專利名稱：新穎的β-葡萄糖苷酶及其用途的制作方法
新穎的P-葡萄糖苷酶及其用途相關(guān)申請的交叉引用本申請主張享有2010年I月28日遞交的美國臨時申請No. 61/299，007的優(yōu)先權(quán)。在此通過引用該申請的全部內(nèi)容將其引入本文。
背景技術(shù)：
替代性能源的發(fā)展(如，太陽能、生物燃料、水力、風(fēng)カ等)，多年來一直受到大力提倡，以解決因大量消耗化石燃料而產(chǎn)生的日漸嚴(yán)重的能源問題。在諸多可能的能源中，植物生質(zhì)是特別受到關(guān)注的，因其為可再生性。植物體含有高量的纖維素，其為制造生物燃料的一種起始材料。為了將纖維素轉(zhuǎn)化為生物燃料，其首先需由微生物的纖維素水解系統(tǒng)降解為可發(fā)酵糖，諸如纖維ニ糖及葡萄糖。此種系統(tǒng)包括三種主要類型的水解酶，亦即，內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 91)及P -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. I. 21)。盡管已由各種微生物中分離出諸多葡萄糖苷酶，其效能皆不令人滿意。因此，仍需要具有高效 能的葡萄糖苷酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種新穎的葡萄糖苷酶，BGL-Cr_D2，其分離自臺灣原生種的真菌刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)。圖2所示為該成熟BGL_Cr_D2蛋白的序列(722個氨基酸殘基/SEQ ID勵1)、對應(yīng)的ゎ81-0-0200嫩(2166ゎ？8/5￡0 ID N0:2)、其信號肽序列(SEQ ID 勵:7)、對應(yīng)的00嫩(5已0 ID N0:8)、BGL_Cr_D2 蛋白與其信號肽(SEQ ID NO:4)、以及對應(yīng)的cDNA(SEQ ID NO: 5)。圖I所示為刺孢殼葉斑菌中編碼該BGL_Cr_D2酶的基因組DNA區(qū)域(2851bps，SEQ ID NO: 3)，其含有12個內(nèi)含子節(jié)段，而該基因組DNA區(qū)域?qū)?yīng)SEQID NO:4(SEQ ID NO:6)。因此，本發(fā)明的ー個方面表征為ー種分離的多肽，其含有與SEQ ID N0:1具有由BLAST算法所測定的至少70%(如，80%、90%、95%、或99%)氨基酸同一性的序列。在ー實(shí)例中，該多肽具有￠-葡萄糖苷酶活性。本發(fā)明亦涵括(i) 一種分離的核酸，其包括編碼上述多肽的核苷酸序列，以及
(ii)ー種宿主細(xì)胞，其含有該種分離的核酸。在ー實(shí)例中，該核苷酸序列含有SEQ ID N0:2、
3、5或6的序列。本發(fā)明的分離核酸可為表達(dá)載體，其中該核苷酸序列以可操作的方式連接適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?亦即，可在宿主細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的序列)。術(shù)語「分離的多肽」或「分離的核酸」在本文中指一多肽或核酸，其實(shí)質(zhì)上不含天然相關(guān)的分子，亦即，該些天然相關(guān)的分子構(gòu)成含有該多肽或核酸的制備物的最多20%干重。純度可以任何適當(dāng)?shù)姆椒y量，如，柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳及HPLC。本發(fā)明的范圍中也包括(A) —種組合物，其含有上述的多肽、外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、及3 -葡萄糖苷酶，以及(B) —種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)制備可發(fā)酵糖的方法。該方法包括(i)提供上述的組合物，以及(ii)使此組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以制備可發(fā)酵糖，如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、或纖維ニ糖。該可發(fā)酵糖可通過微生物發(fā)酵或酶的處理而轉(zhuǎn)化成為發(fā)酵產(chǎn)物，諸如醇。用于此方法中的木質(zhì)纖維素物質(zhì)的實(shí)例包括，但不限于，果園剪枝、樹叢、エ廠廢材、城市廢木料、城市廢棄物、伐木廢棄物、森林疏伐、短輪伐期木質(zhì)作物、エ業(yè)廢棄物、小麥、麥桿、燕麥桿、稻草、大麥桿、裸麥桿、亞麻莖、黃豆殼、稻殼、燕麥殼、甘蔗、玉米、玉米穗軸、玉米桿、玉米麩飼料、玉米芯、玉米皮、玉米粒、取自核仁的纖維、草原的草、鴨茅狀磨擦禾、狐尾草、甜菜渣、柑橘類水果渣、種殼、纖維素質(zhì)動物糞便、草坪修剪物、棉花、海草、樹木、灌木、草、甘蔗渣、谷物的濕或干磨的產(chǎn)物及副產(chǎn)物、城市固體廢棄物、廢紙、庭院廢棄物、草本材料、農(nóng)業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物、城市固體廢棄物、廢紙、紙漿、造紙廠廢材、枝條、灌木、甘蔗、玉米、玉米皮、能源作物、森林、水果、花、谷粒、草、草本作物、葉、樹皮、針狀葉、圓木材、根、樹苗、灌木、柳枝稷、樹木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麥粉頭、燕麥殼、硬及軟木、由農(nóng)業(yè)流程產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物質(zhì)、林業(yè)廢木，或其組合。如該發(fā)酵產(chǎn)物是可燃性的，該方法進(jìn)ー步包含燃燒該可燃性發(fā)酵產(chǎn)物以產(chǎn)生能量的步驟。本發(fā)明亦提供ー種生物反應(yīng)器，其含有木質(zhì)纖維素物質(zhì)以及一種組合物，該組合物含有上述的多肽、外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和/或β -葡萄糖苷酶。本發(fā)明的一或多個具體實(shí)例的細(xì)節(jié)述于附圖及下文的敘述。本發(fā)明的其它特征、 目的及優(yōu)點(diǎn)將可由該敘述及附圖以及權(quán)利要求書明示。


圖I是示出刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)中編碼BGL_Cr_D2酶的基因組DNA區(qū)域(2851bps，SEQ ID NO: 3)的圖表，該區(qū)域含有12個內(nèi)含子節(jié)段(在圖中以「白色」節(jié)段指明，并在序列中以「小寫/灰色/刪除線」節(jié)段指明)。編碼信號肽的區(qū)域在圖中以「黒色」指明，并在序列中以「底線」指明。圖2是顯示bgl-Cr-D2cDNA (2166bps/SEQ ID NO: 2，排除以底線指明的信號序列/SEQ ID N0:8)以及其對于臺灣原生種真菌刺孢殼葉斑菌的編碼氨基酸序列(722a. a殘基/SEQ ID NO: I，排除信號肽/SEQ ID N0:7)的圖示。圖3是根據(jù)取自糖苷水解酶(GH)家族3的β -葡萄糖苷酶(BGL)的氨基酸序列的種系發(fā)生樹的圖表，其顯不由重構(gòu)的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(SMDl 168菌株)所分泌的 BGL-Cr-D2_Pp 與柄籃狀菌(Τ· stipitatua)、土曲霉(A. terreus) NIH2624 及煙曲霉CL fumigates)A1163的β -D-葡萄糖苷葡糖水解酶具有相關(guān)性(亦即，AA序列具有64-65%相似性)。圖4是重構(gòu)pGAPZ a C載體圖譜的圖表，其顯示bgl_Cr_D2基因經(jīng)克隆以進(jìn)ー步轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。(在該圖譜下方顯示的簡化核苷酸序列中，該些縮減區(qū)域的長度，亦即，GAP啟動子、α-因子信號序列及bgl-Cr-D2，并不符合圖示的圖譜中依尺度繪制的實(shí)際大小。)圖5A及5B是顯示下列菌落相對于時間的生長及pNPG酶活性的圖示(A)巴斯德畢赤酵母SMD 1168菌株及(B)帶有bgl-Cr-D2的巴斯德畢赤酵母SMDl 168菌株；其顯示類似的生長曲線，但僅有克隆bgl-Cr-D2的菌落具有顯著的pNPG酶活性。圖6A-C是顯示非變性PAGE (A)、MUG酶譜分析(B)及SDS PAGE (C)的酶大小及活性的照片。(Pp 巴斯德畢赤酵母；Cr-D2 :刺孢殼葉斑菌真菌菌株D2 ；BGL β -葡萄糖苷酶。)圖7是顯示根據(jù)20小時的pH穩(wěn)定性評估(在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的pNPG酶活性測量(亦即，pH 5及55°C，10分鐘)之前，將酶置于4°C、特定pH值下20小時)，重組酶BGL_Cr-D2_Pp在廣泛的pH范圍下(4-9)皆為穩(wěn)定的圖表。BGL-Cr-D2-Pp的pNPG酶活性的最適pH值為約
5(在各個特定pH值測量該酶的pNPG酶活性)。圖8是顯示根據(jù)4小時的熱穩(wěn)定性評估(在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的pNPG酶活性測量之前，將酶置于各特定溫度下4小吋)，重組酶BGL-Cr-D2-Pp在4_55°C的溫度下皆為穩(wěn)定的圖示。BGL-Cr-D2-Pp的pNPG酶活性的最適溫度為約70°C (在各個特定溫度測量該酶的pNPG酶活性)；但在此高溫下，該酶在較長的放置時間后(如，^ 2小吋，圖9)會失活。圖9是顯示重組β -葡萄糖苷酶BGL-Cr-D2-Pp在4至75°C的溫度下，于9天期間內(nèi)的熱穩(wěn)定性的圖示。在彡50°C的溫度下，BGL-Cr-D2-Pp于9天內(nèi)皆維持穩(wěn)定(相對活性>80%)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是(至少部分)根據(jù)ー種新穎β -葡萄糖苷酶及其高酶活性或效能的非預(yù)期性發(fā)現(xiàn)。葡萄糖苷酶(或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，BGL)是用于進(jìn)行木質(zhì)纖維素糖化作用的ー組關(guān)鍵酶。此種類型的酶可在內(nèi)切葡聚糖酶(EG)(主要降解纖維素纖維的非結(jié)晶部分)及外切葡聚糖酶(或纖維ニ糖水解酶，CBH)(主要降解結(jié)晶纖維素)的作用后，由纖維素水解基質(zhì)(諸如，纖維ニ糖、纖維素寡糖、及其它葡萄糖苷)中釋放D-葡萄糖単元。就由木質(zhì)纖維素的エ業(yè)規(guī)模生物燃料生產(chǎn)而言，發(fā)現(xiàn)具有高活性及生產(chǎn)カ的低成本纖維素酶(亦即，CBH、EG、及BGL)是極為重要的。本發(fā)明掲示下列新穎發(fā)現(xiàn)具β_葡萄糖苷酶活性的多肽、編碼該多肽的多核苷酸以及自酵母菌表達(dá)的重組葡萄糖苷酶的葡萄糖苷酶特異性活性增進(jìn)。明確言之，發(fā)現(xiàn)ー種臺灣原生種的真菌，亦即，刺孢殼葉斑菌D2菌種，可分泌活性β -I, 4-葡萄糖苷酶(BGL-Cr-D2)。編碼此酶的基因(bgl_Cr_D2，大小=2166bps)已由逆轉(zhuǎn)錄的cDNA中克隆出來，并已經(jīng)使用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) SMDl 168菌株作為宿主而成功在酵母菌中表達(dá)。由畢赤酵母分泌的重組酶BGL-Cr-D2-Pp具有高于原酶(約3X)及基準(zhǔn)Novozyme-188 (約17X)的較高β -葡萄糖苷酶活性(根據(jù)pNPG酶活性測量)。本發(fā)明提供一種新穎的重組β -葡萄糖苷酶，其具有與其它纖維素酶共同利用以進(jìn)行纖維素糖化作用的潛力。I.來自木質(zhì)纖維素的生物燃料再生性能源的發(fā)展(如，太陽能、生物燃料、水力、風(fēng)カ等)多年來一直受到大力提倡，以解決因大量消耗化石燃料而產(chǎn)生的日漸嚴(yán)重的能源問題。在目前所開發(fā)的能量形式/來源中，生物燃料具有可一方面減少農(nóng)業(yè)/都市/エ業(yè)的有機(jī)廢棄物，同時產(chǎn)生潔凈與富含能量的燃料(如，甲醇、こ醇、丁醇、及氫)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。因此，其已被列為重要永續(xù)能源之一 (Antoni et al., 2007, Appl Microbiol Biotechnol 77:23-35 ;及 Rubin, 2008，Natures454:841-845)。不只在臺灣，全世界都亟需由木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物こ醇，因?yàn)槊磕甑厍蛏隙家a(chǎn)生約5X1012噸富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物，而在諸多國家中，其皆已經(jīng)或?qū)谄椭刑砑婴炒?。在進(jìn)ー步的發(fā)酵進(jìn)行こ醇生產(chǎn)之前，需要各種不同的酶系統(tǒng)(如，木質(zhì)酶、纖維素酶及半纖維素酶)以完全分解木質(zhì)纖維素(含有約5-30%的木質(zhì)素、約35-50%的纖維素及約20-35%的半纖維素)而釋放可發(fā)酵的葡萄糖(Lynd et al. , 2002, Microbiol Mol Biol Rev66:506-577)。2.纖維素酶就由纖維素所進(jìn)行的生物こ醇生產(chǎn)而言，纖維素酶的有效糖化作用(降解多聚性的纖維素纖維以釋放較小的葡萄糖分子)是極為關(guān)鍵的。纖維素酶是一群負(fù)責(zé)進(jìn)行復(fù)雜纖維素水解作用的酶。根據(jù)該些酶的結(jié)構(gòu)及功能特征，多種的纖維素酶已被分類成為三組，亦即，(i)外切葡聚糖酶(包括1，4-0-D-葡聚糖纖維ニ糖水解酶，CBH, EC 3.2.1.91及1，4-^-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3. 2. I. 74)，(ii)內(nèi)切葡聚糖酶(EG) (EC 3. 2. I. 4)及(iii) ^ -葡萄糖苷酶(或P -D-葡萄糖苷葡糖水解酶，BGL) (EC 3. 2. I. 21) (Coughlanet al. , 1988,于 Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 11-30 ;及 Henrissat et al. , 1989, Gene 81:83-95)。CBH主要是作用在位于纖維素纖維的還原或非還原端的結(jié)晶部分，而EG則隨機(jī)攻擊纖維素的非結(jié)晶部分。更特定言之，該些纖維素酶可切割纖維素中葡糖基間的￠-1, 4-葡聚糖或P-D-葡萄糖苷連接，以形成短鏈基質(zhì)，其包括纖維ニ糖(亦即，雙糖)、其它纖維糊精(亦即，纖維素寡糖)、及葡萄糖苷(如，醇苷、氰苷、或酚苷)。該些短鏈中間化合物可由BGL進(jìn)ー步水解為葡萄糖(亦即，單糖)，該酶主要是催化氧親核基間的糖基轉(zhuǎn)移(Bhatia et al. , 2002, Crit Rev Biotechnol 22 (4) : 375-407)。就纖維素糖化作用而言，不足的BGL活性不僅會造成葡萄糖的缺乏，亦會造成纖維ニ糖的累積，而纖維ニ糖是CBH及EG的纖維素水解作用的強(qiáng)抑制劑(Harris et al.，2007，US專利7，244，605B2)。因此，BGL在由纖維素達(dá)成高こ醇產(chǎn)率上扮演著重要角色(Lynd etal. , 2002, Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577 ;及 Hong et al. , 2007, Appl MicrobiolBiotechnol 73:1331-1339)。3. ￠-葡萄糖苷酶(BGLs)的來源酶BGL是遍在性的，且已在所有生物界中獲得發(fā)現(xiàn)，從微生物、昆蟲、及植物，到高度演化的哺乳動物(Esen, 1993, Biochemistry and Molecular Biology, AmericanChemical Society,1-14;Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22 (4):375-407)。其中ー種主要的BGL產(chǎn)源是來自于細(xì)菌，包括農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、桿菌屬(Bacillus)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、纖維弧菌屬(Cellovibrio)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、熾熱球菌屬(Pyrococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、熱袍菌屬(Thermotoga)、嗜熱放線菌屬(Thermobifida)等中的某些菌株(Hashimoto etal.,1998,Arch Biochem Biophys 360:1-9 ；Srivastava et al.,1999,Biotechnol Lett21:293-297 ;及 Yun et al. , 2001, Biosci Biotechnol Biochem 65 (9):2028-2032)。具有BGL生產(chǎn)能力的真菌菌株(霉菌或酵母菌)包括取自曲菌屬(Aspergillus)、念珠菌屬(Candida)、腐埴菌屬(Humicola)、青霉屬(PeniciIlium)、畢赤酵母屬(Pichia)、覆膜酵母屬(Saccharomycopsis)> 踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、木霉菌屬(Trichoderma)等(Danet al. , 2000, J Biol Chem 275(7):4973-4980 ；及 Dunn-Coleman et al.，2008，美國專利公開案2008/0095889A1)。在該些微生物中，真菌種黑曲菌(Aspergillus niger)、熏煙曲菌(Aspergillus fumigates)、及瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是最為熟之且有效的BGL生產(chǎn)者，因而使其成為世界上商用BGL的主要來源(Dan et al.，2000，JBiol Chem275 (7) :4973-4980 ；Harris et al.，2007，美國專利第 7，244，605B2 號；及Dunn-Coleman et al. , 2008,美國專利公開案2008/0095889A1)。此外，已發(fā)現(xiàn)少數(shù)的植物亦含有BGL，如大麥、閉鞘姜及玉米。除上述的天然來源之外，有些重組BGLs已在不同的宿主中表達(dá)(如，大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(B. subtilis)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、酉良酒酵母(S. cerevisiae)、白曲霉菌(A. kawachii)及瑞氏木霉(T. reesei)) (Pandey et al. , 1995, JFerment Bioeng 80 (5):446-453 ;Murray et al.,2004,Protein Expres Purif38:248-257 ;及 Roy et al. , 2005, Biochem Bioph Res Co336:299-308)。舉例而言，取自桿菌種的bgl基因已被成功克隆并在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)(Hashimoto et al. , 1998, ArchBiochem Biophys 360:1-9 ;及 Srivastava et al.,1999, Biotechnol Lett 21:293-297)。此外，黑曲菌的BGL編碼基因bgll已在巴斯德畢赤酵母及釀酒酵母中表達(dá)(Dan etal.,2000, J Biol Chem275 (7) :4973-4980)。由各種不同的來源克隆BGL基因，接著再在不同的宿主中表達(dá)，此已為取得較高BGL生產(chǎn)カ(過表達(dá))和/或活性(較佳的翻譯后修飾改良 該些酶的動カ特征)的實(shí)務(wù)方法。4. BGLs 的特性到目前為止，BGLs的特性相當(dāng)分岐。一般而言，取自不同目及界的BGLs，對于連接糖基的糖苷配基部分(芳基-、烷基-、或胺基-)，似乎具有不同的特異性(Bhatia etal., 2002, Crit Rev Biotechnol 22 (4) : 375-407)。已發(fā)現(xiàn)其為胞內(nèi)、胞外、連接細(xì)胞溶質(zhì)、連接膜或位于細(xì)胞周質(zhì)。其對于水解短鏈纖維ニ糖或寡糖的催化功能在纖維素微生物之間相當(dāng)類似，但在不同的生物中則已發(fā)現(xiàn)部分其它不同的功能(如，在部分微生物中可合成不同分子間的糖基鍵，在昆蟲及植物中可由氰苷前體化合物釋出氰化物，以及在人體中可水解糖基神經(jīng)酰胺以治療高雪氏癥(Gaucher，s disease) ) (Bhatia et al. , 2002, CritRev Biotechnol 22 (4) : 375-407)。就纖維素的水解作用而言，BGLs可以保留凈異頭構(gòu)象的方式水解其底物，該作用推測是經(jīng)由兩步驟、雙替代的機(jī)制進(jìn)行，其涉及關(guān)鍵活性位點(diǎn)的兩個羧酸殘基(Davies et al. , 1998, Comprehensive Biological CatalysisVol. I, pp. 119-208;and Withers, 2001, Carbohyd Polym 44:325-337)。已經(jīng)指出，BGLs具有不同的底物特異性，且可作用于廣泛的底物(如，PNPG、纖維ニ糖、水楊素、MUG、熊果素、芳基_、烷基-及甲基-葡糖苷)。此外，大部分的BGLs具有在弱酸范圍中的最適pH，并具有嗜中溫范圍的最適溫度，但亦曾報告有部分的強(qiáng)酸和/或嗜熱特性。取自不同生物來源的BGL單體具有極為廣泛的分子大小范圍(亦即，約13_137kDa) (Gabelsberger etal.,1993, Appl Microbiol Biotechnol 40:44-52 ; Iwashita et al. , 1999, Appl EnvironMicrobiol 65:5546-5553 ；Srivastava et al. , 1999, Biotechnol Lett 21:293-297;及Dan et al.，2000，J Biol Chem275 (7) : 4973-4980)。不同生物種 BGLs 間的氨基酸序列相似性亦廣泛各異(10s-90s%)。然而，已鑒定出天冬氨酸(Asp，D)及谷氨酸(Glu，E)為BGLs的催化性親核基團(tuán)及催化性質(zhì)子供體。5. BGLs 的分類根據(jù)其所催化的化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)IUBMB (國際生物化學(xué)暨分子生物學(xué)聯(lián)合會(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)ジ所公布用于3，000種以上的酶的數(shù)字分類規(guī)則，所有BGLs已被指定為EC 3.2. I. 21類別(亦即，3-水解酶、2-糖基酶、I-糖苷酶及 21-葡萄糖苷酶)(Webb, 1992, Enzyme nomenclature: recommendationsof the Nomenclature しommittee οι the international Union of Biocnemistry andMolecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes[酶命名法國際生物化學(xué)暨分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會對于酶命名及分類的建議]，ISBN0-12-227164-5 ；以及 ExPASy, 2009, www. expasy. org/enzyme/)。另外，BGLs 是多功能的水解酶，其已根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)ー步分類(如，底物特異性及序列同一性)。早先，BGLs被歸類成為第 I 型及第 II 型(Beguin et al. , 1990, Ann Rev Microbiol 44:219-248)或是亞型 A及B(Rojas et al.，1995，Biochem Mol Biol Int 35:1223-1231);但近來該些較早期的分類大部分已被根據(jù)氨基酸和/或核苷酸序列同一性的現(xiàn)今所接受的標(biāo)準(zhǔn)取代(Henrissatet al. , 1996, Biochem J 316:695-696)。根據(jù)氨基酸序列及折疊相似性，BGLs已被歸至115種至今(2009年11月)所定義的GH (糖苷水解酶)家族中的家族I或3中，除外糖基神經(jīng)酰胺酶(亦即，歸于家族 30 的酸性 β-葡萄糖苷酶)(Henrissat, 1991, Biochem J280:309-316 ;Henrissat etal.,1993,Biochem J 293:781-788 ；Henrissat et al.,1996, Biochem J 316:695-696;Hong et al.,2007, Appl Microbiol Biotechnol73:1331-1339 ；及 Cantarel etal.，2009，Nucleic Acids Res. 37:D233_238)。家族 I (GHl)含有取自部分古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、植物及哺乳動物的葡萄糖苷酶，而家族3(GH3)則包含部分細(xì)菌、真菌及植物來源的 β _ 葡萄糖苷酶(Henrissatet al. , 1996, Biochem J 316:695-696 ;及 Cantarel etal. , 2009, NucleicAcids Res. 37:D233_238)。6.應(yīng)用除了用于進(jìn)行纖維素こ醇生產(chǎn)的纖維ニ糖/纖維糊精水解功能之外，BGLs亦可廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及食品業(yè)的領(lǐng)域中，其中需要諸多涉及糖苷鍵的切割或合成的反應(yīng)。根據(jù)BGLs的水解活性的應(yīng)用包括(I)除去柑橘類果汁的苦澀感，(2)制造低黏度結(jié)冷膠食品，
(3)解毒木薯(熱帶地區(qū)第三到第四大的能量來源)，(4)增強(qiáng)香氣釋放以幫助制酒流程，(5)做為飼料添加物以增進(jìn)單胃動物的營養(yǎng)利用，(6)將染料木苷水解為染料木黃酮以作為抗癌劑，(7)由根皮苷產(chǎn)生黑色素以降低皮膚癌的風(fēng)險并促進(jìn)毛發(fā)深色，(8)由橄欖苦苷產(chǎn)生羥基酪醇以預(yù)防冠狀動脈心臟病及癌癥，(9)水解昆布多糖以生產(chǎn)酵母提取物并將海藻生質(zhì)轉(zhuǎn)化成為可發(fā)酵糖，(10)制造色素作為糕點(diǎn)糖果產(chǎn)品中的天然食物染劑等等(Bhatia etal. , 2002, Crit Rev Biotechnol 22 (4):375-407)。此外，合成性的BGLs活性已被廣泛用于制造藥物、精細(xì)化學(xué)品及食品成份(如由 Bhatia et al. , 2002, Crit Rev Biotechnol 22 (4) : 375-407 所摘述)。例如，合成性的芳族η-烷基葡萄糖苷酯可有效用于治療發(fā)燒、風(fēng)濕、頭痛、及其它疾病(Otto etal.，1998，Biotechnol Lett 20:437-440)。亦已有其它BGLs應(yīng)用的報告，諸如，組織漿菌癥的血清診斷，或是肝缺血再灌流損傷及復(fù)原之后診斷。因此，由各異的來源制備高質(zhì)量/大量的BGLs就該些多用途的應(yīng)用而言一直都是基本任務(wù)。 本文所述是ー種分離的多肽，其包括與BGL-Cr-D2(SEQ ID NO: I)或其具有至少20個(如，30、50、80、100、150、200、250、300及350個)Btt連氨基酸的部分具有至少70%同一性
的氨基酸序列。
兩氨基酸序列的「同一性百分比」是使用Karlin and Altschul Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:2264-68，1990 的算法，如 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5873-77，1993中所修飾者進(jìn)行判定。此種算法已納入Altschul, et al. J. Mol.Biol. 215:403-10, 1990 的 NBLAST 及 XBLAST 程序(2. O 版)中。BLAST 蛋白檢索可以 XBLAST程序、得分=50、字長=3進(jìn)行，以取得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。在兩序列間存在空位時，可如 Altschul et al. ,Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402，1997 所述使用GappedBLAST。在使用BLAST及Gapped BLAST程序時，可使用各程序的系統(tǒng)預(yù)設(shè)參數(shù)(如，XBLAST 及 NBLAST)。該分離的多肽可由適當(dāng)微生物(如，刺孢殼葉斑菌)純化而制備。其亦可經(jīng)由已知的重組技術(shù)制備。其中一種實(shí)例如下。自刺孢殼葉斑菌細(xì)胞以聚合酶連鎖反應(yīng)制備編碼BGL-Cr-D2的DNA片段，再將其克隆至表達(dá)載體中。在插入?yún)迹摼幋aBGL_Cr_D2的片段是以可操作的方式與該表達(dá)載體中所含的適當(dāng)啟動子連接。接著將所得的DNA構(gòu)建體引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中(如，大腸桿菌細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞)以進(jìn)行 BGL-Cr-D2的表達(dá)，其再可以已知的方法由該些細(xì)胞中純化。酵母菌細(xì)胞的實(shí)例之ー為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris),如，巴斯德畢赤酵母SMD1168菌株。為制備BGL-Cr_D2的功能等效物，其亦包括在本發(fā)明的范圍之中，可在不破壞其β-葡萄糖苷酶活性的情形下，將ー或多個保守性的氨基酸取代引入SEQ ID Ν0:1中?！副Ｊ匦缘陌被崛〈故瞧渲邪被釟埢?jīng)具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換者。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在本領(lǐng)域中獲得定義。該些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈者(如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈者(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、羥丁氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈者(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有支鏈性側(cè)鏈者(如，羥丁氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳族側(cè)鏈者(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，較佳可以取自相同側(cè)鏈家族的另ー氨基酸殘基取代SEQ ID Ν0:1中預(yù)期為非必需的氨基酸殘基?；蛘?，可在SEQ ID NO: I的全部或部分隨機(jī)引入突變，諸如，通過飽和突變，再篩選所得突變體的β -葡萄糖苷酶活性，以鑒定保留該活性的突變體，如下文實(shí)例ー節(jié)所述?？蓱?yīng)用融合蛋白技術(shù)以改良本發(fā)明多肽的表達(dá)效率并協(xié)助其純化。為制備含有BGL-Cr-D2的融合蛋白，可使編碼此種β -葡萄糖苷酶的DNA片段與編碼融合配對物(如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6x-His抗原表位標(biāo)記或Μ13基因3蛋白)的另ー DNA片段連接。在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)，將所得的融合核酸表達(dá)為融合蛋白，其可再以本領(lǐng)域中已知的方法分離。該分離的融合蛋白可進(jìn)ー步由，如，酶切消化作用處理，以除去該融合配對物，并取得本發(fā)明的重組多肽。本文還描述了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明的多肽。核酸是指DNA分子(如，cDNA或基因組DNA )、RNA分子、或DNA/RNA類似物，其可由核苷酸類似物合成。在ー實(shí)例中，本發(fā)明的核酸是ー表達(dá)載體，其中編碼該多肽的DNA片段以可操作的方式連接適當(dāng)?shù)膯幼?。在本文中，術(shù)語「啟動子」是指ー種核苷酸序列，其含有可在想要的宿主微生物中起始與其以可操作方式連接的核酸序列轉(zhuǎn)錄的元件。最低限度，啟動子含有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。其可進(jìn)ー步含有一或多個增強(qiáng)子元件，其就定義而言可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，或是ー或多個調(diào)控元件，其可控制該啟動子的開/關(guān)狀態(tài)。當(dāng)使用大腸桿菌作為宿主微生物吋，代表性的大腸桿菌啟動子包括，但不限干，￠-內(nèi)酰胺酶及乳糖啟動子系統(tǒng)(參見Changet al.，Nature275:615-624, 1978)，SP6、T3、T5、及 T7RNA 聚合酶啟動子(Studier etal. , Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990)，入啟動子(Elvin et al. , Gene 87:123-126，1990)，trp啟動子(Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155-164，1983),以及Tac及Trc啟動子(Russell et al.，Gene 20:231-243，1982)。在使用酵母菌作為宿主微生物時，例示性的酵母菌啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶啟動子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子，半乳糖激酶(GALl)啟動子，半乳糖表異構(gòu)酶啟動子以及醇脫氫酶(ADH)啟動子。適合用于在其它類型的細(xì)胞中驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子亦為本領(lǐng)域中所熟知。載體是指ー種核酸分子，其可載運(yùn)其所連接的另ー核酸。載體可獨(dú)立復(fù)制或是納入宿主DNA中。載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、黏接質(zhì)粒(cosmid)或病毒載體。本發(fā)明的載體包括編碼BGL-Cr-D2的核苷酸序列，其形式為適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸者。較佳地，該載體包括一或多個調(diào)控序列，以可操作的方式連接該編碼序列?！刚{(diào)控序列」包括啟動子、增強(qiáng)子以及其它表達(dá)控制元件(如，聚腺苷酸化信號)。調(diào)控序列包括該些可指引核苷酸序列的組 成型全身表達(dá)者，以及組織特異性的調(diào)控和/或可誘導(dǎo)序列。表達(dá)載體的設(shè)計可取決于諸等因子，如，欲轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所欲的蛋白表達(dá)量及其類似者?？蓪⒃摫磉_(dá)載體引入宿主細(xì)胞以制備本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的范圍亦包括ー種宿主細(xì)胞，其含有上述核酸。實(shí)例包括大腸桿菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(如，使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、或哺乳動物細(xì)胞。參見，如，Goeddel, (1990)Gene Expression Techno丄ogy:Methods in Enzymology 185[塞因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法185], Academic Press, San Diego, CA。為制備本發(fā)明的多肽,可在容許本發(fā)明核酸所編碼的多肽表達(dá)的條件下，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，再由該經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化該多肽?；蛘?，可在試管中轉(zhuǎn)錄及翻譯本發(fā)明的核酸，例如，使用17啟動子調(diào)控序列及17聚合酶。本文還描述ー種方法，使用含有本文所述的3 -葡萄糖苷酶及其它纖維素水解酶(諸如，外切葡聚糖酶及內(nèi)切葡聚糖酶)的多酶組合物，將木質(zhì)纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為可發(fā)酵產(chǎn)物(如，可發(fā)酵糖)。參見，如，美國專利申請案第20070238155及20070250961號。術(shù)語「纖維素水解酶」是指可將纖維素(ー種由葡萄糖單元構(gòu)成的多糖)水解成為較小糖類單元的酶。參見 Gilbert H J, Hazlewood G P, 1993J Gen Microbiol 139:187-194 ;01imiya Ket al. 1997Biotechnol Genet Eng Rev. 14:365-414。亦參見美國專利申請案第2007016805號。此種多酶組合物可取自，微生物、植物或其組合，且其含有可降解木質(zhì)纖維素物質(zhì)的酶。除上述纖維素水解酶外，其可進(jìn)ー步包括纖維ニ糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、￠-葡萄糖苷酶)、半纖維素酶(諸如，木聚糖酶，包括，內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶、及3 -木糖苷酶)、木質(zhì)素酶、淀粉酶、a-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-葡糖苷酸酶、阿拉伯糖酶、葡糖苷酸酶、蛋白酶、酯酶(包括阿魏酸酯酶及こ酰基木聚糖酯酶)、脂肪酶、葡甘聚糖酶或木葡聚糖酶。在本文中，術(shù)語「木質(zhì)纖維素物質(zhì)」指含有纖維素和/或半纖維素的物質(zhì)。一般而言，該些物質(zhì)亦含有木聚糖、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及碳水化合物，諸如，淀粉及糖類。木質(zhì)纖維素可見于，例如，植物的莖、葉、殼、皮及穗軸，或是樹木的葉、枝及木材。將復(fù)雜碳水化合物(諸如，淀粉、纖維素或半纖維素)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的過程在本文中稱為「糖化作用」?？砂l(fā)酵糖在本文中是指簡單糖類，諸如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖或纖維ニ糖。木質(zhì)纖維素材料可包括原始植物生質(zhì)和/或非原始植物生質(zhì),諸如,農(nóng)業(yè)生質(zhì)、商業(yè)有機(jī)物、營造及拆除廢棄物、城市固體廢棄物、廢紙、及庭院廢棄物。木質(zhì)纖維素物質(zhì)的常見形式包括樹木、灌木及草、小麥、麥桿、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米粒(包括取自玉米粒的纖維)、谷物(諸如，玉米、稻米、小麥及大麥)碾磨的產(chǎn)品及副產(chǎn)品(包括濕磨及干磨)、以及城市固體廢棄物、廢紙、及庭院廢棄物。木質(zhì)纖維素物質(zhì)亦可為,但不限于,草本材料、農(nóng)業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物、及造紙廠廢材?！皋r(nóng)業(yè)生質(zhì)」包括枝條、灌木、甘蔗、玉米及玉米皮、能源作物、森林、水果、花、谷粒、草、草本作物、葉、樹皮、針狀葉、圓木材、根、樹苗、短輪伐期木質(zhì)作物、灌木、柳枝稷、樹木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麥粉頭、燕麥殼、硬及軟木(不包括具有害物質(zhì)的木材)、由農(nóng)業(yè)流程產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物質(zhì)(包括 農(nóng)耕及林業(yè)活動，特別包括林業(yè)廢木)，或其混合物。在上述方法中所制備的可發(fā)酵糖可經(jīng)由酶處理或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成為具附加價值的有用發(fā)酵產(chǎn)物。該發(fā)酵產(chǎn)物的實(shí)例包括，但不限于，氨基酸、維生素、藥物、動物飼料添加劑、特殊化學(xué)品、化學(xué)原料、塑料、溶劑、燃料、或其它有機(jī)聚合物、乳酸、及こ醇，包括燃料こ醇。可由本發(fā)明方法制備的特定具附加價值的發(fā)酵產(chǎn)物包括，但不限于，生物燃料(包括こ醇及丁醇)；乳酸；塑料；特殊化學(xué)品；有機(jī)酸，包括檸檬酸、琥珀酸、及馬來酸；溶劑；動物飼料添加物；藥物；維生素；氨基酸，諸如，離氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、羥丁氨酸及天冬氨酸；化學(xué)原料?？砂l(fā)酵糖亦可用于培養(yǎng)微生物，其可產(chǎn)制發(fā)酵產(chǎn)物，如，エ業(yè)用酶，諸如，蛋白酶、纖維酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳酸酶、脂肪酶、裂解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶及木聚糖酶。本發(fā)明亦提供一種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生能量的方法。本方法包括提供上述的多酶組合物；使該組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸，以產(chǎn)生可發(fā)酵產(chǎn)物；發(fā)酵該可發(fā)酵產(chǎn)物，以產(chǎn)生可燃性發(fā)酵產(chǎn)物，再燃燒該可燃性發(fā)酵產(chǎn)物以產(chǎn)生能量。本方法可在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，該生物反應(yīng)器含有所有必需的組分，且較佳可受配置以進(jìn)行微生物的厭氧生長。制造及使用生物反應(yīng)器的方法為本領(lǐng)域中已知。參見，如美國專利申請案第20080131958號。上述的多肽及組合物亦可用于紙業(yè)及木漿業(yè)。舉例而言，該多肽，其具有β -葡萄糖苷酶活性，可用于回收紙的脫墨及精制。在此應(yīng)用中，其使用可大量降低每噸紙所需用的酶量，并降低欲増加該紙亮度所需的與該酶接觸的時間。在精制過程中降低酶濃度及與酶的接觸時間可相應(yīng)且如所欲般降低纖維素酶對于纖維本身的反應(yīng)時間以及處理成本。本發(fā)明的多肽具有其它エ業(yè)應(yīng)用。由于其具有高β_葡萄糖苷酶活性，此種多肽可以較低的量作用。該多肽，結(jié)合其它酶，可用于以較高產(chǎn)率而由水果提取果汁，或是由植物提取果汁或湯品的調(diào)味料。在結(jié)合蛋白酶的情形下，其可用于分解干燥的海草，其接著可以醇進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生醋。該多肽，混合其它酶，亦可在烘焙業(yè)中作為面團(tuán)調(diào)整劑。參見，如美國專利第6602700號。同時，本發(fā)明的多肽亦可用于紡織業(yè)。其可借著除去會造成布料外觀暗沉的表面微纖維而用于增亮及軟化棉布。更特定言之，其可用于在制造具有「石洗」效果的牛仔褲時取代浮石。相較于長時間接觸浮石，酶處理可對牛仔布料造成較少的損害。參見美國專利第 5232851、5677151、6451063 及 7226773 號。在另一方面，本發(fā)明提供ー種轉(zhuǎn)基因植物，其基因組經(jīng)由以可操作方式連接啟動子序列的編碼本發(fā)明多肽的重組多核苷酸增強(qiáng)。該多核苷酸經(jīng)優(yōu)化處理以在植物中表達(dá)，且該多肽是以大于5%總可溶性蛋白、大于10%總可溶性蛋白或大于20%總可溶性蛋白的量制備。該多肽可以組成型全身方式或組織特異的方式表達(dá)。舉例而言，其可在選自由莖及葉所構(gòu)成群的植物組織中表達(dá)。其亦可在靶向的亞細(xì)胞區(qū)室或胞器中表達(dá)，諸如，質(zhì)外體、葉綠體、細(xì)胞壁或液泡。該植物可為單子葉植物或雙子葉植物。在部分具體實(shí)例中，該植物是作物植物。該植物可選自由玉米、柳枝稷、高粱、芒草、甘蔗、白楊、松樹、小麥、稻米、大豆、棉花、大麥、草坪草、煙草、竹、油菜、甜菜、向日葵、柳樹及尤加利樹所構(gòu)成的群。制造轉(zhuǎn)基因植物的方法為本領(lǐng)域中所熟知。下述的特定實(shí)例僅被視為說明，且不以任何方式限制本掲示內(nèi)容的其它部分。在不需進(jìn)一步詳盡闡述的情形下，相信根據(jù)本文的敘述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將本發(fā)明利用至其最完整的程度。所有本文所引述的刊物因此以其全文并入本文作為參考。同時，下文所提議的任何機(jī)制并不已任何方式限制所請發(fā)明的范圍。I.材料及方法 I.原牛D2直菌菌株的培育以MR(Mendels-Reese)培養(yǎng)基(pH 5. 0)培養(yǎng)原生真菌菌株(亦即，刺孢殼葉斑菌D2)，以收集真菌細(xì)胞進(jìn)行DNA/RNA提取，并收集粗制酶以進(jìn)行特性分析(如，氨基酸序列、纖維素活性及酶濃度)。每I升的MR培養(yǎng)基含有化大豆蛋白胨、1.4§(順4)2504、0.3§尿素、2. Og KH2P04、0.34g CaCl2、0. 3g MgSO4 7H20、5. Omg FeSO4 7H20、I. 6mg MnSO4 7H20、
I.4mgZnS04 *7H20,2mg CoCl2 *6H20 及 0. 72g 纖維ニ糖。在 30°C 的溫度以及 125rpm 的混合速率下，使真菌培養(yǎng)物生長4天，接著再收集真菌細(xì)胞及其粗制酶。2.核酸提取及粗制酶的收集使用Wizard :基因組DNA純化試劑盒(Promega, USA)提取C. raphigeraD2真菌的基因組DNA，并使用植物總RNA微量制備純化試劑盒(GeneMark，Taiwan)提取真菌RNA。以分光光譜儀(NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific, USA)測量所提取核酸的濃度。在進(jìn)行進(jìn)ー步的處理前(如，PCR及RT PCR)，將該些DNA及RNA提取物貯存在_20°C下。使4天真菌培養(yǎng)物的上清液，過濾通過Whatman No. I濾紙(Whatman/GEHealthcare, USA),接著再過濾通過0. 45 ii m Supoiメ''膜盤狀過濾器(PALL, USA),再過濾通過 30K NMWL(Nominal Molecular Weight Limit) AmicoR Ultra-15 離心過濾器(Millipore，USA)，收集粗制酶。根據(jù)Bio-Rad蛋白分析，使用BSA (牛血清白蛋白)作為校正標(biāo)準(zhǔn)物(Bio-Rad，USA)，測定酶濃度。將過濾的酶貯存在4°C下，直到進(jìn)行進(jìn)一歩的分析。
3.酶電泳及N-端測序根據(jù)Hoefer，s Protein Electrophoresis Applications Guide [Hoefer 蛋白電泳應(yīng)用指南](Hoefer Scientific Instruments, 1994)所建議的操作流程,進(jìn)行包括非變性PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)及SDS (十二烷基硫酸鈉)PAGE的酶電泳。在對非變性PAGE進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色前，將凝膠浸在0. 5mM MUG (4-甲基傘形酮-D-吡喃葡糖苷)溶液中，并在50°C下共置15分鐘，接著在UV燈下觀察，以進(jìn)行酶譜分析(Benoit et al.，1995，CurrMicrobiol30:305-312)。此外，亦使用 PlusOne 銀染試劑盒(GE Healthcare, USA)進(jìn)行銀染而非使用SDS-PAGE的考馬斯藍(lán)染色，以觀察具有部分低濃度的酶。就N-端序列分析而言，使目標(biāo)酶(亦即，具有MUG活性的BGL)自SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜(iBlot Gel Transfer Stacks, Invitrogen, USA),再根據(jù) Edman 降解化學(xué)，以Applied Biosystems Procise 蛋白測序儀 494 型(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行分析。使用所掲示N-端序列的一部分，P⑶GDWA(SEQ ID N0:9)，設(shè)計簡并引物D2_bgl_NT:CCN GGNGAY GGNGAY TGG GC(SEQ ID NO: 10)，以由基因組DNA和/或逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，進(jìn)ー步擴(kuò)增目標(biāo)bgl基因。4. D2~bRl基因的克隆及測序首先使用聚-T引物GGT TCT TGC CAC AGT CAC GAC TTT TTT TTTTTT TTT TTT (SEQID NO: 11)及SuperScTiptx III 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, USA),由 RNA 樣本逆轉(zhuǎn)錄(RT)出bgl-Cr-D2cDNA ;再接著使用 D2-bgl-NT 及聚-T 錨引物GGT TCT TGC CAC AGT CAC GAC (SEQID NO: 12)的引物組以及DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq , TaKaRa Bio Inc, Japan)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的熱循環(huán)條件為94°C 4分鐘，接著為30循環(huán)的94°C I分鐘、58°C 30秒、及72°C 3分鐘，接著進(jìn)行72°C 5分鐘的終延伸步驟。將RT-PCR產(chǎn)物(亦即，bgl_Cr_D2cDNA擴(kuò)增物)克隆于pGEM -T Easy Vector中(Promega, USA),再轉(zhuǎn)移進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞(DH5 α菌株)，以進(jìn)行保存及進(jìn)ー步的測序。除此之外，亦使用D2-bgl-f:CCT GGT GAT GGT GAT TGG GCAGC (SEQ ID NO:13)及 D2_bgl_r:ATG TCC ACC TTT CCG AAT ACC TTG GC(SEQ ID NO:14)的引物組以及TaKaRa Ex Taq ，由基因組DNA樣本擴(kuò)增bgl_Cr_D2基因(含有內(nèi)含子)。亦將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆于pGEVl*-T Easy Vector中進(jìn)行測序。比較bgl-Cr_D2cDNA (無內(nèi)含
子)及bgl-Cr-D2基因組DNA (具內(nèi)含子)的序列以判定內(nèi)含子部分。此外，亦以SacI 限制酶(NEB, New England Biolabs Inc.，USA)對基因組DNA進(jìn)行酶切消化，再以T4DNA接合酶進(jìn)行自體連接，以揭露bgl-Cr-D2基因上游的信號序列；接著，再以D2-bgl233f :CGT TTC GTC CAA MT GTAACA GCA T(SEQ ID NO: 15)及D2_bgl232r:GATGCT TTC ACC GTC AGT TCT GA (SEQ ID NO: 16)的引物組進(jìn)行反向PCR。該P(yáng)CR的程序如下950C 5分鐘，接著為25循環(huán)的95°C I分鐘、55°C I分鐘、及72°C 6分鐘，接著進(jìn)行72°C 10分鐘的終循環(huán)。將該反向PCR產(chǎn)物(應(yīng)含有如下順序的序列D2-bgl233f+部分D2-bgl+SacI+部分D2基因組+D2-bgl的信號序列+部分D2-bgl+D2-bgl232r)克隆于pGEMK -T Easy Vector中以進(jìn)行進(jìn)ー步的測序。使用Clustal X 軟件(Thompson et al. , 1997, Nucleic Acids Research25 (24) :4876-4882)，使由所掲示的bgl_Cr_D2cDNA取得的BGL_Cr_D2推定氨基酸序列與其它GH3家族的BGLs進(jìn)行比對，以分析種系發(fā)生關(guān)系。使用該比對結(jié)果建立種系發(fā)生樹，以TreeView 圖不(Page, 1996, Computer Applications in the Biosciences 12:357-358)。5.在巴其斤德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)在pGAPZ a C 載體中進(jìn)一步構(gòu)建 bgl_Cr_D2cDNA (克隆于pGEM'K·,-TEasy Vector
中)，以在畢赤酵母中(Invitrogen, USA)進(jìn)行重組BGL-Cr-D2_Pp的組成型表達(dá)。簡言之，以 D2-bgl-f-EcoRI CGC TTG AAT TCG ATG CCTGGT GAT GGT GAT TGG(SEQ ID NO: 17)及D2-bgl-r-NotI:TTC AAG CGGCCG CAT GTC CAC CTT TCC GAA TAC C (SEQ ID NO: 18)的引物組，進(jìn)行 Easy vector 中 bgl-Cr-DhDNA 的 PCR 擴(kuò)增。以 EcoRI 及 NotI (NEB, USA)進(jìn)行擴(kuò)增子及載體的雙重酶切消化，再以T4DNA接合酶進(jìn)行連接，將此PCR產(chǎn)物連接至pGAPZ a C載體中。將所構(gòu)建的帶有bgl-Cr-D2cDNA的pGAPZ a C載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌(DH5a菌株)中保存。在后續(xù)轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母宿主之前，先以質(zhì)粒微量制備純化試劑盒(GeneMark, Taiwan)純化具有 D2_bglcDNA 的 pGAPZ a C 載體，并以 BspHI (NEB, USA)線性化。根據(jù)畢赤酵母表達(dá)試劑盒(InVitr0gen，USA)的操作流程，經(jīng)由同源重組，將該線性質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入巴斯德畢赤酵母(GS115及SMD1168菌株)中。在YPDzetjeinicici培養(yǎng)基及Invitrogen操作流程中所建議的條件下，培養(yǎng)該重構(gòu)的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。在不同時點(diǎn)(0-14天)收集畢赤酵母細(xì)胞及其酶，以評估其生長及酶的活性/量。6.活件試駘 使用不同的底物(對硝基苯基P-D-葡萄糖苷，pNPG ;纖維ニ糖；羧甲基纖維素，CMC ;木聚糖；微晶纖維素；及，濾紙)，試驗(yàn)取自天然D2菌株的粗制酶及取自巴斯德畢赤酵母的重組酶的纖維素水解活性。根據(jù)由2mMpNPG在55°C、于5分鐘內(nèi)的pNP釋出率，測量該些酶的pNPG酶活性。pNP濃度是根據(jù)OD4tl5的分光光度吸收值而校正。纖維ニ糖活性是由纖維ニ糖還原率和/或葡萄糖生產(chǎn)率而評估，其中纖維ニ糖及葡萄糖的濃度是由HPLC (高效液相層析)分析而測定。此外，亦根據(jù)DNS (ニ硝基水楊酸)法所檢測的還原糖生產(chǎn)率，測量CMC酶(針對其內(nèi)切葡聚糖酶活性)、木聚糖酶(針對其木糖水解活性)、微晶纖維素酶(針對其外切葡聚糖酶活性)及FP酶(代表總纖維素酶活性)。II.結(jié)果在本發(fā)明中，根據(jù)使用pNPG (對硝基苯基-0 -D-葡萄糖苷)及纖維ニ糖作為底物進(jìn)行的評估，其首先發(fā)現(xiàn)臺灣原生種真菌刺孢殼葉斑菌D2菌種可分泌具有顯著3 -葡萄糖苷酶活性的粗制酶。自基因組DNA及逆轉(zhuǎn)錄的cDNA中衍生編碼該目標(biāo)￠-葡萄糖苷酶(BGL-Cr-D2)的基因(bgl_Cr_D2)。其顯示，bgl-Cr_D2cDNA具有2166bps的大小(不包括信號序列及終止密碼子)，而bgl-Cr-D2基因組DNA則具有2851bps的大小(圖1&2)。在比較bgl-Cr-D2基因組DNA及cDNA后，鑒定出12個內(nèi)含子。該bgl_Cr_D2基因可編碼722個氨基酸基礎(chǔ)以形成BGL-Cr-D2 (圖2)。根據(jù)衍生自糖苷水解酶(GH)家族3的P -葡萄糖苷酶的氨基酸序列比較，該新發(fā)現(xiàn)的BGL_Cr_D2與柄籃狀菌(Talaromyces stipitatua)(65%相似性)及土曲霉(Aspergillus terreus) (64%相似性)的P-D-葡萄糖苷葡糖水解酶同源(圖3)。根據(jù)種系發(fā)生分析，發(fā)現(xiàn)C.raphigena D2、柄籃狀菌及柄籃狀菌形成ー亞群，其可與其它真菌及細(xì)菌組群(如，青霉屬(Penicillium)、覆膜酵母屬(Saccharomycopsis)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)及大腸桿菌(Escherichia coli))區(qū)分。將該bgl-Cr_D2基因進(jìn)ー步克隆至pGAPZ a C載體中(圖4)，并使用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) SMD1168菌株作為宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化至酵母菌表達(dá)系統(tǒng)。在比較帶有bgl-Cr-D2的巴斯德畢赤酵母SMDl 168菌株的生長及pNPG酶活性時，僅在克隆bgl_Cr_D2的菌落中觀察到顯著的pNPG酶活性，而兩種菌落的生長曲線則為相似(圖5)。在30°C下培養(yǎng)4-6天后，其生長及活性到達(dá)穩(wěn)定量。同吋，該重組￠-葡萄糖苷酶(BGL-Cr-D2-Pp)具有約95kDa的分子量(圖6C)(因翻譯后糖基化作用而大于79kDa的理論大小);且根據(jù)糖基化率(表I)及非變性PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)(圖6A)/MUG (4-甲基傘形酮-D-批喃葡糖苷)酶譜分析(圖6B)的觀察結(jié)果，其顯示具有高特異活性。在廣泛的pH范圍下(亦即，pH4-pH9)放置20小時后，重組BGL_Cr-D2_Pp仍具有活性(圖7)。然而，此酶的pNPG酶活性在高于5. 5的pH值下會顯著降低。此外，BGL-Cr-D2-Pp在75°C的溫度下具有最高的pNPG酶活性；但在此高溫下，其活性在短期(亦即，2小吋)的放置后會大量下降(圖8&9)。因此，在pH 5及55°C的溫度下，使重組BGL-Cr-D2-Pp進(jìn)行10分鐘的pNPG酶活性測量。表I.由巴斯德畢赤酵母分泌的原酶BGL_Cr_D2、由巴斯德畢赤酵母分泌的重組酶BGL-Cr-D2-Pp及Novozyme-188對于不同底物的酶活性比較(所有反應(yīng)皆在pH5及55°C下
進(jìn)行)。
權(quán)利要求
1.一種分離多肽，其包含與SEQ ID NO: I具有至少70%同一性的序列，其中該多肽具有 葡萄糖苷酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的分離多肽，其中該序列與SEQID NO: I具有至少80%同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離多肽，其中該序列與SEQID NO: I具有至少90%同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離多肽，其中該序列與SEQID NO: I具有至少95%同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的分離多肽，其中該序列與SEQID NO: I具有至少99%同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的分離多肽，其中該多肽包括SEQID NO: I的序列。
7.一種分離核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求I的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的核酸，其中該核酸包含SEQID NO:2、3、5或6的序列。
9.一種表達(dá)載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求7的核酸。
10.一種宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求7的核酸。
11.一種制備多肽的方法，包括 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有一核酸，編碼根據(jù)權(quán)利要求I的多肽，其培養(yǎng)條件為容許該核酸所編碼的多肽表達(dá)，以及 由該經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化該多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該多肽具有與SEQID NO: I具90%同一性的序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該多肽具有與SEQID NO: I具95%同一性的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該多肽具有SEQID NO: I的序列。
15.—種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I的多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中該組合物還包含外切葡聚糖酶及內(nèi)切葡聚糖酶。
17.一種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)制備可發(fā)酵糖的方法，包括 提供根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，以及 使該組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以制備可發(fā)酵糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中該可發(fā)酵糖選自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖及纖維二糖所構(gòu)成的群。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中該多肽具有SEQID NO: I的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中該木質(zhì)纖維素物質(zhì)系選自由纖維素質(zhì)動物糞便、城市固體廢棄物、廢紙、庭院廢棄物、農(nóng)業(yè)廢棄物及林業(yè)廢棄物所構(gòu)成的群。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其進(jìn)一步包含將該可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成為發(fā)酵產(chǎn)物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中該轉(zhuǎn)化步驟是由微生物發(fā)酵或酶處理而進(jìn)行。
23.一種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生能量的方法，包括 提供根據(jù)權(quán)利要求15的組合物； 使該組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以制備可發(fā)酵糖； 轉(zhuǎn)化該可發(fā)酵糖以產(chǎn)生可燃性的發(fā)酵產(chǎn)物，及 燃燒該可燃性發(fā)酵產(chǎn)物以產(chǎn)生能量。
24.一種生物反應(yīng)器，其含有木質(zhì)纖維素物質(zhì)以及根據(jù)權(quán)利要求15的組合物。
全文摘要
本發(fā)明揭示一種新穎的β-葡萄糖苷酶以及編碼該β-葡萄糖苷酶的核酸。本發(fā)明亦揭示關(guān)于使用該β-葡萄糖苷酶以將木質(zhì)纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為可發(fā)酵糖的細(xì)胞、組合物及方法。
文檔編號C12P19/12GK102858969SQ201180007605
公開日2013年1月2日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者余淑美, 賀端華, 郭獻(xiàn)文, 吳意珣, 李振維, 朱宇敏 申請人:中央研究院