專(zhuān)利名稱(chēng)：活菌數(shù)的測(cè)定方法及培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用培養(yǎng)法從含有雙歧桿菌的待測(cè)菌中，僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定的方法，以及作為前述測(cè)定方法用的選擇性培養(yǎng)基而有用的培養(yǎng)基。本申請(qǐng)基于2010年3月沈日在日本申請(qǐng)的日本特愿2010-72368號(hào)要求優(yōu)先權(quán)， 將其內(nèi)容援引于此。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌作為有用的腸內(nèi)細(xì)菌的一種而眾所周知，有很多關(guān)于其生理學(xué)意義的報(bào)告。例如，在腸內(nèi)產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸并抑制有害菌增殖的作用，維生素的產(chǎn)生、免疫力的激活等已被弄清楚。因而，以往提出了各種雙歧桿菌活菌制劑(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，以通過(guò)攝取雙歧桿菌來(lái)維持健康為目的，開(kāi)發(fā)了含有雙歧桿菌的各種食品，例如酸奶等發(fā)酵乳、點(diǎn)心、飲料、 健康食品等。另外，在嬰幼兒期，攝取母乳的嬰幼兒雙歧桿菌占優(yōu)勢(shì)，因而在日本以外，也正在開(kāi)發(fā)含有雙歧桿菌 乳酸菌的嬰幼兒奶粉等。目前，在世界市場(chǎng)中作為主要添加于食品的雙歧桿菌種可列舉出長(zhǎng)雙岐桿菌種，也存在并用有短雙岐桿菌種的制品(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。認(rèn)為對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，從大量標(biāo)示制品的信息的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，將添加于制品中的有益菌的活菌數(shù)個(gè)別地表示是有益的。另外，關(guān)于活菌數(shù)的標(biāo)示，印度尼西亞已確立了如下法律針對(duì)添加于制品中的有益菌，表示每一菌種的活菌數(shù)。目前，作為從包含雙歧桿菌和乳酸菌兩者的制品中測(cè)定任一種菌的活菌數(shù)的方法，已經(jīng)確立了使用僅生長(zhǎng)雙歧桿菌的培養(yǎng)基的方法、利用需氧培養(yǎng)僅對(duì)乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法。另外，作為測(cè)定含有多種雙歧桿菌或乳酸菌的制品中的雙歧桿菌的菌種及其活菌數(shù)的方法，有根據(jù)將其涂抹于在BL瓊脂培養(yǎng)基中添加有無(wú)菌脫纖維血液的培養(yǎng)基上，利用厭氧培養(yǎng)使其在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而形成的菌落的形態(tài)(顏色、形狀等)或利用革蘭氏染色法得到的菌的形態(tài)等進(jìn)行判定的方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 光岡知足編著，"Research on bifidobacteria”，Japan Bifidus Foundation, 1994 年，第 266-267 頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :光岡知足編著，“Research on bifidobacteria”，Japan Bifidus Foundation, 1994 年，第 282-283 頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 "Method for the enumeration of bifidobacteria in fermented milk and fermented milk drinks，，，the Bifidobacterium Testing Methods Review Committee of the Japanese Association of Fermented Milks and Fermented Milk Drinks, 2000 年 3 月，第 1-13 頁(yè)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題但是，對(duì)于如上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)3所記載的方法，當(dāng)菌落的形態(tài)、菌的形狀近似時(shí)， 對(duì)菌種的辨別需要專(zhuān)業(yè)的知識(shí)。因此，各個(gè)菌種的活菌數(shù)的測(cè)定有時(shí)非常困難。另外，在日本國(guó)外，很多國(guó)家無(wú)法獲得無(wú)菌脫纖維血液。對(duì)于這樣的國(guó)家而言，無(wú)法制作帶有血液的BL 瓊脂培養(yǎng)基，從而無(wú)法進(jìn)行前述方法。目前，由于如上述那樣存在配合有長(zhǎng)雙岐桿菌種和短雙岐桿菌種的制品，長(zhǎng)雙岐桿菌種與動(dòng)物雙歧桿菌種(包括乳雙歧桿菌種)對(duì)部分糖的同化性近似等，因而尋求能夠利用培養(yǎng)法從長(zhǎng)雙岐桿菌種與其它雙歧桿菌種(短雙岐桿菌種、動(dòng)物雙歧桿菌種等)混合存在的制品中，僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定的技術(shù)。本發(fā)明是為了解決上述課題而進(jìn)行的，其目的在于提供一種通過(guò)使用特定的培養(yǎng)法，從含有雙歧桿菌的待測(cè)菌中僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行容易地測(cè)定的測(cè)定方法， 以及作為前述測(cè)定方法用的選擇性培養(yǎng)基而有用的、且調(diào)制也容易的培養(yǎng)基。用于解決問(wèn)題的方案本發(fā)明人等為了解決上述課題，對(duì)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(BERGEY’ S MANUAL OF Systematic Bacteriology)，1986 年，第 2 卷，第 1428 頁(yè)，表 15. 51 及表 15. 54 所記載的糖類(lèi)進(jìn)行了詳細(xì)地研究。本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在利用培養(yǎng)法進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定時(shí)，在長(zhǎng)雙岐桿菌種、動(dòng)物雙歧桿菌種、短雙岐桿菌種、嬰兒雙歧桿菌種中，長(zhǎng)雙岐桿菌種、動(dòng)物雙歧桿菌種這2種相對(duì)于L-阿拉伯糖具有糖的同化性。進(jìn)而，本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用含有特定濃度的L-阿拉伯糖作為唯一的糖原，且含有特定濃度的特定成分作為糖以外的培養(yǎng)基成分(蛋白質(zhì)、肽等)的培養(yǎng)基時(shí)，在長(zhǎng)雙岐桿菌種及動(dòng)物雙歧桿菌種中，僅長(zhǎng)雙岐桿菌種形成大的菌落，從而完成了本發(fā)明。解決上述課題的本發(fā)明的測(cè)定方法及培養(yǎng)基具有以下方式。[1] 一種活菌數(shù)的測(cè)定方法，其特征在于，其為使用培養(yǎng)基從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測(cè)菌中僅對(duì)屬于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum)的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定的方法，前述培養(yǎng)基滿(mǎn)足以下的1) 幻，且前述活菌數(shù)的測(cè)定是對(duì)形成于前述培養(yǎng)基的、直徑0. 7mm以上的菌落進(jìn)行計(jì)測(cè)1)作為糖源僅含有L-阿拉伯糖，2)作為氮源含有胨、肉膏及酵母膏，3)培養(yǎng)基中不含硫酸鎂及硫酸錳的任一者。[2]根據(jù)[1]所述的方法，其中，前述培養(yǎng)基中的前述L-阿拉伯糖的濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為2 3質(zhì)量％。[3]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，其中，在IOOOmL培養(yǎng)基中，前述培養(yǎng)基中的前述胨的含量為6. 0 14. 0g/1000mL、前述肉膏的含量為6. 0 14. 0g/1000mL及前述酵母膏的含量為 1. 8 4. 2g/1000mL。[4]根據(jù)[1] [3]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，屬于前述長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的微生物為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種· BB 536株。[5]根據(jù)[1] [4]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，前述待測(cè)菌作為屬于前述雙歧桿菌屬的微生物，含有
屬于前述長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的微生物，以及選自由屬于短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)的微生物、屬于動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)的微生物和屬于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp. infantis)的微生物組成的組中的至少1種微生物。[6]根據(jù)[5]所述的方法，其中，屬于前述短雙岐桿菌的微生物為短雙岐桿菌· M-16V 株。[7] 一種培養(yǎng)基，其在[1] W]中任一項(xiàng)所述的方法中使用，用于從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測(cè)菌中，僅對(duì)屬于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。[8]根據(jù)[7]所述的培養(yǎng)基，其作為糖源僅含有L-阿拉伯糖，前述L-阿拉伯糖的濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為2 3質(zhì)量％，在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有酵母膏1. 8 4. 2g/1000mL、肉膏 6. 0 14. 0g/1000mL 及胨 6. 0 14. 0g/1000mL 而成。在本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求書(shū)中，濃度(％ )為w/v(質(zhì)量/體積)的值。雙歧桿菌表示屬于雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的微生物。另外，本說(shuō)明書(shū)中，長(zhǎng)雙岐桿菌種表示屬于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum)的微生物，短雙岐桿菌種表示屬于短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)的微生物，動(dòng)物雙歧桿菌種表示屬于動(dòng)物雙岐桿菌(Bifidobacterium animalis)的微生物，乳雙岐桿菌種表示屬于動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)的微生物，嬰兒雙歧桿菌種表示屬于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種 (Bifidobacterium longum subsp. infantis)白勺微生物。“菌末”表示將菌粉末化的產(chǎn)物。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種通過(guò)使用特定培養(yǎng)法，從含有雙歧桿菌的待測(cè)菌中僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行容易地測(cè)定的測(cè)定方法，以及作為前述測(cè)定方法用的選擇性培養(yǎng)基而有用的、且調(diào)制也容易的培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的測(cè)定方法中，使用僅含有L-阿拉伯糖作為糖源的培養(yǎng)基，從含有雙歧桿菌的待測(cè)菌中僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。關(guān)于培養(yǎng)基，詳見(jiàn)后述。作為長(zhǎng)雙岐桿菌種的菌株并無(wú)特別限定，可以是截止至今作為屬于長(zhǎng)雙岐桿菌種的菌株而保藏于公共微生物保藏機(jī)構(gòu)(ATCC、NTCC、JCM、DSMZ、BCCM、LMG等)的公共機(jī)構(gòu)保藏株，也可以是通過(guò)公知的方法從自然界分離的分離株。作為公共機(jī)構(gòu)保藏株，例如可列舉出ATCC15707T株、BB536株(以保藏號(hào)ATCC BAA-999進(jìn)行保藏。作為BB536菌末由森永乳業(yè)株式會(huì)社市售)等。上標(biāo)文字T表示標(biāo)準(zhǔn)株。待測(cè)菌所含有的雙歧桿菌可以?xún)H是長(zhǎng)雙岐桿菌種，但在本發(fā)明的有用性的觀(guān)點(diǎn)上，優(yōu)選除了長(zhǎng)雙岐桿菌種之外，還含有長(zhǎng)雙岐桿菌種以外的至少1種其它雙歧桿菌。作為前述長(zhǎng)雙岐桿菌種以外的其它雙歧桿菌，并無(wú)特別限定，例如，可列舉出通常作為益生菌而廣泛使用的雙歧桿菌。其中，由于形成于前述培養(yǎng)基的菌落的尺寸小、易于與長(zhǎng)雙岐桿菌種的菌落區(qū)分，因而優(yōu)選含有選自短雙岐桿菌種、乳雙岐桿菌種、嬰兒雙歧桿菌種中的至少1種。其中，優(yōu)選含有選自短雙岐桿菌種·ΑΤ(Χ 1570(^株、短雙岐桿菌種·Μ-16ν 株(以保藏號(hào)BCCM/LMG237^進(jìn)行保藏)、乳雙岐桿菌種· DSM 10140τ株、嬰兒雙歧桿菌種· ATCC 15697τ株中的至少1種，特別優(yōu)選含有短雙岐桿菌種· M-16V株。作為含有通過(guò)本發(fā)明測(cè)定活菌數(shù)的待測(cè)菌的試樣，只要含有前述待測(cè)菌則無(wú)特別限定。具體而言，可列舉出發(fā)酵乳、點(diǎn)心、飲料、健康食品、嬰幼兒奶粉等食品，藥品、家畜用飼料等制品，對(duì)前述制品實(shí)施粉碎、利用稀釋液的稀釋等處理而得到的物質(zhì)等。前述試樣的培養(yǎng)除了使用本發(fā)明的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基之外，可以利用以往在利用培養(yǎng)法的微生物活菌數(shù)的測(cè)定中使用的公知的培養(yǎng)法。作為前述培養(yǎng)法，可列舉出固體培養(yǎng)法(使用瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)法)。作為固體培養(yǎng)法，具體而言，可列舉出傾注培養(yǎng)法(pour plate method)、涂布培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法(spiral plate method)等。傾注培養(yǎng)法是將試驗(yàn)試樣(試樣或?qū)⒃嚇佑孟♂屢合♂尩南♂屛?與加溫溶解的瓊脂培養(yǎng)基混合，進(jìn)行冷卻固化實(shí)施培養(yǎng)的方法。涂布培養(yǎng)法是將試驗(yàn)試樣涂布在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法是使用機(jī)器等將試驗(yàn)試樣帶有濃度梯度地接種在培養(yǎng)基上的方法。本發(fā)明的測(cè)定方法具體而言，可如下實(shí)施使用以1.5%左右濃度含有瓊脂的本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)試樣(試樣或?qū)⒃嚇佑孟♂屢合♂尩南♂屛?，在所形成的菌落中， 對(duì)一定以上尺寸(例如直徑0.7mm以上)的菌落的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。此時(shí)所計(jì)數(shù)的菌落數(shù)相當(dāng)于用前述瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的試驗(yàn)試樣中所包含的長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)。因此，可以由該值和稀釋倍率求出試樣中所包含的長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)(/g)。作為稀釋液，并無(wú)特別限定，可利用生理鹽水、上述非專(zhuān)利文獻(xiàn)3所記載的稀釋液 (A)(食品衛(wèi)生檢查指南所記載的厭氧性試樣稀釋液)等公知的稀釋液。本發(fā)明的培養(yǎng)條件可利用作為長(zhǎng)雙岐桿菌種的培養(yǎng)條件而公知的培養(yǎng)條件。菌落數(shù)的計(jì)數(shù)通常在厭氧條件下于37°C培養(yǎng)48小時(shí)左右后，通過(guò)目視進(jìn)行。前述本發(fā)明的測(cè)定方法所使用的培養(yǎng)基作為糖源僅含有L-阿拉伯糖。前述培養(yǎng)基中，L-阿拉伯糖的濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量?jī)?yōu)選為2 3質(zhì)量％。 更優(yōu)選為2 2.5質(zhì)量％。予以說(shuō)明，作為本發(fā)明的培養(yǎng)基不包含的、前述L-阿拉伯糖以外的糖源，例如可列舉出葡萄糖、淀粉、蔗糖、棉籽糖、半乳糖、山梨糖醇、甘露醇等。前述培養(yǎng)基還可含有L-阿拉伯糖以外的成分。以下，將構(gòu)成前述培養(yǎng)基的、除了作為糖源而唯一包含的L-阿拉伯糖以外的成分記載為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分，可例示出酵母膏、肉膏、胨等氮源；氯化鈉、醋酸鈉、丙酸鈉等鈉鹽，L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等鹽類(lèi)。這些之中，前述本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的培養(yǎng)基作為氮源含有酵母膏、肉膏及胨。作為酵母膏、肉膏、胨，可分別利用通常用于微生物培養(yǎng)所用的物質(zhì)。酵母膏是以酵母作為原料，利用自消化酶等適度分解的營(yíng)養(yǎng)源，具體而言，可例示出Yeast Extract (Becton，Dickinson and Company制)等。肉膏是由肉的浸出液獲得的營(yíng)養(yǎng)源，通過(guò)賦予胨所不具備的礦物質(zhì)、磷酸、能量源等必須要素，補(bǔ)充胨的營(yíng)養(yǎng)素特性的營(yíng)養(yǎng)源。具體而言，可例示出'LAB-MEMC0' powder(0X0ID Ltd.制)等。胨是利用蛋白質(zhì)分解酶或酸將牛奶酪朊、動(dòng)物肉、大豆蛋白質(zhì)等部分水解的產(chǎn)物。具體而言，可例示出Bacto peptone (Becton, Dickinson and Company ffj[J)等。在IOOOmL培養(yǎng)基中，酵母膏的含量?jī)?yōu)選為1. 8 4. 2g/1000mL。更優(yōu)選為2. 7 4.2g/1000mL。肉膏的含量?jī)?yōu)選為6. 0 14. 0g/1000mL。更優(yōu)選為9. 0 14. 0g/1000mL。胨的含量?jī)?yōu)選為6. 0 14. 0g/1000mLo更優(yōu)選為9. 0 14. 0g/1000mL。上述酵母膏、肉膏、胨各自的含量(g/1000mL)表示IOOOmL培養(yǎng)基中所包含的固體成分量(g)。從滲透壓的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基優(yōu)選含有前述鹽類(lèi)。作為前述鹽類(lèi)優(yōu)選鈉鹽，特別優(yōu)選氯化鈉及醋酸鈉。培養(yǎng)基中，前述鹽類(lèi)的含量在IOOOmL培養(yǎng)基中優(yōu)選為5 15g/1000mL。但本發(fā)明的測(cè)定方法所使用的培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中不含硫酸鎂及硫酸錳的任一者。 艮口，不含硫酸鎂及硫酸錳的任一者在用于使長(zhǎng)雙岐桿菌種的菌落生長(zhǎng)為能夠辨別的尺寸 (例如直徑0. 7mm以上)的菌落方面是優(yōu)選的。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以根據(jù)需要在不損害本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)含有上述以外的其它成分。作為前述的其它成分，并無(wú)特別限定，可以含有通常添加于培養(yǎng)基的成分。例如， 在活菌數(shù)測(cè)定時(shí)作為培養(yǎng)法使用固體培養(yǎng)法時(shí)，配合瓊脂。瓊脂通常按照其最終所得的培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到1. 5%左右的方式進(jìn)行配合。予以說(shuō)明，可以在不影響長(zhǎng)雙岐桿菌種的菌落生長(zhǎng)和活菌數(shù)的范圍內(nèi)添加任意的抗生素。如上所述，通過(guò)使用含有長(zhǎng)雙岐桿菌種具有同化性的L-阿拉伯糖作為唯一糖源的培養(yǎng)基，可以從包含長(zhǎng)雙岐桿菌種在內(nèi)的多種雙歧桿菌混合存在的制品中，僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種進(jìn)行識(shí)別，并測(cè)定其活菌數(shù)。即，所述培養(yǎng)基中，僅長(zhǎng)雙岐桿菌種形成大的菌落。例如，即使是同樣具有L-阿拉伯糖的同化性的動(dòng)物雙歧桿菌種(乳雙岐桿菌種)， 在本發(fā)明的培養(yǎng)基中所形成的菌落的尺寸也比長(zhǎng)雙岐桿菌種所形成的菌落的尺寸小。當(dāng)為沒(méi)有L-阿拉伯糖的同化性的雙歧桿菌種(例如短雙岐桿菌種、嬰兒雙歧桿菌種等)時(shí)，前述菌落的尺寸變得更小。作為菌落尺寸產(chǎn)生差異的理由，認(rèn)為是上述培養(yǎng)基組成使長(zhǎng)雙岐桿菌種以外的雙歧桿菌種的菌落形成能力(colony forming capacity)降低。因此，當(dāng)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)包含長(zhǎng)雙岐桿菌種在內(nèi)的多種雙歧桿菌混合存在的制品進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，即使不辨別菌落或菌的形態(tài)，通過(guò)計(jì)測(cè)生長(zhǎng)得大的菌落數(shù)，可以?xún)H對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種進(jìn)行識(shí)別，并測(cè)定其活菌數(shù)，較簡(jiǎn)便。另外，其測(cè)定值與在前述BL瓊脂培養(yǎng)基中添加了無(wú)菌脫纖維血液的培養(yǎng)基那樣的現(xiàn)存的培養(yǎng)基的測(cè)定值同等程度地正確。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基作為用于利用培養(yǎng)法對(duì)包含長(zhǎng)雙岐桿菌種在內(nèi)的多種雙歧桿菌混合存在的制品中的長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定的選擇性培養(yǎng)基是有用的。而且，本發(fā)明的培養(yǎng)基不需要如無(wú)菌脫纖維血液那樣的難以獲得的材料，因而調(diào)制也容易。在獲得上述效果的方面來(lái)看，重要的是作為氮源將胨、肉膏、酵母膏的各成分以規(guī)定濃度進(jìn)行組合。
予以說(shuō)明，為了使菌落良好地生長(zhǎng)，優(yōu)選在本發(fā)明的培養(yǎng)基中不含硫酸鎂及硫酸猛。對(duì)培養(yǎng)基的制造方法并無(wú)特別限定，可以利用公知的方法進(jìn)行制造。若舉出具體例子，首先將瓊脂、氯化鈉、醋酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽等任意成分與水一起添加至酵母膏、肉膏及胨中，進(jìn)行溶解，調(diào)制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。此時(shí)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的各成分濃度設(shè)為從最終濃度計(jì)算為其1. 25倍左右的濃度。接著，利用高壓釜對(duì)前述基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行121°C、15分鐘的滅菌處理。通過(guò)另行用水溶解糖(L-阿拉伯糖)而調(diào)制糖溶液。此時(shí)的糖溶液中的糖濃度設(shè)為由最終濃度計(jì)算為其5倍左右的濃度。接著利用過(guò)濾滅菌來(lái)進(jìn)行前述糖溶液的滅菌處理。然后，通過(guò)將前述基礎(chǔ)培養(yǎng)基與糖溶液以4 1的比例(體積比)進(jìn)行混合，獲得以所需濃度含有各成分的培養(yǎng)基。本說(shuō)明書(shū)中，IOOOmL培養(yǎng)基表示用水將基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分及糖稀釋?zhuān)蛊淇偭窟_(dá)到1000mL。予以說(shuō)明，本發(fā)明中，從含有雙歧桿菌的待測(cè)菌中僅對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定的方法所使用的培養(yǎng)基也可記載為長(zhǎng)雙岐桿菌種選擇用培養(yǎng)基、作為糖源僅含有 L-阿拉伯糖的長(zhǎng)雙岐桿菌種選擇用培養(yǎng)基等。實(shí)施例接著，示出試驗(yàn)例及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明不限定于以下的實(shí)施例。<試驗(yàn)例1 關(guān)于L-阿拉伯糖濃度的探討>1 石出，禾爾(Yeast Extracts Becton, Dickinson and Company 制)1.8g、肉膏('LAB-LEMC0' powder,OXOID ltd.制)6. 0g、胨(Bacto ρ 印 tone、Becton， Dickinson and Company制)6. 0g、氯化鈉3. 0g、醋酸鈉1. 8g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 3g、瓊脂15g，向其添加水后作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用。將L-阿拉伯糖按照其在培養(yǎng)基中的最終濃度達(dá)到表1所示的糖濃度的方式用水溶解，調(diào)制糖溶液。然后，通過(guò)混合前述基礎(chǔ)培養(yǎng)基和糖溶液，調(diào)制培養(yǎng)基1-1 1-4。表1 中，“％”表示“質(zhì)量％”。使用所調(diào)制的培養(yǎng)基，按照以下步驟實(shí)施了利用培養(yǎng)法(傾注培養(yǎng)法)的活菌數(shù)測(cè)定。作為試驗(yàn)試樣，使用了 BB536菌末(森永乳業(yè)株式會(huì)社制、1. 2 X10n/g含有品)。作為活菌數(shù)測(cè)定時(shí)稀釋試驗(yàn)試樣的稀釋液，使用了 0. 85%生理鹽水。用稀釋液(0. 85%生理鹽水)稀釋試驗(yàn)試樣(BB536菌末)，調(diào)制了測(cè)定試樣。利用傾注培養(yǎng)法將前述測(cè)定試樣與預(yù)先加熱至45°C而使其溶解的培養(yǎng)基(1-1 1-4) 一起散布在平板上，在瓊脂凝固而形成培養(yǎng)基后，在厭氧條件下進(jìn)行37°C、48小時(shí)的培養(yǎng)。培養(yǎng)后，通過(guò)目視測(cè)定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)，由前述測(cè)定值算出試驗(yàn)試樣中的活菌數(shù)值。將其結(jié)果示于表3。另外，利用0. Imm刻度的標(biāo)尺測(cè)定前述菌落的直徑(mm)，求出其平均值。將前述平均值作為“菌落直徑”示于表3。[表 1]m mmt rnmrnm —
__________(mm)
卜 PSf拉伯糖 1. 0%8. 3xl010/g θ7β——————-—.=..■=■:■::·—..........................................................................................................................................................................................................
1—2 L-阿拉伯糖 1.5% 1. 2X IQ1Vg O. 6
1—3 — L-阿拉伯糖 2.0% "" . 3XIO1Vb O. 8 1—4 L-兩拉伯糖 3.0% 1. Ox IO1Vg O. 9如表1的結(jié)果所示，在L-阿拉伯糖濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為1. O 1. 5%的培養(yǎng)基1-1 1-2中，所形成的菌落小，難以通過(guò)目視計(jì)測(cè)。在L-阿拉伯糖濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為2. O 3. O質(zhì)量％的培養(yǎng)基1-3 1-4中，形成通過(guò)目視可容易地計(jì)測(cè)的、 直徑0.8 0.9mm的菌落，測(cè)定的活菌數(shù)值也是接近實(shí)際菌數(shù)(1.2X10"/^)的值。<試驗(yàn)例2 關(guān)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的探討>通過(guò)使用含有表2所示的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基A、B、B_1或B-2，并將各基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的各成分的濃度(1.0倍的濃度)設(shè)為表3所示的倍率的濃度的培養(yǎng)基，進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的有效成分濃度的探討。表3所示的濃度的倍率表示在IOOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以表2所示的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的濃度為基準(zhǔn)(1.0倍)時(shí)，在IOOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中， 在維持表2的配合比的同時(shí)變更各基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的濃度的比例。一般來(lái)說(shuō)，在雙歧桿菌的活菌數(shù)測(cè)定中，使用向RCA培養(yǎng)基(強(qiáng)化梭菌瓊脂， Reinforced Clostridial Me dium Agar)、MRS 培養(yǎng)基(de Man Rogosa and Sharpe)中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽的mMRS培養(yǎng)基(改良的MRS培養(yǎng)基，modified MRS培養(yǎng)基)等。因而，以RCA培養(yǎng)基、mMRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成為參考，調(diào)制分別含有表2所示基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在上述的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加瓊脂，使其最終濃度(添加L-阿拉伯糖后的濃度) 相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量達(dá)到1. 5質(zhì)量％，再添加L-阿拉伯糖，使其最終濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量達(dá)到2質(zhì)量％，調(diào)制各培養(yǎng)基2-1 2-11。使用所得的培養(yǎng)基，與試驗(yàn)例1同樣地利用培養(yǎng)法進(jìn)行活菌數(shù)的測(cè)定。將其結(jié)果示于表3。[表 2]
Λ ^ M Λ-八基礎(chǔ)培養(yǎng)基
基石出培養(yǎng)成分一Αβ V^1 Β_2
ο 一一
豚蛋白胨(Proteose peptone ) No.3___101010
牛肉膏__10 10 10 10
酵母膏__3__5__5__5聚山梨醇酯80—1
硫酸鎂___OJ___0.1
硫酸銩___O1OS___0.05
檸檬酸銨—2
七鈉_ 5-
醋酸鈉__3__5__5__5
T^半胱氨酸鹽酸鹽0.5 0.5 0.5 0.5
9
單位表示g/1000mL。[表 3]
權(quán)利要求
1.一種活菌數(shù)的測(cè)定方法，其特征在于，其為使用培養(yǎng)基從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測(cè)菌中僅對(duì)屬于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum)的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定的方法，所述培養(yǎng)基滿(mǎn)足以下的1) 幻，且所述活菌數(shù)的測(cè)定是對(duì)形成于所述培養(yǎng)基的、直徑0. 7mm以上的菌落進(jìn)行計(jì)測(cè)1)作為糖源僅含有L-阿拉伯糖，2)作為氮源含有胨、肉膏及酵母膏，3)不含硫酸鎂及硫酸錳的任一者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基中的所述L-阿拉伯糖的濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為2 3質(zhì)量％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在IOOOmL培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中的所述胨的含量為6. 0 14. 0g/1000mL、所述肉膏的含量為6. 0 14. 0g/1000mL及所述酵母膏的含量為 1. 8 4. 2g/1000mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，屬于所述長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的微生物為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種· BB536株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述待測(cè)菌作為屬于所述雙歧桿菌屬的微生物，含有屬于所述長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的微生物，以及選自由屬于短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)的微生物、屬于動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animal is subsp. lactis)的微生物和屬于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp. infantis)的微生物組成的組中的至少1種微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，屬于所述短雙岐桿菌的微生物為短雙岐桿菌· M-16V 株。
7.一種培養(yǎng)基，其在權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法中使用，用于從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測(cè)菌中，僅對(duì)屬于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其作為糖源僅含有L-阿拉伯糖，所述L-阿拉伯糖的濃度相對(duì)于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為2 3質(zhì)量％，在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有酵母膏1. 8 4. 2g/1000mL、肉膏6. 0 14. 0g/1000mL及胨 6. 0 14. 0g/1000mL 而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活菌數(shù)的測(cè)定方法，其使用僅含有L-阿拉伯糖作為糖源的培養(yǎng)基，從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測(cè)菌中僅對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌種、例如僅對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種進(jìn)行識(shí)別，并測(cè)定其活菌數(shù)。另外，還可以提供作為前述測(cè)定方法中使用的選擇性培養(yǎng)基而有用的、調(diào)制也容易的培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102510901SQ201180003859
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者八重島智子, 武藤正達(dá), 阿部文明 申請(qǐng)人:森永乳業(yè)株式會(huì)社