專利名稱：用于測定蛋白磷酸酶和激酶活性的基于fret的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及測定蛋白磷酸酶和激酶活性的方法。本公開內(nèi)容還涉及患者中鈣依賴磷酸酶活性和免疫抑制的臨床監(jiān)測方法，其可用于預(yù)測患者中的移植接物受性。
背景技術(shù)：
鈣依賴磷酸酶是依賴于鈣的、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其是涉及各種途徑——包括
T細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)。I丐依賴磷酸酶有三種同種型(isoform)的催化亞基-α，β和
Υ。α和β同種型的特有的不同功能已被識別。重要的是，β同種型似乎是T細胞正?；顒铀璧闹饕N型。將鈣依賴磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A和FK506加入到免疫抑制方案(immunosuppressive regimen)中降低急性同種異體移植排斥的發(fā)生,并有效地使腎移植患者的一年存活加倍。然而，長期移植存活的改善遠不顯著，僅有分別66%和78%的已故供體和存活供體接受者存活5年。當(dāng)針對不同種族群體來考慮時，該統(tǒng)計結(jié)果甚至更引人注目。80%的接收活供體器官的白種人存活5年，而僅64%的非洲裔美國人獲得那么久。針對已故供體器官的接收者，觀察到類似的趨勢；對于白種人有70%的存活率，而對于非洲裔美國人僅為55%。理解造成移植患者的迥異結(jié)果的機制是極其重要的一個領(lǐng)域。盡管已付出相當(dāng)多的努力，但對于足以解釋長期結(jié)果中的種族差異的潛在原因尚未達成共識。環(huán)孢菌素A(CsA)和FK506 (他克莫司(tacrolimus))通過抑制|丐依賴磷酸酶來發(fā)揮它們的免疫抑制作用。已知鈣依賴磷酸酶在T細胞受體下游被激活并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子——包括活化的T細胞的核因子(NFATs)。反過來，NFATc蛋白控制細胞因子的表達，所述細胞因子包括IL-2和IL-4。對鈣依賴磷酸酶/NFAT活性的阻礙抑制T細胞活性并導(dǎo)致免疫抑制作用。盡管環(huán)孢菌素A已經(jīng)在臨床上使用了 20多年，而FK506使用超過十年，但用于免疫抑制維持的目標血液水平尚未被適當(dāng)界定。治療性監(jiān)測環(huán)孢菌素谷濃度已經(jīng)被證明是較差的臨床指示物，因為一些患者在足夠的或者高血液環(huán)孢菌素濃度存在的情況下經(jīng)歷排斥，而其它患者在血液谷濃度低的時候出現(xiàn)毒性。環(huán)孢菌素劑量和臨床免疫抑制作用之間的差異表明，鈣依賴磷酸酶活性本身可能是可變性的來源。然而，僅存在直接測量鈣依賴磷酸酶活性的有限的研究，而且，沒有關(guān)于可能影響鈣依賴磷酸酶對環(huán)孢菌素和FK506抑制的敏感性的因素的數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本公開內(nèi)容包括在溶液中(in-solution)檢測和測量肽的修飾的方法以及檢測和測量介導(dǎo)這種修飾反應(yīng)的酶(例如，磷酸酶和激酶)的活性水平的方法。檢測，如磷酸酶活性的分析已經(jīng)利用二氧化鈦涂覆的板(plate)來分開磷酸化的與未磷酸化的肽底物。然后，通過已與肽連接的熒光標記檢測二氧化鈦結(jié)合磷酸化肽或未結(jié)合去磷酸化肽。雖然比放射性標記肽的其它方法有明顯優(yōu)勢，但該分析也存在若干缺點，包括需要移動樣品從反應(yīng)板到分離板到檢測板。在本公開內(nèi)容的方法中，可以在一個反應(yīng)中完成整個程序。使用與熒光團，如熒光素結(jié)合的二氧化鈦微珠，并且，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)定量檢測僅與微珠結(jié)合的被修飾的肽。本公開內(nèi)容的系統(tǒng)僅檢測與二氧化鈦結(jié)合的被修飾的肽，并且微珠可以保持懸浮或者結(jié)合到固體表面，如所期望的。因此，本公開內(nèi)容的一個方面包括測定肽修飾酶活性的方法，所述方法包括(a)提供分析反應(yīng)混合物，其包括目標肽，所述目標肽包含被肽修飾酶特異識別的氨基酸序列和與所述目標肽結(jié)合的第一熒光團種類；緩沖混合物，其被配置成允許肽修飾酶修飾所述目標肽；和測試樣品，其被懷疑含有肽修飾酶；(b)在適于肽修飾酶修飾目標肽的條件下，溫育所述分析反應(yīng)混合物；(c)在適于二氧化鈦結(jié)合被修飾的目標肽但不結(jié)合未被修飾的目標肽的條件下，使所述溫育的反應(yīng)混合物與二氧化鈦接觸，所述二氧化鈦具有結(jié)合在其 上的第二熒光團種類；(d)以所述第二熒光團種類的激發(fā)波長照射所述二氧化鈦，由此，所述第二熒光團種類發(fā)射第一熒光，所述第一熒光通過FRET激發(fā)所述第一熒光團種類，從而誘導(dǎo)從所述一熒光團種類發(fā)射第二熒光，所述第二熒光的波長不同于所述第一熒光的波長；(e)選擇性地檢測所述第二熒光，從而檢測被修飾的目標肽與二氧化鈦的結(jié)合；(f)測定所述第二熒光的強度；和(g)使所述第二熒光的強度與結(jié)合于所述二氧化鈦的、被修飾的目標肽的量關(guān)聯(lián)。本公開內(nèi)容的另一方面，包括用于測定測試樣品中肽修飾酶活性水平的試劑盒，包括容器，其包封目標肽，所述目標肽包含被肽修飾酶特異識別的氨基酸序列和與所述目標肽結(jié)合的第一熒光團種類；與第二熒光團種類結(jié)合的二氧化鈦；和，使用所述目標肽和所述二氧化鈦由基于FRET的熒光測量結(jié)果測定測試樣品的所述肽修飾酶活性的說明書。本公開內(nèi)容的再一方面，包括熒光單元(裝置)，其被配置以根據(jù)基于FRET的方法測量肽修飾酶活性，包括系統(tǒng)，其被配置以接收多種分析反應(yīng)混合物，每一種反應(yīng)混合物均包含目標肽，所述目標肽包含被肽修飾酶特異識別的氨基酸序列和與所述目標肽結(jié)合的第一熒光團種類、緩沖混合物，其被配置成允許肽修飾酶修飾所述目標肽，其中所述多種分析混合物中的每一種分析混合物均與結(jié)合有第二熒光團種類的二氧化鈦接觸，并且，其中所述二氧化鈦被配制為二氧化鈦微珠或附著于底質(zhì)的二氧化鈦；檢測系統(tǒng)，用以通過FRET檢測被修飾的目標肽與二氧化鈦的結(jié)合，其中以所述第二熒光團種類的激發(fā)波長照射所述二氧化鈦，由此，所述第二熒光團種類發(fā)射第一熒光，所述第一熒光激發(fā)所述第一熒光團種類，從而誘導(dǎo)從所述一熒光團種類發(fā)射第二熒光，所述第二熒光的波長不同于所述第一熒光的波長；測量系統(tǒng)，其被配置以測定所述第二熒光的強度；微處理器單元，其被配置以使所述第二熒光的強度與結(jié)合于所述二氧化鈦的、被修飾的目標肽的量關(guān)聯(lián)；和輸出單元，其被配置以提供對所述肽修飾酶活性的測量結(jié)果。
附圖簡介通過參考以下附圖，本公開內(nèi)容的許多方面可以被更好地理解。對附圖的更詳細的描述，見正文和實施例。圖I示意性地圖解了對鈣依賴磷酸酶活性的基于FRET的分析。圖2示意性地圖解了可檢測的熒光的FRET形成，這是由于磷酸化肽結(jié)合在二氧化鈦微珠上。圖3是曲線圖，圖解FLUOR- 二氧化鈦和TAMRA-肽RII之間的FRET。單獨的FLUOR珠發(fā)射約520nm的峰；單獨的TAMRA-肽發(fā)射580nm的可檢測的背景峰，而且，兩者的組合產(chǎn)生580nm峰的位移。圖4A和4B顯示一對曲線圖，圖解FRET 580nm峰作為FLUOR-珠濃度(圖4A)或TAMRA-RII肽濃度(圖4B)的函數(shù)的響應(yīng)曲線。在圖4A中，TAMRA-肽的量保持恒定，而FLUOR-珠的量增加。在580nm，存在FRET峰的劑量反應(yīng)性增加，而FLUOR峰以最大量的測 試珠出現(xiàn)在520nm處。在圖4B中，F(xiàn)LUOR-珠的量保持恒定，而加入不斷增加量的TAMRA-肽RII。FRET峰在580nm處以劑量反應(yīng)性方式增加，然而，在520nm，F(xiàn)LUOR峰沒有發(fā)生變化。圖5A是曲線圖，圖解FRET對不斷增加量的鈣依賴磷酸酶的響應(yīng)曲線。將580nm峰與僅含有TAMRA-肽RII而沒有珠(被指定最大或100%去磷酸化)的反應(yīng)以及與含有TAMRA-肽RII和珠但不含鈣依賴磷酸酶(被指定最小或0%去磷酸化)的反應(yīng)進行比較。圖5B是曲線圖，圖解鈣依賴磷酸酶濃度的線性劑量效應(yīng)。曲線可用于在實驗條件下從O單位到2單位的范圍推斷鈣依賴磷酸酶活性。圖6是曲線圖，圖解PPlA反應(yīng)緩沖液中肽RII和二氧化鈦之間的FRET相互作用。使用兩種量的FLUOR- 二氧化鈦微珠，并隨著二氧化鈦/RII相互作用量的不斷增加顯示FRET的劑量效應(yīng)。圖7是曲線圖，顯示分析緩沖液的變化可以消除對鈣依賴磷酸酶的檢測。圖8是曲線圖，顯示在PP1A/2A緩沖液中，檢測到磷酸酶活性的線性范圍并不歸于鈣依賴磷酸酶活性。圖9是曲線圖，顯示在PP1/2A緩沖液中檢測的磷酸酶活性以劑量依賴性方式對岡田酸(okadaic aicd)的抑制敏感。網(wǎng)田酸是已知的PP1/2A抑制劑。鈣依賴磷酸酶活性對于相似范圍的網(wǎng)田酸的進一步減少并不敏感。

圖10是曲線圖，圖解FRET對不斷增加量的PPlA的響應(yīng)曲線。圖11是曲線圖，顯示在PP1A/2A緩沖液中，檢測到磷酸酶活性的線性范圍并不歸于鈣依賴磷酸酶活性。圖12是曲線圖，圖解環(huán)孢菌素A以劑量依賴性方式抑制酶活性。Jurkat細胞用增加濃度的環(huán)孢菌素A溫育30分鐘，然后收獲并進行鈣依賴磷酸酶分析。圖13是曲線圖，圖解鈣依賴磷酸酶活性同時以時間和劑量依賴性方式增加。利用0、0. 5或I單位的純化酶在多達IOmin的反應(yīng)時間下測定鈣依賴磷酸酶活性。本公開內(nèi)容的描述在更詳細地描述本公開內(nèi)容之前，應(yīng)該理解，本公開內(nèi)容并不限于所描述的具體實施方式
，因此，當(dāng)然可以變化；同樣應(yīng)該理解，本文中使用的術(shù)語僅為了描述具體實施方式
的目的，而并不意圖是限制性的，因為本公開內(nèi)容的范圍將僅由所附權(quán)利要求書來限定。當(dāng)提供數(shù)值范圍時，應(yīng)該理解，在該范圍的上限和下限之間的每一涉及的值——到下限單位的十分之一，除非另有清楚說明——和該聲明范圍內(nèi)的任何其它聲明的數(shù)值或涉及的值均包括在本公開內(nèi)容中。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在較小范圍中，而且同樣包括在本公開內(nèi)容中，受到在聲明的范圍內(nèi)的任何特定的排除限值。當(dāng)聲明的范圍包括兩個界值中的一個或兩個時，排除那些被包括的限值任意之一或兩者的范圍也包括在本公開內(nèi)容中。除非另有說明，本文使用的任何技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文描述的相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧弦部梢杂糜趯嵤┗驕y試本公開內(nèi)容，但現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的方法和材料。本說明書所引用的所有出版物和專利通過引用被并入本文，這如同特定地和單獨地說明每一單獨的出版物或?qū)＠ㄟ^引用被并入，并且，它們通過引用被并入本文，以公開和描述與出版物所引用的方法和/或材料有關(guān)的方法和/或材料。對任何出版物的引用是針對其在申請日前的公開內(nèi)容，而并不應(yīng)該被解釋為承認本公開內(nèi)容因為在前的公開內(nèi)容而沒有資格領(lǐng)先于該出版物。此外，提供的出版物的日期可以不同于可能需要單獨確認的 實際出版日期。在本文中描述和說明的每一個單獨的實施方式均具有不連續(xù)的組件和特征，其易于與其它若干實施方式的任意之一的特征分離或組合而不背離本公開內(nèi)容的范圍和精神，在閱讀本公開內(nèi)容之后，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。任何敘述的方法可以按照被敘述的事件的順序來實施，或者按照邏輯上可行的任何其它順序來實施。除非另有說明，本公開內(nèi)容的實施方式將應(yīng)用醫(yī)學(xué)、有機化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)技術(shù)等等，其均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有充分說明。應(yīng)該注意，如在說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一 (a, an) ”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確說明。因此，例如，對“一載體”的引用包括多個載體。在本說明書和后面的權(quán)利要求書中，將引用一些術(shù)語，這些術(shù)語將被限定為具有以下含義，除非有明顯的相反意圖。如本文中所使用的，以下術(shù)語具有屬于它們的含義，除非另有說明。在本公開內(nèi)容中，“包含(comprises, comprising) ”、“含有(containing) ” 和“具有(having)”等等在美國專利法中具有屬于它們的含義，其可以表示“包括(includes, including) ”等等；當(dāng)應(yīng)用于本公開內(nèi)容所包括的方法和組合物時，“基本上由…組成”或“基本上由…構(gòu)成”等等是指類似于本文公開的那些的組合物，但其可以含有另外的結(jié)構(gòu)基團、組成成分或者方法步驟(或如上所述的其類似物或衍生物)。然而，與本文所公開的那些相應(yīng)的組合物或方法相比，這種另外的結(jié)構(gòu)基團、組成成分或方法步驟等并不在本質(zhì)上影響該組合物或方法的基本特點(一個或多個)或新特點(一個或多個)。當(dāng)應(yīng)用于本公開內(nèi)容所包括的方法和組合物時，“基本上由…組成”或“基本上由…構(gòu)成”等等具有歸于美國專利法的含義，并且，該術(shù)語是開放式的，允許被敘述的以外事物的存在，只要被敘述的事物的基本特點或新特點不因為被敘述的以外事物的存在而被改變，但排除現(xiàn)有技術(shù)實施方式?！叭芜x的”或“任選地”意為隨后描述的情形可以發(fā)生或可以不發(fā)生，以便該描述包括該情形發(fā)生的情況和該情形沒發(fā)生的情況。術(shù)語“多肽”包括蛋白質(zhì)和其片段。多肽在本文中作為氨基酸殘基序列被公開。這些序列從氨基到羧基末端的方向被從左到右書寫。根據(jù)標準命名法，氨基酸殘基序列或者以三個字母或者以單個字母代碼命名，如下面所示的丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg、R)、天冬酰胺(Asn、N)、天冬氨酸(Asp、D)、半胱氨酸(Cys、C)、谷氨酰胺(Gin、Q)、谷氨酸(Glu、E)、甘氨酸(Gly、G)、組氨酸(His、H)、異亮氨酸(He、I)、亮氨酸(Leu、L)、賴氨酸(Lys、K)、甲硫氨酸(Met、M)、苯丙氨酸(Phe、F)、脯氨酸(Pro、P)、絲氨酸(Ser、S)、蘇氨酸(Thr、T)、色氨酸(Trp、W)、酪氨酸(Tyr、Y)和結(jié)氨酸(VaUV) “可檢測地標記”意為片段或寡核苷酸含有放射性核苷酸，或者被熒光團取代的核苷酸，或者被一些其它分子種類取代的核苷酸，該其它分子種類引起可以被肉眼或通過使用儀器觀察到的物理或化學(xué)反應(yīng)，所述儀器如、但不限于閃爍計數(shù)器、比色計、UV分光光度計等。如本文中所使用的，“標記(label)”或“標簽(tag)”是指這樣的分子，該分子在通過，例如、但不限于共價結(jié)合或雜交被附著到另一分子，例如、但不限于多核苷酸或多核苷酸片段時，提供或增強檢測其它分子的手段。當(dāng)以不同波長激發(fā)時，熒光或熒光標記或標簽以特定波長發(fā)射可檢測的光。放射性標記或放射性標簽發(fā)射放射性顆粒，該放射性顆?？捎脙x器，如、但不限于閃爍計數(shù)器檢測。其它信號產(chǎn)生檢測方法包括化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、拉曼、比色、雜交保護分析和質(zhì)譜分析?！半摹笔侵高@樣的聚合物，其中單體是通過酰胺鍵結(jié)合在一起的氨基酸殘基，可選 地，“肽”是指多肽?！皢我欢嚯摹笔沁B續(xù)的肽，其組成蛋白質(zhì)。但氨基酸是α-氨基酸時，可以使用L-旋光異構(gòu)體或D-旋光異構(gòu)體，優(yōu)選L-異構(gòu)體。另外，非天然氨基酸，如丙氨酸、苯甘氨酸和高精氨酸意欲被包括。常常遇到的非基因編碼的氨基酸也可用于本公開內(nèi)容，盡管優(yōu)選的氨基酸是那些可被編碼的。對于綜述，見，例如Spatola, A. F.，在Chemistryand Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins (氨基酸、妝和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué))中，B. Weinstein,編輯，Marcel Dekker, N. Y.,第 267 頁(1983)。術(shù)語“氨基酸”是指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸以及以類似于天然產(chǎn)生的氨基酸的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸以及后來被修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、-羥基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然產(chǎn)生的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，與氫、羧基、氨基和R基團結(jié)合的碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保持與天然產(chǎn)生的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指這樣的化學(xué)化合物，其結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)，但其以類似于天然產(chǎn)生的氨基酸的方式發(fā)揮作用。在本文中，“氨基酸”可以通過其通常已知的三個字母符號或通過由IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會所推薦的單字母符號來指代。同樣地，核苷酸可以通過其通常被接受的單字母編碼來指代，所述單字母編碼如下所示丙氨酸(Ala、A)、精氨酸(Arg、R)、天冬酰胺(Asn、N)、天冬氨酸(Asp、D)、半胱氨酸(Cys、C)、谷氨酰胺(Gin、Q)、谷氨酸(Glu、E)、甘氨酸(Gly、G)、組氨酸(His、H)、異亮氨酸(He、I)、亮氨酸(Leu、L)、賴氨酸(Lys、I)、甲硫氨酸(Met、Μ)、苯丙氨酸(Phe、F)、脯氨酸(Pro、P)、絲氨酸(Ser、S)、蘇氨酸(Thr、T)、色氨酸(Trp、W)、酪氨酸(Tyr、Y)和結(jié)氨酸(Val、V)?！白凅w”是指不同于參考肽、多肽或多核苷酸但保留基本特性的多肽或多核苷酸。典型的肽或多肽變體的氨基酸序列與另外的肽或多肽、參考肽或多肽不同。通常，差異被限制，以便參考多肽和變體的序列整體極其相似(同源的)，并且在一些區(qū)域中一致。變體和參考多肽的氨基酸序列可以由于一個或多個修飾(例如，置換、增加和/或剔除)而不同。置換或插入的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼的氨基酸或可以不是。多肽變體可以是天然產(chǎn)生的，如等位變體，或者其可以是未知是天然發(fā)生的變體。可以對本公開內(nèi)容的肽的氨基酸序列進行修飾和改變，但仍產(chǎn)生與多肽具有相似特點的分子(例如，保守氨基酸置換)。例如，某些氨基酸可以在序列中被置換為其它氨基酸而不產(chǎn)生明顯的活性損失。因為是多肽的相互作用能力和性質(zhì)限定該多肽的生物學(xué)功能活性，某些氨基酸序列置換可以在多肽序列中進行，并仍然獲得具有相似特性的多肽。在進行這種改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在將相互作用生物學(xué)功能賦予給多肽上的重要性在本領(lǐng)域中是通常被理解的。已知某些氨基酸可以被置換為具有相似親水指數(shù)或分值的其它氨基酸并仍產(chǎn)生具有相似生物學(xué)活性的多肽。根據(jù)其疏水性和電荷特點，每一氨基酸均被指定親水指數(shù)。這些指數(shù)為異亮氨酸(+4.5)；結(jié)氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1. 9);丙氨酸(+1. 8);甘氨酸(-0. 4);蘇氨酸(-0. 7);絲氨酸(-0. 8);色氨酸(-0. 9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸、(-3. 5);天冬酰胺(-3. 5);賴氨酸(-3. 9);和精氨酸(-4. 5)。據(jù)認為，氨基酸的相對親水特性決定所得多肽的次級結(jié)構(gòu)，其反過來又限定多肽與其它分子的相互作用，所述其它分子如酶、底物、受體、抗體、抗原等等。本領(lǐng)域已知，氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)的另一氨基酸置換并仍能獲得功能上相當(dāng)?shù)亩嚯?。在這種變化中，優(yōu)選親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸的置換，尤其優(yōu)選在± I之內(nèi)的那些，更尤其優(yōu)選在±0. 5之內(nèi)的那些。相似氨基酸的置換也可以根據(jù)親水性來進行，尤其在由此產(chǎn)生的生物學(xué)功能相當(dāng)?shù)亩嚯幕螂囊鈭D用于免疫學(xué)實施方式的情況下。以下親水性值被指定給氨基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);脯氨酸(_0.5±1);蘇氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);結(jié)氨酸(-1.5);亮氨酸(-1. 8);異亮氨酸(-1. 8);酪氨酸(-2. 3);苯丙氨酸(-2. 5);色氨酸(-3. 4)。應(yīng)該理解，氨基酸可以被置換為具有相似親水性值的另外的氨基酸并仍能獲得生物學(xué)上相當(dāng)?shù)亩嚯模绕涫敲庖邔W(xué)上相當(dāng)?shù)亩嚯?。在這種變化中，優(yōu)選親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸的置換，尤其優(yōu)選在± I之內(nèi)的那些，甚至更尤其優(yōu)選在±0.5之內(nèi)的那些。如上所述，氨基酸置換通常基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等等?？紤]到上述特點的一個或多個特性的示例性置換對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是悉知的，其包括、但不限于(初始殘基示例性置換)(Ala:Gly，Ser),(Arg:Lys) > (Asn:Gin, His) > (Asp:Giu, Cys, Ser)、(Gin:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala) >(His:Asn, Gin)、(He:Leu, Val)、(Leu:lie, Val)、(Lys:Arg)> (Met:Leu, Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr: Ser) > (Tip:Tyr) > (Tyr:Trp, Phe)和(Val: lie, Leu)。因此,本公開內(nèi)容的實施方式考慮上述多肽的功能或生物學(xué)等同物。尤其地，多肽的實施方式可以包括與感興趣多肽具有約50%、60%、70%、80%、90%和95%序列同一性的變體。如本文中所使用的，術(shù)語“肽修飾酶”是指這樣的酶，該酶催化將小分子部分加入到蛋白質(zhì)或肽的氨基酸或從中去除。這種酶可以——但不必一一能夠識別特異氨基酸序列，從而允許酶通過蛋白質(zhì)或肽中的限定的位點(一個或多個)連接該部分或剔除該部分。例如，蛋白激酶可將磷酸基團加入到蛋白質(zhì)或肽，并且磷酸酶可以去除磷酸基團。鈣依賴磷酸酶(Calcineursn)被稱為鈣離子-和鈣調(diào)蛋白-依賴性絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶，其是許多細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的元件。(Guerini and Klee, (1989)Proc. Natl. Acad. Sci.(美國國家科學(xué)院院刊)USA 86:9183-9187)。該蛋白已經(jīng)在從酵母到哺乳動物的真核細胞中被識別。如本文中所使用的，術(shù)語“激酶”是指這樣的酶，其能夠?qū)⒘姿峄鶊F加入到蛋白質(zhì)、多肽或肽的氨基酸側(cè)鏈上。如本文中所使用的，術(shù)語“磷酸酶”是指這樣的酶，其能夠通過水解反應(yīng)從蛋白質(zhì)、多肽或肽去除磷酸基團。
如本文中所使用的，術(shù)語“鈣依賴磷酸酶抑制劑”是指與鈣依賴磷酸酶直接或非直接接觸的化合物，其降低或阻斷鈣依賴磷酸酶活性，如、但不限于環(huán)孢菌素A、他克莫司或其衍生物。如本文中所使用的，術(shù)語“目標肽”是指可用作肽修飾酶底物的肽。這種肽可以包含被酶特異識別的氨基酸序列以便酶與肽結(jié)合，同時號包含可以接收修飾部分或其上結(jié)合修飾部分的位點。如本文中所使用的，術(shù)語“修飾目標肽”是指酶向目標肽加入或從中去除小分子部分，如、但不限于酸性部分的作用。如本文中所使用的，術(shù)語“FRET”是指分子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在FRET方法中，一個熒光團能夠用作能量供體，而其另一個是能力受體分子。這些有時分別被稱為報告分子和淬滅分子。供體分子通過特定波長的光被激發(fā)，針對該光，其通常將顯示熒光發(fā)射波長。受體分子也在該波長被激發(fā)，以便其可通過各種距離依賴性能量轉(zhuǎn)移機制接收供體分子的發(fā)射能。通常，受體分子在它們密切接近(例如，在相同或鄰近的分子上)時接收供體分子的發(fā)射能。FRET可容易地用于檢測本公開內(nèi)容的結(jié)合二氧化鈦的肽。例如，見美國專利號 5，668，648,5, 707，804,5, 728，528,5, 853，992 和 5，869，255 (對于 FRET 燃料的描述)、TMergny 等(1994) Nucleic AcidRes.(核酸研究)22:920-928 和 Wolf 等(1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA85:8790-8794(對于FRET的一般描述和方法)，其均通過引用其整體被并入本文。如本文中所使用的，術(shù)語“熒光團”是指在本公開內(nèi)容的方法的上下文中與目標肽或二氧化鈦結(jié)合的熒光部分。如本文中所使用的，術(shù)語“測試樣品”是指加入到本公開內(nèi)容的方法的反應(yīng)混合物中的任何液體量，其中加入的液體量包含已知量的肽修飾酶或者可能(被懷疑)包含肽修飾酶。測試樣品在適于允許酶與目標肽反應(yīng)的緩沖液中可以包含已知量的肽修飾酶，或者可以衍生自生物學(xué)樣品，如組織、細胞或從人或動物對象中分離的流體樣品。例如，測試樣品可以是、但不限于從分離的細胞制備的溶解產(chǎn)物，如外周單核血細胞、組織解剖樣品等
坐寸ο如本文中所使用的，術(shù)語“外周單核血細胞(一種或多種)”是指具有圓核的血細胞。例如淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞。這些血細胞是免疫系統(tǒng)中與感染戰(zhàn)斗和適應(yīng)入侵者的重要成分。淋巴細胞群由T細胞(⑶4和⑶8，陽性率約75%)、B細胞和N細胞(約25%結(jié)合)組成。這些細胞可以利用菲可從全血中提取，菲可是一種親水性多糖，其分離血液層，以單核細胞和淋巴細胞在血漿層下面形成淡黃覆蓋層。該淡黃覆蓋層含有PBMCt5PBMC可以利用低滲裂解從全血中提取，該低滲裂解將優(yōu)先裂解紅血細胞。該方法導(dǎo)致獲得在先天免疫防御中重要的嗜中性粒細胞和其它多形核(PMN)細胞。如本文中所使用的，術(shù)語“溶解產(chǎn)物”是指分離細胞的懸浮液，其使其細胞膜通過化學(xué)、物理、酶法或其組合而破壞。細胞可以裂解在緩沖液中，細胞膜的破壞導(dǎo)致向周圍緩沖液釋放蛋白質(zhì)和其它細胞成分的混合物。裂解可以是全部的，其中被處理的細胞群程序中的所有細胞均釋放其細胞內(nèi)容物，裂解或者是部分的，其中分離細胞群中的至少50%、有利地，至少75%、更有利地，至少90%、最有利地，100%的細胞被破壞并釋放其細胞內(nèi)容物到懸浮緩沖液中。如本文中所使用的，術(shù)語“熒光標記的”是指使肽底物結(jié)合熒光部分，即熒光團。各種不同的標記部分可用于本公開內(nèi)容的底物中。這種基團包括熒光素標記、羅丹明標記、花菁標記(即，Cy3、Cy5 等等，一般可從 GEHeathcare 的 Amersham Biosciences 分部獲得)，Alexa突光染料家族和其它突光和突光染料,可從Molecular Probes/Invitrogen, inc.獲
得，并描述在“手冊-突光探針和標記技術(shù)指導(dǎo)(The Handbook-A Guide to Fluorescent
Probes and Labeling Technologies),第十版”(2005)中(可從 Invitrogen, Inc. /Molecular Probes獲得)?？蛇m用于本發(fā)明的化合物的、與核苷聚磷酸鹽一起使用的各種其它熒光和熒光標記描述在，例如，公開的美國專利申請?zhí)?003/0124576中，其全部內(nèi)容通過引用其整體被并入本文，為了各種目的。如本文中所使用的，術(shù)語“選擇性檢測”是指從波長光譜中檢測光的波長。這種選擇可以通過，例如，被設(shè)計來透射具有窄范圍波長的光同時反射超過所選范圍的波長的濾器來進行。縮寫TAMRA,(四甲基1_6_羧基羅丹明)；CsA，環(huán)孢菌素A ;F 506，他克莫司(FUJIMYCIN ) ;FRET，熒光共振能量轉(zhuǎn)移。論述鈣依賴磷酸酶是依賴于鈣的、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其涉及各種信號傳導(dǎo)通道。鈣依賴磷酸酶在磷酸酶中是獨特的，因為它的活性需要鈣，并且對阻斷相關(guān)磷酸酶PPlA和PP2A的化合物的抑制不敏感。因此，測量鈣依賴磷酸酶活性的最常見的方法依靠衍生自蛋白激酶A的RII亞基的底物在PP 1A/PP2A抑制劑存在的情況下的依賴于鈣的去磷酸化。在已建立的鈣依賴磷酸酶活性分析方法中，用蛋白激酶A和32Py[ATP]在適當(dāng)?shù)臈l件下溫育肽底物，以磷酸化具有放射性殘基的肽。然后，標記的底物被純化，并作為鈣依賴磷酸酶底物在短時間段內(nèi)被使用。為了測量鈣依賴磷酸酶活性，相等份的細胞溶解產(chǎn)物、反應(yīng)混合物和標記的底物在約30°C被溫育約10分鐘，然后，反應(yīng)被終止。為了測定每一反應(yīng)中多少磷酸化的肽被去磷酸化，單個柱被制備成含有預(yù)荷電的離子交換樹脂。反應(yīng)混合物被加載到柱上，并且，未結(jié)合的磷酸——未與樹脂結(jié)合——被洗脫。然后，洗脫部分中放射性的量在閃爍計數(shù)器中被測量，并用于量化鈣依賴磷酸酶活性。實際上，該方法具有若干缺點，包括使用放射性磷酸鹽標記肽底物、由于未結(jié)合的磷酸鹽而造成的背景、依賴于離子交 換來分離磷酸化的與未磷酸化肽以及最終測量自由磷酸鹽來代表鈣依賴磷酸酶活性。這些因素增加數(shù)據(jù)的可變性并降低分析的再現(xiàn)性。
本公開內(nèi)容包括在溶液中檢測和測量肽修飾的非放射性方法以及檢測和測量介導(dǎo)這種修飾反應(yīng)的酶(如、但不限于磷酸酶和激酶)活性水平的方法。在本文公開的方法之前，檢測肽修飾反應(yīng)，如磷酸酶活性的分析使用二氧化鈦涂覆的板來分離磷酸化的與未磷酸化的目標肽底物，如在PCT專利申請
發(fā)明者布萊恩·R·羅伯茨, 詹尼弗·L·古奇 申請人:愛默蕾大學(xué)