專利名稱：O-磷酸絲氨酸巰解酶突變體以及利用其生產(chǎn)半胱氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有源自恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的對應(yīng)于SEQ ID NO: I氨基酸序列的O-磷酸絲氨酸巰解酶(又稱“0PSS”)突變體，其缺失三至七個C-末端氨基酸殘基。本發(fā)明還涉及編碼該OPSS突變體的核酸分子、含有該核酸分子的表達(dá)載體以及利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。此外，本發(fā)明涉及一種在OPSS突變體存在下，通過O-磷酰-L-絲氨酸(OPS)與硫化物發(fā)生反應(yīng)生產(chǎn)半胱氨酸的方法。
背景技術(shù)：
半胱氨酸是一種在所有生物體中的硫代謝過程中起重要作用的氨基酸。它用于蛋白，如發(fā)角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代謝產(chǎn)物的生物合成，以及作為輔酶A的前體。此外，已知半胱氨酸的生物合成與其它氨基酸，包括L-絲氨酸、L-甘氨酸和L-蛋 氨酸的生物合成密切相關(guān)。工業(yè)上，L-半胱氨酸及其衍生物被應(yīng)用于多種領(lǐng)域包括制藥業(yè)(用于治療支氣管疾病)、化妝品行業(yè)(洗發(fā)水、燙發(fā)用組合物等)，以及食品行業(yè)(抗氧化齊U、調(diào)味劑、面團(tuán)助劑(dough aids)等)。傳統(tǒng)上，L-半胱氨酸在工業(yè)上是通過酸水解人類頭發(fā)或動物羽毛而獲得(KoAida 編，氨基酸生產(chǎn)的生物技術(shù)(Biotechnology of the Amino Acids Production)，p217-223，1986)。然而，不僅由頭發(fā)或羽毛生產(chǎn)的半胱氨酸確實(shí)產(chǎn)量低至7_8%，而且使用鹽酸或硫酸產(chǎn)生了大量的環(huán)境污染物。此外，消費(fèi)者可能對從頭發(fā)或羽毛提取具有強(qiáng)烈的反感。這些問題對于開發(fā)環(huán)保的L-半胱氨酸生產(chǎn)方法形成推動，導(dǎo)致了利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸。微生物生產(chǎn)L-半胱氨酸中的代表是利用微生物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化D，L-ATC (Ryu 0H,Ju JYJPShin CS，生物化學(xué)方法(Process Biochem.), 32 =201-209,1997) 然而，由于 D，L-ATC前體的低溶解度，該轉(zhuǎn)換方法難以適用于工業(yè)。另一種L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法是用大腸桿菌直接發(fā)酵(專利號 EP 0885962B ；ffada M和 Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem.,73 :48-54, 2006)。微生物中L-半胱氨酸的過度積累產(chǎn)生胞內(nèi)毒性，導(dǎo)致高濃度L-半胱氨酸的生產(chǎn)受限。為了克服這一缺陷，使用了 L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，然而產(chǎn)量沒有出現(xiàn)顯著改善。關(guān)于L-半胱氨酸在細(xì)菌和植物中的生物合成途徑，O-乙酰絲氨酸(OAS)作為中間體前體提供L-半胱氨酸的碳骨架(Kredich NM和Tomkins GM, J. Biol. Chem. ,241 4955-4965，1966)。酶O-乙酰絲氨酸巰解酶(OASS)，用硫化氫作為硫供體，催化O-乙酰絲氨酸向硫胱氨酸的轉(zhuǎn)化，最后生成半胱氨酸，釋放乙酸。或者，SO4可被還原成硫代硫酸鹽用作半胱氨酸生產(chǎn)中的硫供體(Nakamura Τ,Κοη Y, Iwahashi H,和Eguchi Y, J. Bacteriol.,156 =656-662,1983)。經(jīng)由OAS的半胱氨酸生物合成途徑使用兩種酶，催化絲氨酸向OAS轉(zhuǎn)化的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE),催化OAS向半胱氨酸轉(zhuǎn)化的半胱氨酸合酶(CysK)。值得注意的是，其中絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE)對終產(chǎn)物半胱氨酸的反饋抑制高度敏感(Wada M和Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem. ,73 :48-54, 2006)。因此,需要對反饋抑制不敏感的改變的酶，但是其很難開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題為了克服現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問題，本發(fā)明人對高產(chǎn)L-半胱氨酸進(jìn)行了深入和徹底的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在超嗜熱古菌(Aeropyrum pernix)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)中存在著米用O-憐酸_L_絲氨酸(OPS)特異性途徑而非OAS-特異性途徑來合成L-半胱氨酸的O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)(Mino K 和 Ishikawa K, FEBS letters,551 :133-138,2003 ；Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW,和 Begley TP,J. Am. Chem. Soc. ,127 11602-11603,2005 ；ffestrop GD，Goodall G, Mottram JC，和 Coombs GH, J. Biol. Chem.,281 :25062-25075,2006)，結(jié)核分枝桿菌的OPSS與額外的酶mec+和cysO 一起催化OPS 向半胱氨酸的轉(zhuǎn)化，當(dāng)其被去除五個C-末端氨基酸殘基時(shí)，即使額外的酶不存在時(shí)也可利用Na2S作為硫供體使OPS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸(Agren D，Schnell R和Schneider G，F(xiàn)EBSletters, 583 =330-336, 2009)，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。技術(shù)方案因此，本發(fā)明的目的是提供一種具有源自恥垢分枝桿菌的對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸序列的O-磷酸絲氨酸巰解酶(又稱“0PSS”)突變，其缺失三至七個C-末端氨基酸殘基。本發(fā)明另一個目的是提供編碼該OPSS突變體的核酸分子。本發(fā)明又一個目的是提供含有該核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明還一個目的是提供用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明又一個目的是提供一種在OPSS突變體存在下，用硫化物使O-磷酰-L-絲氨酸轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的方法。有益效果如上所述，酶活性提高的OPSS突變體對于由O-磷酸絲氨酸向L-半胱氨酸的酶轉(zhuǎn)化是必不可少的，其可用于以簡單的方式大規(guī)模由OPS高產(chǎn)L-半胱氨酸。


圖I所示為根據(jù)溫度的OPSS活性。圖2所示為OPSS對pH的敏感性的組圖。圖3所示為通過SDS PAGE分析的pET系統(tǒng)和pCL_Pcjl系統(tǒng)中酶的表達(dá)水平的照片。圖4所示為將純化的OPS發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的OPSS的酶活性。圖5所示為將OPS發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的OPSS的酶活性。圖6所示為IL發(fā)酵罐中以O(shè)PS作為底物，通過OPSS轉(zhuǎn)化的OPS和半胱氨酸的生產(chǎn)。圖7為含有編碼OPSS突變體的基因的pCL-Pcjl表達(dá)載體的示意圖。
最佳實(shí)施方式按照其中一個方面，本發(fā)明提供一種源自恥垢分枝桿菌的具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的OPSS突變體，其較野生型O-磷酸絲氨酸巰解酶氨基酸序列缺少3 7個C-末
端氣基酸殘基。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的OPSS突變體可具有SEQ ID N0S:2、3和4中的一個氨基酸序列。具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的OPSS突變體可被進(jìn)一步修飾成77位脯氨酸殘基(Pro)被絲氨酸殘基(Ser)取代。此外，具有SEQ ID NO : 2氨基酸序列的OPSS突變體可被進(jìn)一步修飾成131位蘇氨酸殘基(Thr)被丙氨酸殘基(Ala)取代，137位賴氨酸殘基(Lys)被天冬酰胺殘基(Asp)取代，以及238位蘇氨酸殘基(Thr)被絲氨酸殘基(Ser)取代。此外，與上述突變體的氨基酸序列同源性至少為50 %，優(yōu)選60 %、70 %、75 %和80 %，更優(yōu)選85%、90%和95%，最優(yōu)選97%至99%的氨基酸序列落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。 術(shù)語“恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatics) ”是指放線菌門中的桿狀菌株，其為扁平的、直的或稍彎的，有不規(guī)則的分支，可被堿性染料苯胺染色。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其氨基酸序列被修飾時(shí)，來自該菌株的O-磷酸絲氨酸巰解酶能夠催化L-半胱氨酸以提高的產(chǎn)量生物合成。如本文所使用，術(shù)語“O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS) ”是指催化OPS轉(zhuǎn)換成半胱氨酸的酶。該酶首次發(fā)現(xiàn)于超嗜熱古菌(Aeropyrum pernix)中并被命名(Mino K和IshikawaK, FEBS letters,551 :133-138,2003, SEQ ID NO :6)?？墒褂酶鞣N眾所周知的方法獲得0PSS。這些方法的示例包括但不限于，基于密碼子優(yōu)化的基因合成技術(shù)，通過該技術(shù)能獲得高產(chǎn)的目的酶，以及根據(jù)微生物遺傳信息的大量儲存，利用生物信息學(xué)方法篩選有用的酶資源。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用OPS作為底物合成半胱氨酸的OPSS酶是從各種微生物中篩選到的。為此，使用合適的培養(yǎng)基及本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)條件獲得細(xì)胞沉淀(經(jīng)裂解)，然后通過對含酶上清液的純化來提供OPSS酶。如本文所使用，術(shù)語“突變體”是指顯示出遺傳或非遺傳表型的穩(wěn)定改變的培養(yǎng)物或個體。當(dāng)與OPSS (O-磷酸絲氨酸巰解酶)結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語“突變體”是指發(fā)生遺傳改變，從而與野生型相比，活性得到有效提高的OPSS酶。基于甚至在額外的酶不存在的情況下，缺失五個C-末端氨基酸殘基的源自結(jié)核分枝桿菌H37RV的OPSS突變體對含S2_基團(tuán)的硫源顯示出增加的親和力的報(bào)道，OPSS突變體可通過缺失恥垢分枝桿菌OPSS的五個C-末端氨基酸殘基來制備。本發(fā)明的OPSS突變體可具有源自恥垢分枝桿菌的對應(yīng)于SEQ ID NO: I的氨基酸序列，其缺失三至七個，優(yōu)選五個C-末端氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，觀察到具有SEQ ID NO 2氨基酸序列突變被用于轉(zhuǎn)化OPS為半胱氨酸后，顯示出一小時(shí)內(nèi)100%的轉(zhuǎn)化率(表5)。氨基酸替換可進(jìn)一步提高本發(fā)明OPSS突變體酶的活性。只要是本領(lǐng)域已知的，任何方法均可可用于改進(jìn)酶。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，采用隨機(jī)突變提高OPSS突變體酶的活性。具體地，OPSS進(jìn)行隨機(jī)突變后，本發(fā)明人利用基于HTS (高通量篩選)開發(fā)出的篩選系統(tǒng)篩選出酶活性提高的突變體。結(jié)果是，通過對Msm-T基因進(jìn)行HTS篩選獲得具有酶活性提高的OPSS突變體、Msm-T HA2和Msm-T-EP3。Msm_THA2是具有與SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的OPSS突變體，除了 77位的脯氨酸殘基(Pro)被絲氨酸殘基(Ser)取代。Msm-T-EP3是具有與SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的OPSS突變體，除了以下位置發(fā)生突變131位蘇氨酸被丙氨酸殘基(Ala)取代，137位天冬酰胺殘基(Asp)被賴氨酸殘基(Lys)取代，以及238位蘇氨酸殘基(Thr)被絲氨酸殘基(Ser)取代。優(yōu)選地，OPSS突變體Msm-T HA2和Msm-TEP3分別具有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)Msm-T HA2和Msm-T EP3比具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的Msm-T顯示出更高的酶活性(表5和6)。具體地，測出OPSS突變體Msm-THA2和Msm-T EP3相比對照Msm_T，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)早期顯示出提高5倍和I. 2倍的轉(zhuǎn)化率。此夕卜，甚至當(dāng)Msm-T HA2突變體的半胱氨酸合成活性比Msm-T酶高4倍，且其用量是Msm-T的40%時(shí)，半胱氨酸的終轉(zhuǎn)化率是相似的。如本文所使用，術(shù)語“同源性”是指兩個多肽之間的相似百分?jǐn)?shù)。一條序列另一條 序列之間的相關(guān)性可采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)確定。例如，同源性的確定可通過序列信息的比對和使用現(xiàn)成的計(jì)算機(jī)程序，直接比較兩條多肽分子之間的序列信息?；蛘?，同源性的確定可通過在使同源區(qū)之間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下進(jìn)行多核苷酸雜交，然后用特異性單鏈核酸酶消化并測定酶切片段的大小。如本文所使用，所有語法形式和拼寫變化形式的術(shù)語“同源的”，是指具有共同進(jìn)化起源”的蛋白之間關(guān)系，包括超家族蛋白(如免疫球蛋白超家族)和來自不同物種的同源蛋白(例如，肌球蛋白輕鏈等)。這些蛋白(及它們的編碼基因)具有如由它們的序列相似性反映出的序列同源性。然而，在常見的用法和本發(fā)明的應(yīng)用中，術(shù)語“同源的”在被副詞如“高度地”修改時(shí)，可以指序列的相似性，其可能會或可能不會涉及到共同的進(jìn)化起源。如本文所使用，所有語法形式的術(shù)語“序列相似性”，是指可能會或可能不會擁有共同的進(jìn)化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列之間的相似度或相關(guān)性。在一個具體實(shí)施方案中，當(dāng)至少21% (優(yōu)選至少約50%，更優(yōu)選約75%、90%、95%、96%、97%或99%)的氨基酸序列與氨基酸序列的確定長度匹配時(shí)，兩個氨基酸序列是“大體同源”或“大體相似”的。大體同源的序列可利用標(biāo)準(zhǔn)軟件通過在序列數(shù)據(jù)庫中比較序列，或在例如為該特定系統(tǒng)定義的嚴(yán)格條件下進(jìn)行Southern雜交實(shí)驗(yàn)來確定。定義的雜交條件在本領(lǐng)域范圍內(nèi)(如Sambrook 等人，1989,見下)。本發(fā)明的OPSS突變體可催化巰基(SH基團(tuán))轉(zhuǎn)移至OPS上以生產(chǎn)半胱氨酸。優(yōu)選地，所述條件允許本發(fā)明的OPSS突變體發(fā)揮它們的最佳活性，包括i)存在0-2mMPLP(5’ -磷酸吡哆醛)或O-IOOmMDTT(二硫蘇糖醇)作為輔因子，ii) 25 60°C的反應(yīng)溫度，以及iii)pH6. O 10. 0，但不僅限于此。通過將巰基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到OPS底物上從而催化半胱氨酸合成的酶活性的測定與Ape-OPSS(O-磷酸絲氨酸巰解酶)的命名一起被公開。特別是，由于Ape-OPSS具有通過轉(zhuǎn)移巰基基團(tuán)使OAS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的活性，該檢測是基于對大腸桿菌半胱氨酸合成酶的測定(0ASS, O-乙酰絲氨酸巰解酶，EC 4. 2. 99. 8)) (Mino K 和 Ishikawa K, FEBS letters, 551 133-138,2003)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案的試驗(yàn)中，PLP為OAS (O-乙酰絲氨酸)或OPS提供巰基基團(tuán)，其在半胱氨酸轉(zhuǎn)化中作為OASS或OPSS的輔因子，添加濃度為O. 2mM。此外，由于其還原能力，加入DTT不僅可以防止暴露于空氣的半胱氨酸的半胱氨酸氧化，而且還可以定量已經(jīng)氧化的半胱氨酸的量。優(yōu)選地，當(dāng)加入25mM DTT或O. 2mM PLP時(shí)，半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率增加2. 3倍。也就是說，PLP和DTT對OPS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸具有正面的影響。如之前報(bào)道的，酶Ape-OPSS、Mtb-OPSS和Mtb-Τ的最佳反應(yīng)溫度是60°C或37°C，最適pH為 7. 4(Mino K和 Ishikawa K,FEBS letters, 551 :133-138,2003 ；Agren D,SchnellR和Schneider G，F(xiàn)EBS letters, 583 :330-336,2009) 基于該報(bào)道，具有提高的酶活性的OPSS突變體的轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件可以得到優(yōu)化。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，OPSS突變體可在37°C 80°C下催化轉(zhuǎn)化。具體地，可在高溫下生長的來自古細(xì)菌(Archea spp.)的Ape-OPSS酶,在60°C下比在37°C下顯示出更高的酶活性。此外，酶本身的高熱穩(wěn)定性使得最佳溫度為60°C。另一方面，Msm-T在37°C 下顯示出最佳酶活性，且不能耐受60°C下的熱處理。據(jù)發(fā)現(xiàn)OPSS酶在pH值6. O 10. O下保持轉(zhuǎn)化活性。檢測到Ape-OPSS在pH7. 4顯示出最佳酶活性，Msm-T在pH8. O 9. O顯示出最佳酶活性。因此，Msm-T比Ape-OPSS具有更廣泛的pH穩(wěn)定范圍。根據(jù)其另一個方面，本發(fā)明提供一種編碼OPSS突變體的核酸分子。如本文所使用，術(shù)語“核酸分子”旨在包含DNA和RNA分子。構(gòu)成核酸分子結(jié)構(gòu)單元的核苷酸，不僅包括天然存在的核苷酸，而且包括糖部分或堿性部分修飾的類似物(Scheit,核苷酸類似物(Nucleotide Analogs), John Wiley,紐約(New York) (1980)；Uhlman 和 Peyman,化學(xué)綜述(Chemical Reviews), 90 :543-584 (1990))。根據(jù)其又一個方面，本發(fā)明提供含有所述核酸分子的表達(dá)載體?！拜d體”是指任何用于克隆核酸和/或?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的載體。載體可以是連有另一個DNA片段的復(fù)制子，從而使所連接的片段得到復(fù)制?！皬?fù)制子”是指任何能夠在體內(nèi)具有DNA復(fù)制自主單元功能，即能夠在自身控制下進(jìn)行復(fù)制的遺傳元件(如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)。術(shù)語“載體”包括用于將核酸在體外、胞外或體內(nèi)引入宿主細(xì)胞中的病毒和非病毒性的載體。術(shù)語“載體”，也可包括微環(huán)DNA。例如，載體可以是不含細(xì)菌DNA序列的質(zhì)粒。已證明富含CpG區(qū)的細(xì)菌DNA序列的去除可降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默，并形成質(zhì)粒 DNA 載體的持續(xù)表達(dá)(見例如，Ehrhardt, A.等，(2003)Hum Gene Ther 10 :215-25 ；Yet, N. S. (2002)MoI Ther 5 :731-38 ；Chen, Z. Y.等，(2004)Gene Ther 11:856-64)。術(shù)語“載體”也可包括轉(zhuǎn)座子如睡美人(Sleeping Beauty) (Izsvak等,J. MoI. Biol. 302 93-102 (2000))，或人工染色體。作為載體，使用T7啟動子的pET系統(tǒng)(Novagen公司)是本領(lǐng)域眾所周知的。在本發(fā)明中，可毫無限制的使用本領(lǐng)域已知的各種表達(dá)系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，由本發(fā)明人開發(fā)的使用CJl啟動子的表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)外源基因(見韓國專利
發(fā)明者嚴(yán)惠媛, 宋秉哲, 張真淑, 李京珉, 申秀安, 趙宰賢 申請人:Cj第一制糖株式會社