專利名稱：活菌數(shù)的測定方法及培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用培養(yǎng)法從含有雙歧桿菌的待測菌中，僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測定的方法，以及作為前述測定方法用的選擇性培養(yǎng)基而有用的培養(yǎng)基。本申請基于2010年3月沈日在日本申請的日本特愿2010-72369號要求優(yōu)先權(quán)， 將其內(nèi)容援引于此。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌作為有用的腸內(nèi)細(xì)菌的一種而眾所周知，有很多關(guān)于其生理學(xué)意義的報告。例如，在腸內(nèi)產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機酸并抑制有害菌增殖的作用，維生素的產(chǎn)生、免疫力的激活等已被弄清楚。因而，以往提出了各種雙歧桿菌活菌制劑(非專利文獻(xiàn)1)。另外，以通過攝取雙歧桿菌來維持健康為目的，開發(fā)了含有雙歧桿菌的各種食品，例如酸奶等發(fā)酵乳、點心、飲料、 健康食品等。另外，在嬰幼兒期，攝取母乳的嬰幼兒雙歧桿菌占優(yōu)勢，因而在日本以外，也正在開發(fā)含有雙歧桿菌 乳酸菌的嬰幼兒奶粉等。目前，在世界市場中作為主要添加于食品的雙歧桿菌種可列舉出長雙岐桿菌種，也存在并用有短雙岐桿菌種的制品(非專利文獻(xiàn)2)。認(rèn)為對于消費者來說，從大量標(biāo)示制品的信息的觀點出發(fā)，將添加于制品中的有益菌的活菌數(shù)個別地表示有益的。另外，關(guān)于活菌數(shù)的標(biāo)示，印度尼西亞已確立了如下法律針對添加于制品中的有益菌，表示每一菌種的活菌數(shù)。目前，作為從包含雙歧桿菌和乳酸菌兩者的制品中測定任一種菌的活菌數(shù)的方法，已經(jīng)確立了使用僅生長雙歧桿菌的培養(yǎng)基的方法、利用需氧培養(yǎng)僅對乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法。另外，作為測定含有多種雙歧桿菌或乳酸菌的制品中的雙歧桿菌的菌種及其活菌數(shù)的方法，有根據(jù)將其涂抹于在BL瓊脂培養(yǎng)基中添加有無菌脫纖維血液的培養(yǎng)基上，利用厭氧培養(yǎng)使其在培養(yǎng)基上生長而形成的菌落的形態(tài)(顏色、形狀等)或利用革蘭氏染色法得到的菌的形態(tài)等進(jìn)行判定的方法(非專利文獻(xiàn)3)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 光岡知足編著，《Research on bifidobacteria)), Japan Bifidus Foundation, 1994 年，第 266-267 頁非專利文獻(xiàn) 2 :光岡知足編著，《Research on bifidobacteria)), Japan Bifidus Foundation, 1994 年，第 282-283 頁非專利文獻(xiàn)3 :〈〈Method for the enumeration of bifidobacteria in fermented milk and fermented milk drinks》， the Bifidobacterium Testing Methods Review Committee of the Japanese Association of Fermented Milks and Fermented Milk Drinks, 2000 年 3 月，第 1-13 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題但是，對于如上述非專利文獻(xiàn)3所記載的方法，當(dāng)菌落的形態(tài)、菌的形狀近似時， 對菌種的辨別需要專業(yè)的知識。因而，各個菌種的活菌數(shù)的測定有時非常困難。另外，在日本國外，很多國家無法獲得無菌脫纖維血液。對于這樣的國家而言，無法制作帶有血液的BL 瓊脂培養(yǎng)基，從而無法進(jìn)行前述方法。目前，由于如上述那樣存在配合有短雙岐桿菌種和長雙岐桿菌種的制品，在世界益生菌市場中廣泛使用短雙岐桿菌種、長雙岐桿菌種、乳雙岐桿菌種等，因而尋求能夠利用培養(yǎng)法從這些多個雙岐桿菌種混合存在的制品中，僅對特定的菌種、例如僅對短雙岐桿菌種進(jìn)行容易地測定的技術(shù)。本發(fā)明是為了解決上述課題而進(jìn)行的，其目的在于提供一種通過使用特定的培養(yǎng)法，從含有雙歧桿菌的待測菌中僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行容易地測定的測定方法， 以及作為前述測定方法用的選擇性培養(yǎng)基而有用的、且調(diào)制也容易的培養(yǎng)基。用于解決問題的方案本發(fā)明人等為了解決上述課題，對伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(BERGEY’ S MANUAL OF Systematic Bacteriology)，1986 年，第 2 卷，第 1428 頁，表 15. 51 及表 15. 54 所記載的糖類及雙歧桿菌(Bifidobacteria Microflora)，第 1(1)卷，第 3- 頁(Mitsuoka Tomotari 著，“腸道菌群的最近研究趨勢(Recent Trends in Research on Intestinal Flora)” 所記載的糖類進(jìn)行了詳細(xì)地研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在利用培養(yǎng)法進(jìn)行活菌數(shù)測定時，在短雙岐桿菌種、長雙岐桿菌種、動物雙岐桿菌種、嬰兒雙歧桿菌種中，短雙岐桿菌種的大部分可以將山梨糖醇及甘露醇同化；在長雙岐桿菌種、動物雙岐桿菌種、嬰兒雙歧桿菌種中，雖然嬰兒雙歧桿菌種的一部分菌株中存在將甘露醇及山梨糖醇同化的菌株，但其比例非常少。由此， 本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，結(jié)果成功的開發(fā)出以下培養(yǎng)基通過含有甘露醇及/或山梨糖醇作為唯一的糖源，并將糖以外的培養(yǎng)基成分(蛋白質(zhì)、肽等)的濃度設(shè)為一定范圍的濃度，從而使培養(yǎng)基中僅短雙岐桿菌種形成大的菌落。即，本發(fā)明人等通過利用短雙岐桿菌種的甘露醇及山梨糖醇的同化性，限定培養(yǎng)基成分的濃度，成功地開發(fā)了可以降低其它雙歧桿菌的菌落形成能力(colony forming capacity)的、僅對短雙岐桿菌種進(jìn)行活菌數(shù)測定的培養(yǎng)基。由此，可以從前述4菌種中僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測定。解決上述課題的本發(fā)明的測定方法及培養(yǎng)基具有以下方式。[1] 一種活菌數(shù)的測定方法，其特征在于，其為使用培養(yǎng)基從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測菌中僅對屬于短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測定的方法，前述培養(yǎng)基滿足以下的1)及幻，且前述活菌數(shù)的測定是對形成于前述培養(yǎng)基的、直徑0. 7mm以上的菌落進(jìn)行計測1)作為糖源僅含有選自山梨糖醇及甘露醇種的至少1種糖醇，2)作為氮源含有胨、肉膏及酵母膏。[2]根據(jù)[1]所述的方法，其中，前述培養(yǎng)基中的前述糖醇的濃度相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為4質(zhì)量％以下。[3]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，其中，在IOOOmL培養(yǎng)基中，前述培養(yǎng)基中的前述胨的含量為6. O 14. 0g/1000mL、前述肉膏的含量為6. O 14. 0g/1000mL及前述酵母膏的含量為 1. 8 4. 2g/1000mL。[4]根據(jù)[1] [3]中任一項所述的方法，其中，屬于前述短雙岐桿菌的微生物是短雙岐桿菌· M-16V株。[5]根據(jù)[1] [4]中任一項所述的方法，其中，前述待測菌作為屬于前述雙歧桿菌屬的微生物，含有屬于前述短雙岐桿菌的微生物，以及選自由屬于長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum)的微生物、屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animal is subsp. lactis)的微生物和屬于長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp. infantis)的微生物組成的組中的至少1種微生物。[6]根據(jù)[5]所述的方法，其中，屬于前述長雙歧桿菌長亞種的微生物是長雙歧桿菌長亞種· BB536株。[7] 一種培養(yǎng)基，其在[1] W]中任一項所述的方法中使用，用于從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測菌中，僅對屬于短雙岐桿菌的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測定。[8]根據(jù)[7]所述的培養(yǎng)基，其特征在于，其滿足以下的1) 5)1)作為糖源僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇，2)前述糖醇的濃度相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為4質(zhì)量％以下，3)在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有酵母膏1. 8 4. 2g/1000mL,4)在 IOOOmL 培養(yǎng)基中，含有肉膏 6. 0 14. 0g/1000mL,5)在 IOOOmL 培養(yǎng)基中，含有胨 6. 0 14. 0g/1000mL。在本說明書及權(quán)利要求書中，只要沒有特別限定，濃度(％ )為w/v(質(zhì)量/體積) 的值。雙歧桿菌表示屬于雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的微生物。另外，短雙岐桿菌種表示屬于短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)的微生物，長雙岐桿菌種表示屬于長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum)的微生物，動物雙岐桿菌種表示屬于動物雙岐桿菌(Bifidobacterium animal is)的微生物，乳雙岐桿菌種表示屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animal is subsp. lactis)的微生物，嬰兒雙歧桿菌種表示屬于長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp. infantis)的微生物?！熬北硎緦⒕勰┗漠a(chǎn)物。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種通過使用特定培養(yǎng)法，從含有雙歧桿菌的待測菌中僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行容易地測定的測定方法，以及作為前述測定方法用的選擇性培養(yǎng)基而有用的、且調(diào)制也容易的培養(yǎng)基。
具體實施例方式本發(fā)明的測定方法中，使用僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇作為糖源的培養(yǎng)基，從含有雙歧桿菌的待測菌中僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測定。關(guān)于培養(yǎng)基，詳見后述。
作為短雙岐桿菌種的菌株并無特別限定，可以是截止至今作為屬于短雙岐桿菌種的菌株而保藏于公共微生物保藏機構(gòu)(ATCC、NTCC、JCM、DSMZ、BCCM、LMG等)的公共機構(gòu)保藏株，也可以是通過公知的方法從自然界分離的分離株。作為公共機構(gòu)保藏株，例如可列舉出ATCC15700T株、M-16V株(以保藏號BCCM/LMG237^進(jìn)行保藏。作為M-16V菌末由森永乳業(yè)株式會社市售)等。上標(biāo)文字T表示標(biāo)準(zhǔn)株。待測菌所含有的雙歧桿菌可以僅是短雙岐桿菌種，但在本發(fā)明的有用性的觀點上，優(yōu)選除了短雙岐桿菌種之外，還含有短雙岐桿菌種以外的至少1種其它雙歧桿菌。作為前述短雙岐桿菌種以外的其它雙歧桿菌，并無特別限定，例如，可列舉出通常作為益生菌而廣泛使用的雙歧桿菌。其中，由于形成于前述培養(yǎng)基的菌落的尺寸小、易于與短雙岐桿菌種的菌落區(qū)分，因而優(yōu)選含有選自長雙岐桿菌種、乳雙岐桿菌種、嬰兒雙歧桿菌種中的至少1種。其中，優(yōu)選含有選自長雙岐桿菌種·ΑΤ(Χ 1570,株、長雙岐桿菌種·ΒΒ536 株(以保藏號ATCC ΒΑΑ-999進(jìn)行保藏。作為ΒΒ536菌末由森永乳業(yè)株式會社市售)、乳雙岐桿菌種· DSM 10140τ株、嬰兒雙歧桿菌種· ATCC 15697τ株中的至少1種，特別優(yōu)選含有長雙岐桿菌種· ΒΒ536株。作為含有通過本發(fā)明測定活菌數(shù)的待測菌的試樣，只要含有前述待測菌則無特別限定。具體而言，可列舉出發(fā)酵乳、點心、飲料、健康食品、嬰幼兒奶粉等食品，藥品、家畜用飼料等制品，對前述制品實施粉碎、利用稀釋液的稀釋等處理而得到的物質(zhì)等。前述試樣的培養(yǎng)除了使用本發(fā)明的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基之外，可以利用以往在利用培養(yǎng)法的微生物活菌數(shù)的測定中使用的公知的培養(yǎng)法。作為前述培養(yǎng)法，可列舉出固體培養(yǎng)法(使用瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)法)。作為固體培養(yǎng)法，具體而言，可列舉出傾注培養(yǎng)法(pour plate method)、涂布培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法(spiral plate method)等。傾注培養(yǎng)法是將試驗試樣(試樣或?qū)⒃嚇佑孟♂屢合♂尩南♂屛?與加溫溶解的瓊脂培養(yǎng)基混合，進(jìn)行冷卻固化實施培養(yǎng)的方法。涂布培養(yǎng)法是將試驗試樣涂布在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法是使用機器等將試驗試樣帶有濃度梯度地接種在培養(yǎng)基上的方法。本發(fā)明的測定方法具體而言，可如下實施使用以1.5質(zhì)量％左右濃度含有瓊脂的本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗試樣(試樣或?qū)⒃嚇佑孟♂屢合♂尩南♂屛?，在所形成的菌落中，對一定以上尺寸(例如直徑0.7mm以上)的菌落的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。此時所計數(shù)的菌落數(shù)相當(dāng)于用前述瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的試驗試樣中所包含的短雙岐桿菌種的活菌數(shù)。因此， 可以由從該值和稀釋倍率求出試樣中所包含的短雙岐桿菌種的活菌數(shù)(/g)。作為稀釋液，并無特別限定，可利用生理鹽水、上述非專利文獻(xiàn)3所記載的稀釋液 (A)(食品衛(wèi)生檢查指南所記載的厭氧性試樣稀釋液)等公知的稀釋液。本發(fā)明的培養(yǎng)條件可利用作為短雙岐桿菌種的培養(yǎng)條件而公知的培養(yǎng)條件。菌落數(shù)的計數(shù)通常在厭氧條件下于37°C培養(yǎng)48小時左右后，通過目視進(jìn)行。前述本發(fā)明的測定方法所使用的培養(yǎng)基作為糖源僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇(以下有時也稱作特定糖源)。作為前述特定糖源，可以僅為山梨糖醇，也可以僅為甘露醇?；蛘?，還可組合山梨糖醇和甘露醇。另外，山梨糖醇優(yōu)選為D-山梨糖醇，甘露醇優(yōu)選為D-甘露醇?；蛘?，還可以組合D-山梨糖醇和D-甘露醇。
在前述培養(yǎng)基中，前述特定糖源的濃度(山梨糖醇或甘露醇的濃度)從短雙岐桿菌種的選擇性的觀點出發(fā)，相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量，優(yōu)選為4質(zhì)量％以下。若考慮對滲透壓的影響、經(jīng)濟性方面時，更優(yōu)選為1 4質(zhì)量％。進(jìn)一步優(yōu)選為1 3質(zhì)量％。予以說明，作為本發(fā)明的培養(yǎng)基不包含的、前述特定糖源以外的糖源，例如可列舉出葡萄糖、淀粉、蔗糖、棉籽糖、半乳糖、阿拉伯糖等。前述培養(yǎng)基還可含有前述特定糖源以外的成分。以下，將構(gòu)成前述培養(yǎng)基的、除了作為糖源而唯一包含的前述特定糖源以外的成分記載為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分，可列舉出酵母膏、肉膏、胨等氮源；氯化鈉、醋酸鈉、丙酸鈉等鈉鹽，L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽(例如硫酸鎂、硫酸錳)等鹽類。這些之中，前述本發(fā)明的測定方法中使用的培養(yǎng)基作為氮源含有酵母膏、肉膏及胨。作為酵母膏、肉膏、胨，可分別利用通常用于微生物培養(yǎng)所用的物質(zhì)。酵母膏是以酵母作為原料，通過自消化酶等適度分解的營養(yǎng)源，具體而言，可例示出Yeast Extract (Becton, Dickinson and Company制)等。肉膏是由肉的浸出液獲得的營養(yǎng)源，通過賦予胨所不具備的礦物質(zhì)、磷酸、能量源等必須要素，補充胨的營養(yǎng)素特性的營養(yǎng)源。具體而言，可例示出'LAB-MEMCO' powder(0X0ID Ltd.制)等。胨是利用蛋白質(zhì)分解酶或酸將牛奶酪朊、動物的肉、大豆蛋白質(zhì)等部分水解的產(chǎn)物。具體而言，可例示出 Bacto peptone (Becton, Dickinson and Company ffj[J)等。在IOOOmL培養(yǎng)基中，酵母膏的含量優(yōu)選為1. 8 4. 2g/1000mL。更優(yōu)選為2. 7 4.2g/1000mL。在IOOOmL培養(yǎng)基中，肉膏的含量優(yōu)選為6. 0 14. 0g/1000mL。更優(yōu)選為9. 0 14.0g/1000mL。在IOOOmL培養(yǎng)基中，胨的含量優(yōu)選為6. 0 14. 0g/1000mL。更優(yōu)選為9.0 14.0g/1000mL。上述酵母膏、肉膏、胨各自的含量(g/1000mL)表示IOOOmL培養(yǎng)基中所包含的固體成分量(g)。從滲透壓的觀點出發(fā)，本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基優(yōu)選含有前述鹽類。作為前述鹽類優(yōu)選鈉鹽，特別優(yōu)選氯化鈉及醋酸鈉。培養(yǎng)基中，前述鹽類的含量在IOOOmL培養(yǎng)基中優(yōu)選為5 15g/1000mL。本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基從僅短雙岐桿菌種易于形成大的菌落、從混合存在的多個雙歧桿菌種之中易于正確地僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測定的方面出發(fā)，特別優(yōu)選滿足以下1) 5)的所有條件。1)作為糖源僅含有前述特定糖源。2)前述特定糖醇的濃度相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為4質(zhì)量％以下。3)在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有酵母膏1. 8 4. 2g/1000mL。4)在 IOOOmL 培養(yǎng)基中，含有肉膏 6. 0 14. 0g/1000mL。5)在 IOOOmL 培養(yǎng)基中，含有胨 6. 0 14. 0g/1000mL。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以根據(jù)需要在不損害本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)含有上述以外的其它成分。作為前述的其它成分，并無特別限定，可以含有通常添加于培養(yǎng)基的成分。例如，在活菌數(shù)測定時作為培養(yǎng)法使用固體培養(yǎng)法時，配合瓊脂。瓊脂通常按照其最終所得的培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到1. 5%左右的方式進(jìn)行配合。予以說明，還可在不影響短雙岐桿菌種的菌落生長和活菌數(shù)的范圍內(nèi)添加任意的抗生素。如上所述，通過使用含有短雙岐桿菌種具有同化性的前述特定糖源作為唯一糖源的培養(yǎng)基，可以從包含短雙岐桿菌種在內(nèi)的多種雙歧桿菌混合存在的制品中，僅對短雙岐桿菌種進(jìn)行識別、并對其活菌數(shù)進(jìn)行容易地測定。即，所述培養(yǎng)基中，僅短雙岐桿菌種形成大的菌落。例如，即使是存在部分同樣具有前述特定糖源的同化性的菌株的嬰兒雙歧桿菌種，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中所形成的菌落的尺寸也比短雙岐桿菌種所形成的菌落的尺寸小。當(dāng)為沒有前述特定糖源的同化性的雙歧桿菌種(例如長雙岐桿菌種、乳雙岐桿菌種等)時，前述菌落的尺寸變得更小。作為菌落尺寸產(chǎn)生差異的理由，認(rèn)為是上述培養(yǎng)基組成使短雙岐桿菌種以外的雙歧桿菌種的菌落形成能力(colony forming capacity)降低。因此，當(dāng)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基對包含短雙岐桿菌種在內(nèi)的多種雙歧桿菌混合存在的制品進(jìn)行培養(yǎng)時，即使不辨別菌落或菌的形態(tài)，通過計測生長得大的菌落數(shù)，可以僅對短雙岐桿菌種進(jìn)行識別，并測定其活菌數(shù)，較簡單。另外，其測定值與在前述BL瓊脂培養(yǎng)基中添加了無菌脫纖維血液的培養(yǎng)基那樣的現(xiàn)存培養(yǎng)基的測定值同等程度地正確。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基作為用于利用培養(yǎng)法對包含短雙岐桿菌種在內(nèi)的多種雙歧桿菌混合存在的制品中的短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測定的選擇性培養(yǎng)基是有用的。而且，本發(fā)明的培養(yǎng)基不需要如無菌脫纖維血液那樣的難以獲得的材料，因而調(diào)制也容易。在獲得上述效果的方面來看，重要的是作為氮源將胨、肉膏、酵母膏的各成分以規(guī)定濃度進(jìn)行組合。予以說明，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中可含有的鹽類中，硫酸鎂及硫酸錳在培養(yǎng)基中的含量越少，則菌落的生長變得越良好，因而優(yōu)選。具體而言，在IOOOmL培養(yǎng)基中，硫酸鎂的含量優(yōu)選為0. lg/1000mL以下，特別優(yōu)選為0g/1000mL。硫酸錳的含量優(yōu)選為0. 05g/1000mL 以下，特別優(yōu)選為0g/1000mL。對培養(yǎng)基的制造方法并無特別限定，可以利用公知的方法進(jìn)行制造。若舉出具體例子，首先將瓊脂、氯化鈉、醋酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽等任意成分與水一起添加至酵母膏、肉膏及胨中，進(jìn)行溶解，調(diào)制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。此時的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的各成分濃度設(shè)為從最終濃度計算為其1. 25倍左右的濃度。接著，利用高壓釜對前述基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行121°C、15分鐘的滅菌處理。通過另行用水溶解前述特定糖源而調(diào)制糖溶液。此時的糖溶液中的糖濃度設(shè)為由最終濃度計算為其5倍左右的濃度。接著利用過濾滅菌來進(jìn)行前述糖溶液的滅菌處理。然后，通過將前述基礎(chǔ)培養(yǎng)基與糖溶液以4 1的比例(體積比)進(jìn)行混合，獲得以所需濃度含有各成分的培養(yǎng)基。本說明書中，IOOOmL培養(yǎng)基表示用水將基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分及糖稀釋，使其總量達(dá)到1000mL。予以說明，本發(fā)明中，從含有雙歧桿菌的待測菌中僅對短雙岐桿菌種的活菌數(shù)進(jìn)行測定的方法所使用的培養(yǎng)基也可記載為短雙岐桿菌種選擇用培養(yǎng)基、作為糖源僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇的短雙岐桿菌種選擇用培養(yǎng)基等。實施例接著，示出試驗例及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明不限定于以下的實施例。<試驗例1 關(guān)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的探討>通過使用在IOOOmL中含有表1所示的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基A或B，并將各基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的濃度(1. 0倍的濃度)設(shè)為表2 3所示的倍率的濃度的培養(yǎng)基，進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的有效成分濃度的探討。表2 3所示的濃度的倍率表示在IOOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以表1所示的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的含量為基準(zhǔn)(1.0倍)時，在 IOOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在維持表1的配合比的同時變更各基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的濃度的比例。一般來說，在雙歧桿菌的活菌數(shù)測定中，使用向RCA培養(yǎng)基(強化梭菌瓊脂， Reinforced Clo stridial Me dium Agar)、MRS 培養(yǎng)基(de Man Rogosa and Sharpe)中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽的mMRS培養(yǎng)基(改良的MRS培養(yǎng)基，modified MRS培養(yǎng)基)等。 因而，以RCA培養(yǎng)基、mMRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成為參考，調(diào)制分別含有表1所示基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基A及基礎(chǔ)培養(yǎng)基B。在上述的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加瓊脂，使其最終濃度(添加D-甘露醇或D-山梨糖醇后的濃度)相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量達(dá)到1. 5質(zhì)量％，再添加D-甘露醇或D-山梨糖醇，使其最終濃度相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量達(dá)到1質(zhì)量％，調(diào)制各培養(yǎng)基1-1 1-14、2-1 2-8。使用所調(diào)制的培養(yǎng)基，按照以下步驟實施了利用培養(yǎng)法(傾注培養(yǎng)法)的活菌數(shù)測定。作為試驗試樣，使用M-16V菌末(森永乳業(yè)株式會社制、1.7 X IO1Vg含有品)，作為活菌數(shù)測定時稀釋試驗試樣的稀釋液，使用了 0. 85%生理鹽水。用稀釋液稀釋試驗試樣，調(diào)制了測定試樣。利用傾注培養(yǎng)法將前述測定試樣與預(yù)先加熱至45°C而使其溶解的培養(yǎng)基一起散布在平板上，在瓊脂凝固后，在厭氧條件下進(jìn)行 37 0C >48小時的培養(yǎng)。培養(yǎng)后，通過目視測定培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)，由前述測定值算出試驗試樣中的活菌數(shù)值。將其結(jié)果示于表2 3。另外，利用0. Imm刻度的標(biāo)尺測定前述菌落的直徑(mm)， 求出其平均值。將前述平均值作為“菌落直徑”示于表2 3。表中，“％”表示”質(zhì)量％”。[表1]
權(quán)利要求
1.一種活菌數(shù)的測定方法，其特征在于，其為使用培養(yǎng)基從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測菌中僅對屬于短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測定的方法，所述培養(yǎng)基滿足以下的1)及幻，且所述活菌數(shù)的測定是對形成于所述培養(yǎng)基的、直徑0. 7mm以上的菌落進(jìn)行計測1)作為糖源僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇，2)作為氮源含有胨、肉膏及酵母膏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基中的所述糖醇的濃度相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為4質(zhì)量％以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在IOOOmL培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中的所述胨的含量為6. 0 14. 0g/1000mL、所述肉膏的含量為6. 0 14. 0g/1000mL及所述酵母膏的含量為 1. 8 4. 2g/1000mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，屬于所述短雙岐桿菌的微生物是短雙岐桿菌· M-16V株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的方法，其中，所述待測菌作為屬于所述雙歧桿菌屬的微生物，含有屬于所述短雙岐桿菌的微生物，以及選自由屬于長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum)的微生物、屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animal is subsp. lactis)的微生物和屬于長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp. infantis)的微生物組成的組中的至少1種微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，屬于所述長雙歧桿菌長亞種的微生物是長雙歧桿菌長亞種· BB536株。
7.一種培養(yǎng)基，其在根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法中使用，用于從含有屬于雙歧桿菌屬的微生物的待測菌中，僅對屬于短雙岐桿菌的微生物的活菌數(shù)進(jìn)行測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于，其滿足以下的1) 5)1)作為糖源僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇，2)所述糖醇的濃度相對于培養(yǎng)基的總質(zhì)量為4質(zhì)量％以下，3)在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有酵母膏1.8 4. 2g/1000mL,4)在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有肉膏6.0 14. 0g/1000mL,5)在IOOOmL培養(yǎng)基中，含有胨6.0 14. 0g/1000mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活菌數(shù)的測定方法，其使用僅含有選自山梨糖醇及甘露醇中的至少1種糖醇作為糖源的培養(yǎng)基，從含有屬于雙岐桿菌屬的微生物的待測菌中僅對屬于短雙岐桿菌的微生物進(jìn)行識別，并測定其活菌數(shù)。另外，還可以提供作為前述測定方法中使用的選擇性培養(yǎng)基而有用的、調(diào)制也容易的培養(yǎng)基。
文檔編號C12Q1/06GK102510902SQ201180003860
公開日2012年6月20日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者八重島智子, 武藤正達(dá), 阿部文明 申請人:森永乳業(yè)株式會社