拌槳進(jìn)行有效的攪拌分散，增加氣體與液體的傳導(dǎo)面積(大氣泡破裂分散成若干小氣泡)。但是每一個氣泡在培養(yǎng)液里行進(jìn)過程中的破裂、分散對初始培養(yǎng)的動物細(xì)胞會造成不可逆的傷害。[0006]3)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中通常伴隨著換液、清洗、消化、灌注等工藝操作，目前有兩種操作方式①采用罐內(nèi)的spin-filter去除培養(yǎng)上清，但spin-filter的最小操作高度過高，換液量僅為培養(yǎng)總體積的1/3 1/2，換液不徹底，影響隨后的清洗、消化等操作。同時spin-filter的工作高度將直接制約了灌注培養(yǎng)的體積及培養(yǎng)效能。②采用外接設(shè)備，如罐外細(xì)胞截留器、聲波細(xì)胞截留器等等，將培養(yǎng)物和培養(yǎng)液一并取出并在相關(guān)設(shè)備的作用下截留培養(yǎng)物(細(xì)胞或長有細(xì)胞的微載體)，將培養(yǎng)上清去除，培養(yǎng)物重新泵回罐中， 這一過程已經(jīng)可以連續(xù)進(jìn)行。但這些設(shè)備大都屬于國外企業(yè)的高端產(chǎn)品，價格極其昂貴。并且這些設(shè)備是反應(yīng)器的外接設(shè)備，傳遞操作或多或少都存在污染風(fēng)險。[0007]由此可見，開發(fā)一種可以有效減小攪拌剪切力、氣泡破裂損傷，同時又能保證細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)、氣體、熱量均勻分布，而且具有有效分離細(xì)胞培養(yǎng)物與培養(yǎng)上清的一體化裝置勢在必行。發(fā)明內(nèi)容[0008]本發(fā)明的目的是提供一種攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，從而消除攪拌式生物反應(yīng)器中攪拌槳和深層通氣對所培養(yǎng)的動物細(xì)胞造成的剪切傷害，同時該生物反應(yīng)器還需要具備培養(yǎng)物(微載體/細(xì)胞)的過濾功能，無需外接設(shè)備，就可以方便的完成培養(yǎng)過程中的換液、清洗、消化，從而適應(yīng)于補料培養(yǎng)、循環(huán)培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)等工藝操作，安全可罪。[0009]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明公開了一種攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，包括反應(yīng)容器、反應(yīng)器頂蓋、反應(yīng)器攪拌軸，還包括有一個帶孔過濾套筒，其孔徑小于實際培養(yǎng)物，所述過濾套筒內(nèi)壁固定有帶分布器的氣體分布管以及取液管，并通過氣體分布管及取液管安裝于反應(yīng)器頂蓋，所述反應(yīng)器攪拌軸位于過濾套管中軸，所述過濾套管懸置于反應(yīng)容器中，將反應(yīng)容器區(qū)分為攪拌、通氣、過濾一體化腔室及細(xì)胞培養(yǎng)腔室。具體來說，過濾套筒通過氣體分布管和取液管安裝于攪拌式生物反應(yīng)器的頂蓋，以螺紋螺絲固定透過頂蓋的氣體分布管和取液管即可。其中氣體分布管用于向培養(yǎng)液中通入無菌氣體，取液管用于連接硅膠管移取不含有培養(yǎng)物的培養(yǎng)液。另個腔室是指位于過濾套筒內(nèi)部的攪拌、通氣、過濾一體化腔室，和位于反應(yīng)器內(nèi)壁和過濾套筒間的細(xì)胞培養(yǎng)腔室。利用該裝置將機械攪拌槳、深層通氣與細(xì)胞培養(yǎng)物分開，可有效降低培養(yǎng)過程中攪拌槳葉及氣泡對細(xì)胞培養(yǎng)物的損傷。同時不銹鋼過濾套筒具備過濾功能，其內(nèi)部的取液管在取液時僅僅移取培養(yǎng)液，而細(xì)胞培養(yǎng)物仍保留在細(xì)胞培養(yǎng)腔室中，快速有效的將培養(yǎng)液與培養(yǎng)物分開，大大簡化在生物反應(yīng)器中進(jìn)行換液、清洗、消化、流加培養(yǎng)、循環(huán)培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)等操作工藝。[0010]由于將反應(yīng)容器區(qū)分為攪拌、通氣、過濾一體化腔室及細(xì)胞培養(yǎng)腔室，所以必須保證培養(yǎng)在其中的細(xì)胞或者是載體受到過濾套筒上孔徑的限制，不能在兩個腔室內(nèi)自由移動，所以孔徑要小于實際培養(yǎng)物，對于動物細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，孔徑一般選擇為100 μ m 左右，對于動物細(xì)胞的自懸浮培養(yǎng)，孔徑一般選擇為ΙΟμπ 15μπ 。[0011]由于過濾套筒與反應(yīng)容器的直徑比，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)腔室的空間大小，所以本發(fā)明公開了反應(yīng)容器與過濾套筒直徑比為2 :Γ3 1的技術(shù)方案，從而保證細(xì)胞培養(yǎng)腔室的空間大小可以滿足細(xì)胞的培養(yǎng)增值速度。[0012]同時，本發(fā)明還進(jìn)一步公開了所述過濾套筒距離反應(yīng)容器底端;T5cm，使得細(xì)胞培養(yǎng)腔室仍然為一個連通腔體，不會被中間加入的過濾套筒分隔為兩個單獨的培養(yǎng)空間。[0013]作為進(jìn)一步的改進(jìn)，本發(fā)明公開了所述反應(yīng)器攪拌軸安裝有兩種或兩種以上攪拌槳，從而形成軸向流和徑向流，實現(xiàn)液體的上下環(huán)形流動。[0014]作為攪拌槳的一種優(yōu)選方式，本發(fā)明公開了所述反應(yīng)器攪拌軸同時安裝有渦輪推進(jìn)槳和直排六葉槳，從而更加有利于軸向流和徑向流的形成，上下環(huán)形流動性更好。[0015]同時，本發(fā)明還進(jìn)一步公開了分布器的優(yōu)選方式，所述分布器為環(huán)形分布器或微泡分布器。[0016]由于氣體分布管和取液管本身起到對過濾套筒的固定作用，所以本發(fā)明還公開了所述氣體分布管及取液管對稱固定于過濾套筒內(nèi)壁的技術(shù)方案，這樣一來就使得過濾套筒的固定更加合理，固定力更加均勻，過濾套筒的中心軸也與物理中軸對應(yīng)起來，產(chǎn)品在工作中更加穩(wěn)定。[0017]作為一種固定方式的優(yōu)選，本發(fā)明公開了所述氣體分布管及取液管點焊固定于過濾套筒內(nèi)壁，不僅固定牢靠，而且焊點小，對細(xì)胞培養(yǎng)的影響小。[0018]最后本發(fā)明公開了一種過濾套筒的優(yōu)選材質(zhì)，所述過濾套筒為不銹鋼材質(zhì)，更為優(yōu)選的是316L標(biāo)號的不銹鋼材質(zhì)。使得整個裝置更加耐老化，耐腐蝕，當(dāng)然為了進(jìn)一步提高這種性能，還可以在裝置的表面進(jìn)行硅化處理。[0019]綜上所述，采用本發(fā)明公開的技術(shù)方案后，可以將攪拌、通氣及培養(yǎng)物過濾三方面工藝操作合為一體，且位于生物反應(yīng)器內(nèi)部，統(tǒng)一整體滅菌，無外接設(shè)備，操作簡單，安全高效。


[0020]圖1攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器示意圖；[0021]其中1為氣體分布器管，2為取液管，3為反應(yīng)器頂蓋，4為反應(yīng)器攪拌軸，5為過濾套筒，6為攪拌、通氣、過濾一體化腔室，7為細(xì)胞培養(yǎng)腔室，8為反應(yīng)容器，9為直排六葉槳， 10為渦輪推進(jìn)槳。
具體實施方式
[0022]
以下結(jié)合附圖說明本發(fā)明的實施方式。但需要具體指出的是，以下具體描述僅以說明為目的，不應(yīng)將其理解成對本發(fā)明范圍的限定。根據(jù)本發(fā)明的描述，本專業(yè)的技術(shù)人員推導(dǎo)出的等效的改換方式，理應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。[0023]實施例1[0024]在BHK21自懸浮培養(yǎng)中，將本發(fā)明公開的整體裝置安裝于5L動物細(xì)胞反應(yīng)容器8 中，如圖1所示，不銹鋼過濾套筒5高度為32cm，直徑為6cm，安裝于反應(yīng)器頂蓋3下，氣體分布器管1和取液管2穿越頂蓋，用螺紋螺絲與反應(yīng)器頂蓋3固定，確保過濾套筒5的中心軸與反應(yīng)器攪拌軸4完全重合。不銹鋼過濾套筒5的過濾孔徑選用ΙΟμπι，確?？梢越亓糇蝹€懸浮生長的ΒΗΚ21細(xì)胞。整體裝置隨反應(yīng)容器8同時整體滅菌，冷卻并無菌檢測后保壓待用。[0025]培養(yǎng)開始時，ΒΗΚ21種子細(xì)胞以每毫升3. 5X IO5個細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)腔室7中，并加入培養(yǎng)液，最大培養(yǎng)體積為3. 8L。培養(yǎng)液的液面始終低于不銹鋼過濾套筒5 的頂端，即該裝置有效的將ΒΗΚ21細(xì)胞截留在細(xì)胞培養(yǎng)腔室7中，培養(yǎng)參數(shù)ρΗ設(shè)定為7. 2、 DO設(shè)定為40%、溫度設(shè)定為37°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定為35 55rpm。隨著反應(yīng)器攪拌軸4的轉(zhuǎn)動，安裝于其上的渦輪推進(jìn)槳10和直排六葉槳9 一起轉(zhuǎn)動，形成橫向流以及徑向流，從而形成了上下環(huán)形流動體系。隨著培養(yǎng)時間的推移，細(xì)胞密度逐步升高。培養(yǎng)3天后細(xì)胞密度達(dá)到每毫升1. IXlO6個細(xì)胞，檢測培養(yǎng)上清中的代謝副產(chǎn)物乳酸濃度為15. 7mmol/L，氨濃度為 4. 9mmol/L，進(jìn)行換液操作。此時用蠕動泵作用于連接在取液管2上的硅膠管，直接從攪拌、 通氣、過濾腔一體化腔室6中充分吸取培養(yǎng)上清，去除的培養(yǎng)上清體積大致為3. 0 3. 5L。 加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。隨著細(xì)胞密度的進(jìn)一步上升，可適當(dāng)提高培養(yǎng)轉(zhuǎn)速，從35rpm逐步提高至60rpm，甚至可達(dá)到75rpm，從而充分分散從氣體分布管道1中釋放的氣體(包括空氣和氧氣)，并通過過濾套筒5再擴散至細(xì)胞培養(yǎng)腔室7中，有效提高了供氧速率，有利于細(xì)胞密度的進(jìn)一步提高并維持較高的細(xì)胞活力。通過重復(fù)上述換液操作，最終BHK21的最大細(xì)胞密度可達(dá)到每毫升4. 8 X IO6個細(xì)胞，細(xì)胞存活率高于95%，培養(yǎng)周期可延長至9天。[0026]實施例2[0027]在Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)中，將本發(fā)明公開的整體裝置安裝與5L動物細(xì)胞反應(yīng)器8中，如圖1所示，裝置高度為32cm，裝置直徑為6cm，安裝于反應(yīng)器頂蓋3下，氣體分布器管1和取液管2穿越頂蓋，用螺紋螺絲與頂蓋固定，確保本裝置的中心軸與反應(yīng)器攪拌中心軸4完全重合。不銹鋼過濾套筒5的過濾孔徑選用120um，確?？梢越亓糇∥⑤d體培養(yǎng)物(微載體cytodexl及微載體上粘附生長的Marc-145細(xì)胞)。全部裝置伴隨反應(yīng)器同時整體滅菌，冷卻并無菌檢測后保壓待用。[0028] 培養(yǎng)開始時，Marc-145種子細(xì)胞以每毫升3X IO5個細(xì)胞的密度及預(yù)處理完畢的 cytodexl (使用濃度為5g/L)接種于細(xì)胞培養(yǎng)腔室7中，并加入培養(yǎng)液，初始培養(yǎng)體積為 1. 5L。初始培養(yǎng)參數(shù)pH設(shè)定為7. 2,DO設(shè)定為40%、溫度設(shè)定為37°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定為30pm，隨著反應(yīng)器攪拌軸4的轉(zhuǎn)動，安裝于其上的渦輪推進(jìn)槳10和直排六葉槳9 一起轉(zhuǎn)動，形成橫向流以及徑向流，從而形成了上下環(huán)形流動體系。初始培養(yǎng)12小時后，適當(dāng)增加培養(yǎng)液體積，但是培養(yǎng)液的液面始終低于不銹鋼過濾套筒5的頂端，即該裝置有效的將Marc-145細(xì)胞的微載體培養(yǎng)物截留在細(xì)胞培養(yǎng)腔室7中，繼續(xù)培養(yǎng)，參數(shù)pH設(shè)定為7. 2、D0設(shè)定為40%、 溫度設(shè)定為37°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定為45 65rpm。培養(yǎng)M小時后，取樣觀察微載體上Marc-145 細(xì)胞的粘附情況，占球率基本達(dá)到95%以上。隨即開始進(jìn)行循環(huán)灌注培養(yǎng)，此時用蠕動泵作用于連接在取液管2上的硅膠管直接從攪拌、通氣、過濾腔一體化腔室6中以一定的速率吸取培養(yǎng)上清，同時以相同的速率加入新鮮培養(yǎng)液。隨著細(xì)胞密度的進(jìn)一步上升，可適當(dāng)提高吸取培養(yǎng)上清及加入新鮮培養(yǎng)液的速率，即循環(huán)灌注速率，以滿足細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的需要。 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速從35rpm逐步提高至75rpm，可充分分散從氣體分布管道1中釋放的氣體(空氣和氧氣)，并通過過濾套筒5再擴散至細(xì)胞培養(yǎng)腔室7中，有效提高了供氧速率，有利于細(xì)胞密度的進(jìn)一步提高并維持較高的細(xì)胞活力。通過重復(fù)上述循環(huán)灌注操作，Marc-145細(xì)胞在培養(yǎng)5天內(nèi)即達(dá)到了最大細(xì)胞密度每毫升5. 4X IO6個細(xì)胞，細(xì)胞存活率高于95%，可用于高致病性豬藍(lán)耳病病毒的增殖。
權(quán)利要求1.攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，包括反應(yīng)容器、反應(yīng)器頂蓋、反應(yīng)器攪拌軸，其特征在于還包括有一個帶孔過濾套筒，其孔徑小于實際培養(yǎng)物，所述過濾套筒內(nèi)壁固定有帶分布器的氣體分布管以及取液管，并通過氣體分布管及取液管安裝于反應(yīng)器頂蓋，所述反應(yīng)器攪拌軸位于過濾套管中軸，所述過濾套管懸置于反應(yīng)容器中，將反應(yīng)容器區(qū)分為攪拌、通氣、過濾一體化腔室及細(xì)胞培養(yǎng)腔室。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述反應(yīng)容器與過濾套筒直徑比為2 :Γ3 :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于 所述過濾套筒距離反應(yīng)容器底端3 5cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述反應(yīng)器攪拌軸安裝有兩種或兩種以上攪拌槳。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述反應(yīng)器攪拌軸同時安裝有渦輪推進(jìn)槳和直排六葉槳。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述分布器為環(huán)形分布器或微泡分布器。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述氣體分布管及取液管對稱固定于過濾套筒內(nèi)壁。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于 所述氣體分布管及取液管點焊固定于過濾套筒內(nèi)壁。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述過濾套筒為不銹鋼材質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，其特征在于所述過濾套筒更為優(yōu)選的是316L標(biāo)號的不銹鋼材質(zhì)。
專利摘要本實用新型涉及一種適用于動物細(xì)胞的自懸浮培養(yǎng)或者是微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器。為了找到一種攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，從而消除攪拌式生物反應(yīng)器中攪拌槳和深層通氣對所培養(yǎng)的動物細(xì)胞造成的剪切傷害，同時無需外接設(shè)備，就可以方便的完成培養(yǎng)過程中的換液、清洗、消化。本實用新型公開了一種攪拌、通氣及細(xì)胞過濾一體化生物反應(yīng)器，包括反應(yīng)容器、反應(yīng)器頂蓋、反應(yīng)器攪拌軸，還包括有一個帶孔過濾套筒，所述過濾套管懸置于反應(yīng)容器中，將反應(yīng)容器區(qū)分為攪拌、通氣、過濾一體化腔室及細(xì)胞培養(yǎng)腔室。從而將攪拌、通氣及培養(yǎng)物過濾三方面工藝操作合為一體，且位于生物反應(yīng)器內(nèi)部，統(tǒng)一整體滅菌，無外接設(shè)備，操作簡單，安全高效。
文檔編號C12M1/02GK202297606SQ20112033145
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者侯繼波, 馮磊, 吳培培, 王偉峰 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院