專利名稱：基于噬菌體抗性選擇的用于對(duì)食品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)化的乳酸細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有提高的噬菌體抗性的細(xì)菌細(xì)胞、包含所述細(xì)胞的起子培養(yǎng)物以及用所述起子培養(yǎng)物發(fā)酵的乳制品。
背景技術(shù)：
食品工業(yè)使用多種細(xì)菌、特別是乳酸細(xì)菌來(lái)改進(jìn)食品的味道和質(zhì)構(gòu)，以及延長(zhǎng)這些食品的保存期。在乳品工業(yè)的情況下，廣泛使用乳酸細(xì)菌來(lái)實(shí)現(xiàn)乳的酸化(通過(guò)發(fā)酵)，以及對(duì)其所摻入的產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)化。在食品工業(yè)使用的乳酸細(xì)菌中，可以提到鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。廣泛地單獨(dú)使用或與其它細(xì)菌組合使 用乳酸菌物種嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)來(lái)生產(chǎn)食品，特別是發(fā)酵產(chǎn)品。它們尤其在用于發(fā)酵乳(例如酸奶)生產(chǎn)中的酵素配制中使用。這些乳酸細(xì)菌中的某些在發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)的發(fā)展中起主要作用。這一特征與多糖的生產(chǎn)息息相關(guān)。在嗜熱鏈球菌菌株中，可以區(qū)分質(zhì)構(gòu)化與非質(zhì)構(gòu)化菌株。W02007095958A1公開(kāi)了具有質(zhì)構(gòu)化性質(zhì)的嗜熱鏈球菌菌株。圖I中，可以看到質(zhì)構(gòu)化程度最高的菌株CHCC8833(DSM17876)具有約59Pa的剪切應(yīng)力值。為了滿足行業(yè)要求，提供乳酸細(xì)菌，特別是嗜熱鏈球菌的新穎質(zhì)構(gòu)化菌株以便對(duì)食品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)化已經(jīng)變得必要。特別需要一種嗜熱鏈球菌的新穎質(zhì)構(gòu)化菌株，其可與乳桿菌屬的菌株一起使用。行業(yè)的另一個(gè)需求是菌株對(duì)食品工業(yè)中通常發(fā)現(xiàn)的噬菌體具有抗性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人已經(jīng)提供了一組新穎的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)的乳酸細(xì)菌,該組新穎的乳酸細(xì)菌對(duì)曬菌體攻擊的抗性高于其所來(lái)源的(母)菌株。此外，已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用細(xì)菌對(duì)乳進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，這一組細(xì)菌所產(chǎn)生的剪切應(yīng)力和/或凝膠硬度要高于母菌株。令人吃驚的是，抗噬菌體突變株比母菌株產(chǎn)生更多的質(zhì)構(gòu)，例如更高的剪切應(yīng)力和/或凝膠硬度(當(dāng)所述菌株用于對(duì)乳進(jìn)行發(fā)酵時(shí))，且特別令人吃驚的是，在galK基因中(還)含有突變(相對(duì)于野生型菌株)的菌株的抗噬菌體突變株比母菌株產(chǎn)生更多的質(zhì)構(gòu)(當(dāng)所述菌株用于對(duì)乳進(jìn)行發(fā)酵時(shí))。根據(jù)以上驚人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種通過(guò)篩選母菌株的抗噬菌體突變株來(lái)制造質(zhì)構(gòu)化乳酸細(xì)菌菌株的方法，例如制造質(zhì)構(gòu)化乳酸細(xì)菌(例如，除了具有例如噬菌體抗性、實(shí)質(zhì)性噬菌體抗性和/或與母菌株相比具有提高的噬菌體抗性以外，質(zhì)構(gòu)化程度也高于母菌株的細(xì)菌)的方法，所述方法包括以下步驟a)提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；和
b)分離母菌株的突變株，所述突變株比母菌株耐受更多的噬菌體(例如更多的噬菌體類型或更多的噬菌體菌株)。此外，本發(fā)明涉及質(zhì)構(gòu)化乳酸細(xì)菌菌株，例如嗜熱鏈球菌菌株或保加利亞乳桿菌菌株，這些菌株經(jīng)過(guò)改造從而比母菌株耐受更多的噬菌體，特別是噬菌體CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPCl 152 的其中ー種。


圖I描繪用StressTech流變儀測(cè)量的半乳糖陽(yáng)性菌株CHCC11342和半乳糖陽(yáng)性的抗噬菌體突變株CHCCl 1977的剪切應(yīng)力。剪切應(yīng)カ是在37°C在乳中生長(zhǎng)過(guò)夜后在凝固乳中測(cè)量的。圖2描繪用StressTech流變儀測(cè)量的CHCC10019的抗噬菌體突變株的剪切應(yīng)力。剪切應(yīng)カ是在37°C在乳中生長(zhǎng)過(guò)夜后在凝固乳中測(cè)量的。 圖3描繪用StressTech流變儀測(cè)量的CHCC12339 (CHCC9204的抗噬菌體突變株)的凝膠硬度。凝膠硬度是在37°C在乳中生長(zhǎng)過(guò)夜后在凝固乳中測(cè)量的。圖4描繪用StressTech流變儀測(cè)量的CHCC13140 (CHCC5086的抗噬菌體突變株)的剪切應(yīng)力。剪切應(yīng)カ是在37°C在乳中生長(zhǎng)過(guò)夜后在凝固乳中測(cè)量的。
具體實(shí)施例方式在第一方面，本發(fā)明涉及一種制造乳酸細(xì)菌(其具有例如噬菌體抗性、實(shí)質(zhì)性噬菌體抗性和/或與母菌株相比具有提高的噬菌體抗性，或當(dāng)使用細(xì)菌對(duì)乳進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，所產(chǎn)生的剪切應(yīng)カ和/或凝膠硬度高于母菌株)的方法，其包括以下步驟a)提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；和b)分離母菌株的突變株，所述突變株比母菌株耐受更多的噬菌體(例如更多的噬菌體類型或更多的噬菌體菌株)，和/或所述突變株針對(duì)母菌株無(wú)抗性的噬菌體具有抗性(在相同條件下)。在一個(gè)引人關(guān)注的方面，本發(fā)明涉及一種制造乳酸細(xì)菌(其具有例如噬菌體抗性、實(shí)質(zhì)性噬菌體抗性和/或與母菌株相比具有提高的噬菌體抗性，和/或當(dāng)使用細(xì)菌對(duì)乳進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，所產(chǎn)生的剪切應(yīng)カ和/或凝膠硬度高于母菌株)的方法，其包括以下步驟a)提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；和al)使乳酸細(xì)菌菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPCl 152組成的群組的噬菌體；以及b)分離母菌株的突變株，所述突變株對(duì)噬菌體具有抗性(或所述菌株沒(méi)有被噬菌體溶解)。另外，本發(fā)明涉及ー種方法，其包括以下步驟a)提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；al)使乳酸細(xì)菌菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPCl 152 組成的群組的噬菌體；a2)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育經(jīng)過(guò)暴露的細(xì)菌細(xì)胞；和b)分離母菌株的突變株，所述突變株沒(méi)有被噬菌體溶解。
本發(fā)明的方法可以包括步驟c)例如在步驟al)之前、期間或之后，使母菌株發(fā)生突變(例如通過(guò)化學(xué)處理或輻射處理，或借助于基因工程技術(shù))。本發(fā)明的任何方法還可以包括步驟d)例如在步驟c)之前、期間或之后，或在步驟al)之前、期間或之后，在菌株的galK基因或galK調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子)中引入突變(例如通過(guò)化學(xué)處理或輻射處理，或借助于基因工程技木)。在一個(gè)引人關(guān)注的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟-提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；-使母菌株發(fā)生突變(例如通過(guò)化學(xué)處理或輻射處理，或借助于基因工程技術(shù))； -使獲得的乳酸細(xì)菌菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由 CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPCl 152 組成的群組的噬菌體；-在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育經(jīng)過(guò)暴露的細(xì)菌細(xì)胞；和-分離母菌株的突變株，所述突變株沒(méi)有被噬菌體溶解。本發(fā)明的方法可以導(dǎo)致在galK基因的啟動(dòng)子區(qū)域中，例如在-10區(qū)域(Pribnow盒)中或在Pribnow盒與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域中引入突變。此外，本發(fā)明的方法也可以導(dǎo)致與母菌株相比，半乳糖發(fā)酵活性提高的突變。所述突變可導(dǎo)致galK基因的Pribnow盒與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域中的ー個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，例如野生型Pribnow盒下游的序列TTCAGT中的C被選自由A、T和G組成的群組的核苷酸取代。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述突變可導(dǎo)致-galK基因的Pribnow盒與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，例如野生型Pribnow盒下游的序列TTCAGT (SEQ ID NO 6)中的C被選自由A、T和G組成的群組的核苷酸取代；和/或-野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQID NO 7)中的C和G中的ー個(gè)或兩個(gè)被獨(dú)立選自由A和T組成的群組的核苷酸取代；和/或-野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQID NO 7)中的C被獨(dú)立選自由A和T組成的群組的核苷酸取代；和/或-野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQID NO 7)中的C被T取代；和/或—10 區(qū)域具有核苷酸序列 TATGAT(SEQ ID NO : 8)、TATTAT (SEQ ID NO :9)或TACTAT(SEQ ID NO 10)。應(yīng)了解本發(fā)明的方法中所用的母菌株可以是gal+菌株，優(yōu)選在37°C在含有2%半乳糖(半乳糖是作為唯一的碳水化合物加入)的M17中孵育16小時(shí)之后能夠使pH值降低至少I. 0的菌株，所述菌株是以每毫升培養(yǎng)基至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。所述菌株的實(shí)例是以下菌株，其中-galK基因的Pribnow盒與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域中的ー個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)被取代，例如野生型Pribnow盒下游的序列TTCAGT (SEQ ID NO 6)中的C被選自由A、T和G組成的群組的核苷酸取代；和/或-野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQID NO 7)中的C和G中的一個(gè)或兩個(gè)已經(jīng)被獨(dú)立選自由A和T組成的群組的核苷酸取代；和/或-野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQID NO 7)中的C已經(jīng)被獨(dú)立選自由A和T組成的群組的核苷酸取代；和/或-野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQID NO 7)中的C已經(jīng)被T取代；和/或—10 區(qū)域具有核苷酸序列 TATGAT(SEQ ID NO :8)、TATTAT(SEQ ID NO :9)或TACTAT(SEQ ID N0:10)。新穎的gal+菌株是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的方法可以包括一個(gè)或多個(gè)其它步 驟，所述其它步驟選自由以下各項(xiàng)組成的群組Cl)篩選具有噬菌體抗性的突變株，例如與母菌株相比提高的噬菌體抗性；和c2)篩選具有Gal+表型的突變株，例如與母菌株相比提高的半乳糖降解活性。本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種制造乳酸細(xì)菌的方法，其包括以下步驟-提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；-任選地突變母菌株；-使任選突變的母菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPCl 152 組成的群組的噬菌體；-任選地在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育經(jīng)過(guò)暴露的細(xì)菌細(xì)胞；和-篩選具有噬菌體抗性的突變株，例如與母菌株相比提高的噬菌體抗性；和/或篩選具有Gal+表型的突變株，例如與母菌株相比提高的半乳糖降解活性。通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的突變株可以是自發(fā)突變株、通過(guò)利用例如化學(xué)處理或輻射處理對(duì)母菌株進(jìn)行誘變而獲得的突變株、或借助于基因工程技術(shù)獲得的突變株。本發(fā)明的一個(gè)引人關(guān)注的突變株是CHCC6008的突變株，特別是gal+和對(duì)CHCPl 152具有抗性的突變株。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，突變株具有噬菌體抗性、實(shí)質(zhì)性噬菌體抗性和/或與母菌株相比具有提高的噬菌體抗性，其中所述噬菌體選自由以下各項(xiàng)組成的群組能夠溶解母菌株的噬菌體、CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPC1152。目前優(yōu)選的是，細(xì)菌(母菌株)選自由以下各項(xiàng)組成的群組的種乳球菌屬(Lactococcus spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)(例如嗜熱鏈球菌)、乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp.)、偽明串珠菌屬(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌屬(Pediococcus spp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium spp.)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)。在本發(fā)明方法的一個(gè)引人關(guān)注的實(shí)施方案中，細(xì)菌(母菌株)選自具有選自由以下各項(xiàng)組成的群組的一個(gè)或多個(gè)特征的菌株對(duì)乳進(jìn)行質(zhì)構(gòu)化的能力，產(chǎn)生多糖(例如胞外多糖或莢膜多糖)的能力，當(dāng)在乳中孵育時(shí)產(chǎn)生粘度的能力，以及當(dāng)在乳中孵育時(shí)增加剪切應(yīng)力的能力。在另一方面，本發(fā)明涉及一種通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得的乳酸細(xì)菌或菌株。在另一方面，本發(fā)明涉及一種乳酸細(xì)菌或菌株，例如通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得的細(xì)菌或菌株，其在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約70Pa(帕斯卡)(例如大于73Pa、大于77Pa或大于79Pa或大于80Pa)的粘度，所述粘度是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后作為剪切應(yīng)力測(cè)量的，所述乳酸細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。相信可以獲得在發(fā)酵乳中產(chǎn)生高達(dá)lOOPa、高達(dá)120Pa、高達(dá)150Pa或甚至高達(dá)200Pa的粘度的菌株?？色@得的粘度的范圍的實(shí)例是70到200Pa、75到150Pa、78到120Pa、79到IOOPa和80到90Pa。特別地，本發(fā)明涉及ー種嗜熱鏈球菌菌株，其能夠在發(fā)酵乳中產(chǎn)生79到IOOPa的粘度。本發(fā)明的菌株的實(shí)例是屬于嗜熱鏈球菌的細(xì)菌菌株，其選自由以下各項(xiàng)組成的群組CHCC11342 (DSM 22932)、CHCCl 1977 (DSM22935)、CHCC12339 (DSM24090)和CHCC13140 (DSM 24023)，以及它們?nèi)惟`種的突變株和變異株。此外，本發(fā)明涉及本文提及的所有新穎菌株，以及它們的突變株和變異株。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及菌株CHCC11977和其突變株。在另一方面，本發(fā)明涉及一種本發(fā)明的乳酸細(xì)菌或菌株，其在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約70Pa (例如大于73Pa、大于77Pa或大于80Pa)的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)カ是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述乳酸細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。細(xì)菌或菌株可屬于嗜熱鏈球菌種或德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisuosp. bulgaricusノ。 本發(fā)明還涉及ー種屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種的細(xì)菌菌株，例如選自由CHCC12813(DSM24074)和CHCC12841以及它們的突變株和變異株組成的群組的菌株。引人關(guān)注的菌株是在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約60Pa(例如大于65Pa、大于69Pa或大于72Pa)的剪切應(yīng)カ的那些菌株，所述剪切應(yīng)カ是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。特別引人關(guān)注的是在發(fā)酵乳中產(chǎn)生從60到IOOPa(例如65到90Pa、69到85Pa或72到80Pa)范圍內(nèi)的剪切應(yīng)カ的那些菌株，所述剪切應(yīng)カ是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。在另一方面，本發(fā)明涉及一種本發(fā)明的乳酸細(xì)菌或菌株或突變株或變異株，其在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約IlOPa(例如大于115Pa、大于120Pa或大于125Pa)的凝膠硬度,所述凝膠硬度是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述乳酸細(xì)菌或菌株或突變株或變異株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。目前優(yōu)選的是凝膠硬度在110到200Pa的范圍內(nèi)，或更優(yōu)選在120到190Pa或125到180Pa的范圍內(nèi)。細(xì)菌或菌株可屬于嗜熱鏈球菌種或德氏乳桿菌保加利亞亞種。特別地，本發(fā)明涉及ー種嗜熱鏈球菌菌株，其能夠在發(fā)酵乳中產(chǎn)生125到175Pa的凝膠硬度。在一個(gè)引人關(guān)注的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及ー種乳酸細(xì)菌或菌株，其屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種。關(guān)于這個(gè)實(shí)施方案的引人關(guān)注的實(shí)例是在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約60Pa(例如大于65Pa、大于69Pa或大于72Pa)的粘度的細(xì)菌或菌株，所述粘度是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后作為剪切應(yīng)カ測(cè)量的，所述細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種，和/或在發(fā)酵乳中產(chǎn)生從60到IOOPa (例如65到90Pa、69到85Pa或72到80Pa)范圍內(nèi)的粘度的細(xì)菌或菌株，所述粘度是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后作為剪切應(yīng)カ測(cè)量的，所述細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。在另一方面，本發(fā)明涉及ー種包含本發(fā)明的乳酸細(xì)菌或菌株(例如屬于菌株CHCCl 1977或其突變株的細(xì)菌)的組合物。優(yōu)選的是所述組合物包含至少lOexplOCFU(細(xì)胞形成単位)的所述細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可包含呈混合物形式或組件試劑盒(kit-of-parts)形式的以下菌株-屬于乳桿菌屬的菌株，例如德氏乳桿菌保加利亞亞種(同義詞保加利亞乳桿菌)、約氏乳桿菌(L. johnsonii)或發(fā)酵乳桿菌(Lfermentum);和-本發(fā)明的乳酸細(xì)菌的菌株，例如屬于嗜熱鏈球菌的菌株，例如選自由CHCCl 1342 (DSM 22932)、CHCC11977 (DSM22935)、CHCC12339 和 CHCC13140 (DSM 24023)以及它們?nèi)我环N的突變株和變異株組成的群組的菌株，例如其中屬于乳桿菌屬的菌株是屬于產(chǎn)多糖(例如雜多糖、同多糖)和/或產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的乳桿菌屬的菌株的組合物。本發(fā)明的組合物可包含至少IOexplO CFU(細(xì)胞形成單位)屬于乳桿菌屬的菌株；和/或至少lOexplO CFU的屬于嗜熱鏈球菌的菌株。在一個(gè)引人關(guān)注的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少IOexplO CFU(細(xì)胞形 成單位)的屬于產(chǎn)多糖(例如同多糖)和/或產(chǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶的乳桿菌屬的菌株；和至少IOexplO CFU屬于嗜熱鏈球菌的菌株。組合物可用作起子培養(yǎng)物，且可采取冷凍、凍干或液體形式。在另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的方法，其包括用本發(fā)明的乳酸細(xì)菌、本發(fā)明的菌株或本發(fā)明的組合物對(duì)乳底物(例如牛奶)進(jìn)行發(fā)酵。這種方法可進(jìn)一步包括用屬于乳桿菌屬的菌株對(duì)乳底物進(jìn)行發(fā)酵，所述菌株例如保加利亞乳桿菌或發(fā)酵乳桿菌的菌株，例如選自由CHCC10019、CHCC10935或CHCC3984以及這些菌株中任一種的突變株和變異株組成的群組的菌株。舉例來(lái)說(shuō)，在用屬于乳桿菌屬的菌株發(fā)酵之前、期間或之后，用本發(fā)明的組合物、菌株或細(xì)菌(例如屬于嗜熱鏈球菌種的菌株)對(duì)乳底物進(jìn)行發(fā)酵，或者在用屬于產(chǎn)多糖乳桿菌的菌株發(fā)酵期間，用屬于嗜熱鏈球菌的菌株或細(xì)菌對(duì)乳底物進(jìn)行發(fā)酵。用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的本發(fā)明的方法可包括在發(fā)酵之前、期間和/或之后向乳底物中加入酶，例如選自由以下各項(xiàng)組成的群組的酶能交聯(lián)蛋白質(zhì)的酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶(chymosin)和粗制凝乳酶(rennet)。在另一方面，本發(fā)明涉及一種通過(guò)以上本發(fā)明的方法可獲得的乳制品，例如發(fā)酵乳制品(例如酸奶或白脫奶)或乳酪(例如新鮮乳酪或帕斯塔費(fèi)拉塔乳酪(pastafilata))。發(fā)酵乳制品可以是例如攪拌型產(chǎn)品、可飲用產(chǎn)品或靜置型(set-type)產(chǎn)品。本發(fā)明的乳制品可任選地包含選自由以下各項(xiàng)組成的群組的成分水果濃縮汁、糖漿、益生菌培養(yǎng)物、著色劑、增稠劑、調(diào)味劑和防腐劑。因此，本發(fā)明涉及一種通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得的發(fā)酵乳制品，其任選地包含選自由以下各項(xiàng)組成的群組的成分水果濃縮汁、糖漿、益生菌培養(yǎng)物、著色劑、增稠劑、調(diào)味劑和防腐劑；和/或其任選地采取攪拌型產(chǎn)品、靜置型產(chǎn)品或可飲用產(chǎn)品的形式。本發(fā)明還涉及一種乳制品，其可用本發(fā)明的乳酸細(xì)菌(例如屬于嗜熱鏈球菌的菌株，例如DSM 22884)和選自保加利亞乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的乳酸細(xì)菌(例如CHCC10019(DSM19252), CHCC3984 (DSM19251)和 CHCC2008 (DSM22584))對(duì)乳底物(例如牛奶)進(jìn)行發(fā)酵來(lái)制備。在一個(gè)引人關(guān)注的實(shí)施方案中，本發(fā)明的乳制品具有大于IOOPa(例如大于102Pa或大于104Pa)的粘度/質(zhì)構(gòu)，所述粘度/質(zhì)構(gòu)是例如在37°C在乳中生長(zhǎng)12小時(shí)后作為剪切應(yīng)カ測(cè)量的。在ー個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，大于IOOPa的粘度是通過(guò)単獨(dú)的細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)獲得，但更高的粘度值可通過(guò)加入例如淀粉、明膠、卡拉膠(carrageenan)等化合物來(lái)獲得。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的乳制品具有在100到200Pa范圍內(nèi)，例如在100到150Pa范圍內(nèi)或在105到125Pa范圍內(nèi)的粘度/質(zhì)構(gòu)，其是作為剪切應(yīng)カ測(cè)量的。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的乳制品是可飲用產(chǎn)品，例如飲用酸奶。本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明的方法中的新穎噬菌體，例如選自由以下各項(xiàng)組成的群組的噬菌體CHPC658(DSM 23961)、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPCl 152 (DSM 23994)以及它們的突變株和變異株，例如能夠溶解本文所提及的菌株(例如菌株CHCC6008)的突變株和變異株。此外，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的方法中可用作母菌株的新穎細(xì)菌菌株，例如選自由 CHCCl 1342 (DSM22932)、CHCC10019 (DSM19252)、CHCCl 1379 (DSM22884)、CHCCl 1976 (DSM 22934)和其突變株組成的群組的菌株。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“乳酸細(xì)菌”指示革蘭氏陽(yáng)性的微需氧或厭氧細(xì)菌，其發(fā)酵糖，同時(shí)產(chǎn)生酸，包括乳酸(作為主要產(chǎn)生的酸)、こ酸和丙酸。エ業(yè)上最有用的乳酸細(xì)菌屬干“乳桿菌”目，包括乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、偽明串珠菌屬、片球菌屬、短桿菌屬、腸球菌屬和丙酸桿菌屬。此外，屬于嚴(yán)格厭氧菌雙歧桿菌(即雙歧桿菌屬)群組的產(chǎn)乳酸細(xì)菌一般包含在乳酸細(xì)菌的群組中。這些乳酸細(xì)菌經(jīng)常單獨(dú)或與其它乳酸細(xì)菌組合用作食品培養(yǎng)物。包括乳桿菌屬某種和嗜熱鏈球菌的細(xì)菌在內(nèi)的乳酸細(xì)菌通常以冷凍或凍干培養(yǎng)物的形式供應(yīng)給乳品業(yè)，以用于生產(chǎn)用制曲(bulk starter propagation),或以稱為“直投式菌種(Direct Vat Set ;DVS) ”培養(yǎng)物的形式供應(yīng)給乳品業(yè)，所述培養(yǎng)物用于直接接種到發(fā)酵容器或桶中用于制造乳制品，例如發(fā)酵乳產(chǎn)品。所述培養(yǎng)物總體稱為“起子培養(yǎng)物”或“起子”。術(shù)語(yǔ)“乳”應(yīng)理解為通過(guò)對(duì)任何哺乳動(dòng)物(例如奶牛、綿羊、山羊、水?；蝰橊?擠奶而獲得的乳分泌物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，乳是牛奶。術(shù)語(yǔ)“乳”還包括由植物材料制造的蛋白質(zhì)/脂肪溶液，例如豆奶。術(shù)語(yǔ)“乳底物”可以是可根據(jù)本發(fā)明的方法經(jīng)歷發(fā)酵的任何未加工和/或加工過(guò)的乳材料。因此，可用的乳底物包括但不限于包含蛋白質(zhì)的任何乳或乳狀產(chǎn)品的溶液/懸浮液，所述乳或乳狀產(chǎn)品例如是全脂奶或低脂奶、脫脂奶、白脫奶、復(fù)原奶粉、煉乳、奶粉、乳清、乳清滲透物、乳糖、由乳糖結(jié)晶獲得的母液、乳清蛋白濃縮物或奶油。顯然，乳底物可來(lái)源于任何哺乳動(dòng)物，例如是基本上純的哺乳動(dòng)物乳或復(fù)原奶粉。優(yōu)選地，乳底物中的至少部分蛋白質(zhì)是在乳中天然存在的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白或乳清蛋白。然而，部分蛋白質(zhì)可能不是乳中天然存在的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“乳”應(yīng)理解為通過(guò)對(duì)任何哺乳動(dòng)物例如奶牛、綿羊、山羊、水牛或駱駝擠奶而獲得的乳分泌物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，乳是牛奶。在發(fā)酵之前，乳底物可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行均質(zhì)化和巴氏滅菌。本文所用的“均質(zhì)化”意思是徹底混合以獲得可溶的懸浮液或乳液。如果均質(zhì)化在發(fā)酵之前進(jìn)行，那么其將乳脂肪破碎成較小尺寸以便其不再與乳分離。這可以通過(guò)在高壓下迫使乳通過(guò)小孔來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本文所用的“巴氏滅菌”意思是處理乳底物以減少或消除例如微生物等活有機(jī)體的存在。優(yōu)選地，巴氏滅菌是通過(guò)將指定溫度維持指定時(shí)段來(lái)實(shí)現(xiàn)。指定溫度通常通過(guò)加熱來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇溫度和持續(xù)時(shí)間以便殺死或滅活特定細(xì)菌，例如有害細(xì)菌。隨后可進(jìn)行快速冷卻步驟。本發(fā)明的方法中的“發(fā)酵”意思是通過(guò)微生物作用將碳水化合物轉(zhuǎn)化為醇類或酸類。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中的發(fā)酵包含乳糖至乳酸的轉(zhuǎn)化。用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的發(fā)酵方法是眾所周知的，且所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解如何選擇合適的工藝條件，例如溫度、氧、微生物的量和特征以及加工時(shí)間。顯然，可選擇發(fā)酵條件以便實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，即獲得固態(tài)或液態(tài)的乳制品(發(fā)酵乳制品)。術(shù)語(yǔ)“攪拌型產(chǎn)品”特定地是指在發(fā)酵之后維持機(jī)械處理的發(fā)酵乳制品，導(dǎo)致發(fā)酵階段形成的凝結(jié)物結(jié)構(gòu)破壞和液化。機(jī)械處理典型地但不排他地通過(guò)對(duì)凝膠進(jìn)行攪拌、抽吸、過(guò)濾或均質(zhì)化，或通過(guò)與其它成分一起混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。攪拌型產(chǎn)品典型地但不排他地具有9%至Ij 15%的乳固體非脂含量(milk solid non-fat content)。
術(shù)語(yǔ)“靜置型產(chǎn)品”包括基于已經(jīng)用例如起子培養(yǎng)物接種的乳的產(chǎn)品，其在接種步驟后包裝，然后在包裝中發(fā)酵。術(shù)語(yǔ)“可飲用產(chǎn)品”包括例如“飲用酸奶”等飲料。術(shù)語(yǔ)“飲用酸奶”典型地涵蓋用乳桿菌屬與嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵而制造的乳制品。飲用酸奶典型地具有8%或以上的乳固體非脂含量。此外，飲用酸奶飲品的活培養(yǎng)物計(jì)數(shù)典型地是每毫升至少10E6細(xì)胞形成單位(CFU)o根據(jù)本發(fā)明的“可飲用產(chǎn)品”包括基于酸化乳底物的任何可飲用產(chǎn)品，因此包括發(fā)酵乳飲品和液體酸奶飲品。在本發(fā)明的方法中，酸化是以利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來(lái)進(jìn)行的，任選地加入酸，例如有機(jī)酸(例如乳酸、乳糖酸或GDL)。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品在其呈現(xiàn)液態(tài)且作為飲料被消費(fèi)的意義上是可飲用的，也就是其適用于飲用，而不是用調(diào)羹進(jìn)食?！俺尸F(xiàn)液態(tài)”意思是產(chǎn)品處于流體物態(tài)，因此展現(xiàn)容易流動(dòng)的特征。因此，液體的形狀通常是由其填充的容器決定，這與例如柔軟但無(wú)法自由流動(dòng)的膠狀物質(zhì)(例如酸奶或布丁)相反。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品的粘度允許消費(fèi)者在期望時(shí)用吸管飲用產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品的pH可小于4. 6，優(yōu)選小于4. 4，更優(yōu)選小于4. 2且甚至更優(yōu)選是約pH 4或以下。在一個(gè)方面，可飲用產(chǎn)品的pH小于3. 8，例如小于3. 6。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品的脂肪含量可以是0到2%，優(yōu)選低于1.5%、低于1%或低于0.5%，更優(yōu)選是約0. 1%或以下?？娠嬘卯a(chǎn)品的乳固體非脂含量可小于20%，優(yōu)選小于8. 5%、小于8%、小于7. 5%、小于7%、小于6. 5%或小于6%,且更優(yōu)選是約5%。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量可介于0.5%與4%之間。在一個(gè)優(yōu)選方面，可飲用產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量低于1%。在另一個(gè)優(yōu)選方面，可飲用產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量介于2%與3%之間。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品的保存期可以超過(guò)7天，優(yōu)選超過(guò)14天，更優(yōu)選超過(guò)28天，例如超過(guò)3個(gè)月。根據(jù)本發(fā)明的可飲用產(chǎn)品可具有提高的沉降穩(wěn)定性。所述穩(wěn)定性可以在可飲用產(chǎn)品儲(chǔ)存適當(dāng)天數(shù)后，通過(guò)測(cè)量因?yàn)槊撍湛s作用而在表面上聚集的乳清的高度來(lái)測(cè)定。所述穩(wěn)定性也可以在被加速的脫水收縮作用例如通過(guò)離心之后測(cè)定。對(duì)于可飲用產(chǎn)品、例如飲用酸奶來(lái)說(shuō)，在發(fā)酵之后通常需要高剪切カ處理(例如均質(zhì)化)以破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，以便獲得流暢、均質(zhì)且可飲用的產(chǎn)品。網(wǎng)絡(luò)被破壞意味著飲用酸奶的沉降穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致保存期內(nèi)蛋白質(zhì)沉降到底部。高脂肪含量和高蛋白質(zhì)含量堤高沉降穩(wěn)定性，而具有低蛋白質(zhì)含量(1-2.5%)的低脂肪產(chǎn)品(0-0. 5%脂肪)則通常需要加入穩(wěn)定劑以避免蛋白質(zhì)沉降。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“噬菌體”具有其在所屬領(lǐng)域中被理解的常規(guī)含義，也就是選擇性地感染一種或多種細(xì)菌的病毒。許多噬菌體對(duì)特定的細(xì)菌屬或種或菌株具有特異性。術(shù)語(yǔ)“噬菌體(bacteriophage) ”與術(shù)語(yǔ)“噬菌體(phage) ”同義。噬菌體可包括但不限于屬于任何以下病毒科的卩遼菌體被蓋病毒科(Corticoviridae)、囊病毒科(Cystoviridae)、絲狀病韋科(Inoviridae)、輕小病韋科(Leviviridae)、微病韋科(Microviridae)、肌病韋科(Myoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)或復(fù)層病毒科(Tectiviridae)。噬菌體可以是裂解性噬菌體或溶原性噬菌體。裂解性噬菌體是通過(guò)完成 裂解周期來(lái)實(shí)現(xiàn)裂解路徑，而不是進(jìn)入溶原路徑的噬菌體。裂解性噬菌體經(jīng)歷病毒復(fù)制，其導(dǎo)致細(xì)胞膜被裂解、細(xì)胞被破壞以及釋放能夠感染其它細(xì)胞的子代噬菌體粒子。溶原性噬菌體是能夠進(jìn)入溶原路徑的噬菌體，在所述溶原路徑中噬菌體在其裂解周期完成之前變成細(xì)胞基因組的休眠、惰性部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的乳酸細(xì)菌對(duì)一種或多種噬菌體或ー組或多組的噬菌體具有抗性，在另ー個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的乳酸細(xì)菌對(duì)根據(jù)本發(fā)明保藏的菌株有抗性的相同噬菌體具有抗性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“噬菌體穩(wěn)固性”與術(shù)語(yǔ)“噬菌體抗性”互換使用。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“突變株”應(yīng)理解為通過(guò)例如基因工程、輻射和/或化學(xué)處理而從本發(fā)明的菌株(或母菌株)衍生或可以衍生的菌株。突變株優(yōu)選是功能相等的突變株，例如具有與母菌株基本上相同或改進(jìn)的性質(zhì)(例如關(guān)于質(zhì)構(gòu)、剪切應(yīng)力、粘度、凝膠硬度、口腔包覆感、風(fēng)味、后酸化、酸化速度和/或噬菌體穩(wěn)固性)的突變株。所述突變株是本發(fā)明的一部分。特別地，術(shù)語(yǔ)“突變株”是指使本發(fā)明的菌株經(jīng)歷任何常規(guī)使用的誘變處理(包括用例如こ烷甲烷磺酸鹽(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化學(xué)誘變劑、UV光處理)而獲得的菌株，或自發(fā)產(chǎn)生的突變株。突變株可以已經(jīng)經(jīng)歷若干誘變處理(單次處理應(yīng)理解為ー個(gè)誘變步驟和隨后的一個(gè)篩選/選擇步驟)，但目前優(yōu)選的是進(jìn)行不超過(guò)20、或不超過(guò)10、或不超過(guò)5次處理(或篩選/選擇步驟)。在ー個(gè)目前優(yōu)選的突變株中，相比母菌株，細(xì)菌基因組中小于5%或小于1%或甚至小于0. 1%的核苷酸被另ー種核苷酸取代或被缺失。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“變異株”應(yīng)理解為功能與本發(fā)明的菌株功能等同的菌株，例如具有基本上相同或改進(jìn)的性質(zhì)(例如關(guān)于質(zhì)構(gòu)、到切應(yīng)力、粘度、凝膠硬度、口腔包覆感、風(fēng)味、后酸化、酸化速度和/或噬菌體穩(wěn)固性)。所述變異株可使用適當(dāng)?shù)暮Y選技術(shù)鑒別，是本發(fā)明的一部分。在本發(fā)明的上下文中，“質(zhì)構(gòu)”是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后作為剪切應(yīng)カ測(cè)量。剪切應(yīng)カ和凝膠硬度的SI單位是帕斯卡(Pa)。用于分析質(zhì)構(gòu)的分析孵育次日，使發(fā)酵乳達(dá)到13°C并用配備有鉆孔圓盤(bored disc)的棒子輕輕攪拌，直到樣品變得均勻?yàn)橹?。在配備有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變儀(StressTech，ReologicaInstruments，瑞典)上評(píng)估樣品的流變性質(zhì)。利用在21步中從0. 27到3001/s變化的剪切速率進(jìn)行粘度測(cè)試。先增加后降低剪切速率，并記錄剪切應(yīng)力和表觀粘度的上升和下降曲線。延遲時(shí)間和積分時(shí)間分別是5s和10s。除非本文另外指定或上下文明顯矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中(特別是在以下權(quán)利要求書的上下文中)使用的術(shù)語(yǔ)“一 (“a”和“an”)”和“所述”和類似指代應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)解釋為開(kāi)放式術(shù)語(yǔ)(即意思是“包括但不限于”)。除非本文另外指定，否則本文敘述的值的范圍僅旨在用作各個(gè)提及落在所述范圍內(nèi)的每一單獨(dú)值的簡(jiǎn)化方法，且每一單獨(dú)值都被納入說(shuō)明書中，就如同其在本文中各個(gè)敘述一樣。除非本文中另外指出或上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法都可按任何合適次序進(jìn)行。除非另外主張，本文提供的任何和所有實(shí)施例或示例性修辭(例如“諸如”)的使用僅用于更好地闡明本發(fā)明，并且不對(duì)本發(fā)明的范圍施加限制。說(shuō)明書中的任何語(yǔ)言都不應(yīng)被解釋成表示任何未請(qǐng)求保護(hù)的要素對(duì)于本發(fā)明 的實(shí)施是必要的。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例I :具有改進(jìn)的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的抗噬菌體嗜熱鏈球菌菌株的開(kāi)發(fā)CHCCl 1977 的開(kāi)發(fā)母菌株CHCC11342是如實(shí)施例5中所述來(lái)獲得。所述菌株是CHCC6008的突變株且被視為發(fā)酵半乳糖的嗜熱鏈球菌菌株。一起涂布0. Iml的CHCCl 1342的M17過(guò)夜培養(yǎng)物與每毫升含有10E09(10exp9)個(gè)噬菌體粒子的0. Iml噬菌體CHPC1152，并在37°C孵育2天之后，在M17瓊脂平板上分離菌株CHCCl 1977。將稱為CHCCl 1977的一個(gè)突變體進(jìn)行菌落純化三次，并在M17瓊脂平板上在37°C使用噬菌體CHPC1152在空斑試驗(yàn)中重新測(cè)試，其中證實(shí)了噬菌體抗性(沒(méi)有觀察到單
一空斑)。所述突變株然后也在M17肉湯中在37°C在存在噬菌體CHPC1152的情況下進(jìn)行了測(cè)試。CHCC11977在液體培養(yǎng)物中也保持了其噬菌體抗性，而CHCC11342和預(yù)期一樣受到CHPCl 152 攻擊。還在乳中在不同溫度下測(cè)試了 CHCCl 1977(未加入感染性噬菌體)，顯示酸化活性與母菌株CHCCl 1342相當(dāng)。發(fā)酵乳中CHCCl 1342質(zhì)構(gòu)的分析孵育次日，使發(fā)酵乳達(dá)到13°C并用配備有鉆孔圓盤的棒子輕輕攪拌，直到樣品變得均勻?yàn)橹?。在配備有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變儀(StressTech, Reologica Instruments,瑞典)上評(píng)估樣品的流變性質(zhì)。利用在21步中從0. 27到3001/s變化的剪切速率進(jìn)行粘度測(cè)試。先增加后降低剪切速率，并記錄剪切應(yīng)力和表觀粘度的上升和下降曲線。延遲時(shí)間和積分時(shí)間分別是5s和10s。為進(jìn)行進(jìn)一步分析，選擇300s-l的剪切應(yīng)力。流變儀結(jié)果顯示，CHCCl 1342的剪切應(yīng)力值是73. OPa，而CHCC6008的剪切應(yīng)力值是68. OPa，參看圖I。
發(fā)酵乳中CHCCl 1977質(zhì)構(gòu)的分析如上文對(duì)于gal陽(yáng)性的抗噬菌體突變株所描述，獲得發(fā)酵乳，并分析質(zhì)構(gòu)相關(guān)的性質(zhì)。流變儀結(jié)果顯示，CHCCl 1977的剪切應(yīng)カ值與CHCCl 1342相比提高了 10%(CHCC11977的剪切應(yīng)カ值是80. OPa，母菌株CHCCl 1342是73. OPa，參看圖I)。此タ卜，抗噬菌體突變株CHCCl 1977的凝膠硬度(G*)的值是126. OPa,與CHCC11342(凝膠硬度104. OPa)相比增加了 20%。因此，通過(guò)從半乳糖陽(yáng)性母菌株中分離抗噬菌體突變株有可能顯著改進(jìn)重要的流變學(xué)參數(shù)，即剪切應(yīng)カ和凝膠硬度。來(lái)自CHCCl 1342的galK啟動(dòng)子區(qū)域的測(cè)序?yàn)榱藪魇景肴樘顷?yáng)性突變株CHCC11342的突變類型，對(duì)galK基因(編碼來(lái)自嗜熱 鏈球菌的半乳糖激酶)的開(kāi)端進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于CHCCl 1342，鑒別了 galK啟動(dòng)子區(qū)域中的突變(參看以下序列)。galK基因的-10啟動(dòng)子盒下游的三個(gè)核苷酸發(fā)生了突變，導(dǎo)致C至A的核苷酸變化。CHCC11342 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTAAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID No : ICHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID No 2AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID No 3共同序列AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID No 4-35-10
RBS來(lái)自CHCC11342的galK基因的啟動(dòng)子區(qū)域。用灰色代碼標(biāo)識(shí)CHCC11342galk啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)突變。標(biāo)記來(lái)自嗜熱鏈球菌STllUGenbank登記號(hào)AY704368)的公開(kāi)的galK序列用于比較。-35 :-35啟動(dòng)子盒；_10 :-10啟動(dòng)子盒；RBS :核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其它抗噬菌體突變株為了掲示噬菌體抗性與半乳糖陽(yáng)性表型之間的可能關(guān)系，在M17半乳糖瓊脂平板上從菌株CHCC6008 (gal-)分離另外5種抗噬菌體性突變株，所述菌株CHCC6008 (gal-)是CHCCl 1342 (gal+)的母菌株。所有5種抗噬菌體性突變株CHCCl 1396、CHCCl 1397、CHCCl 1398、CHCCl 1399和CHCCl 1340 (對(duì)噬菌體CHPCl 152具有抗性)都不能使半乳糖發(fā)酵，意味著gal+表型與噬菌體抗性沒(méi)有直接關(guān)系。另ー方面，空斑分析證實(shí)了CHCCl 1342 (gal+)對(duì)噬菌體CHPCl 152仍然敏感。實(shí)施例2 :具有改進(jìn)的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的抗噬菌體德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的開(kāi)發(fā)從母菌株CHCC10019 (DSM19252)如下分離抗噬菌體突變株一起涂布0. Iml的CHCC10019的MRS過(guò)夜培養(yǎng)物與每毫升含有10E06個(gè)噬菌體粒子的0. Iml CHPC658噬菌體溶菌產(chǎn)物，并在37°C厭氧孵育2天之后，從含有IOmM CaCl2/10mMMgCl2的MRS瓊脂平板挑選突變株。分離30株突變株，并在針對(duì)噬菌體CHPC658的交叉劃線法(cross-streaking)中進(jìn)行測(cè)試。29株突變株在交叉劃線測(cè)試中表現(xiàn)抗性，隨后在MRS瓊脂平板上在37 °C對(duì)這些突變株進(jìn)行菌落純化三次。在微量滴定板中測(cè)試這29株突變株的酸化特性和噬菌體抗性。用乳制備兩個(gè)微量滴定板，每個(gè)滴定板都用2%的各自突變株接種。將2%蛋白胨-鹽稀釋劑(對(duì)照物)加入一個(gè)滴定板的每個(gè)孔中，并且向另一個(gè)微量滴定板中加入每毫升含有10E06個(gè)噬菌體粒子的2% CHPC658。將兩個(gè)滴定板在37°C孵育2天，每12分鐘記錄每個(gè)孔的pH。與被噬菌體CHPC658攻擊的母菌株CHCC10019相比，所有突變株都具有噬菌體抗性。基于在MRS和乳中的酸化特性(類似 于母菌株)以及菌株的粘度選出12株突變株。CHCC10019抗噬菌體突變株在發(fā)酵乳中的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的分析使12株突變株和母菌株CHCC10019在乳中于37 °C孵育過(guò)夜，然后將發(fā)酵乳調(diào)節(jié)到13°C，并用配備有鉆孔圓盤的棒子輕輕攪拌，直到每個(gè)樣品變得均勻?yàn)橹?。在配備有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變儀(StressTech, Reologica Instruments,瑞典)上評(píng)估每個(gè)樣品的流變性質(zhì)。利用在21步中從0. 27到3001/s變化的剪切速率進(jìn)行粘度測(cè)試。先增加后降低剪切速率，并記錄剪切應(yīng)力和表觀粘度的上升和下降曲線。延遲時(shí)間和積分時(shí)間分別是5s和10s。為進(jìn)行進(jìn)一步分析，選擇300s-l的剪切應(yīng)力。流變學(xué)測(cè)量的結(jié)果顯示，所有12株突變株(例如CHCC12813和CHCC12841)與CHCC10019相比都具有提高的粘度，其是作為剪切應(yīng)力測(cè)量的。CHCC12841獲得了最高的剪切應(yīng)力值(74.0 &)，而01010019的剪切應(yīng)力值則為58.0 &，參看圖2。在該圖中，顯示了這12株抗噬菌體突變株的流變學(xué)數(shù)據(jù)。與CHCC10019相比，所有突變株的剪切應(yīng)力都有增力口，范圍從10%—直到28%?；谕蛔冎昱c其它菌株在共同培養(yǎng)中生長(zhǎng)時(shí)的酸化活性和流變學(xué)數(shù)據(jù)，選出CHCC12813作為被分離的突變株中最有前景的候選者，用于進(jìn)一步應(yīng)用性測(cè)試。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)分離菌株的抗噬菌體突變株，細(xì)菌菌株的重要流變學(xué)參數(shù)剪切應(yīng)力將得到顯著提高。實(shí)施例3 :嗜熱鏈球菌菌株CHCC9204的抗噬菌體突變株的分離從母菌株CHCC9204 (登記在Chr. Hansen培養(yǎng)物保藏中心)分離抗噬菌體突變株。一起涂布0. Iml的CHCC9204的M17乳糖過(guò)夜培養(yǎng)物與每毫升含有Ixl0exp09個(gè)噬菌體粒子的0. Iml噬菌體CHPC1057，并在37°C孵育過(guò)夜之后，在含有IOmM MgCl2/CaCl2的肌7_2%乳糖瓊脂平板上分離突變株。在幾個(gè)突變株中，對(duì)稱為CHCC12339的一個(gè)突變株進(jìn)行菌落純化三次，并在M17乳糖瓊脂平板上在37°C使用噬菌體CHPC1057在空斑試驗(yàn)中針對(duì)噬菌體攻擊進(jìn)行重新測(cè)試，并且證實(shí)了噬菌體抗性(在空斑試驗(yàn)中沒(méi)有觀察到單一空斑)。還在乳中測(cè)試了CHCC12339，顯示酸化活性與母菌株相當(dāng)?？故删w突變株CHCC12339在發(fā)酵乳中的質(zhì)構(gòu)件質(zhì)的分析使突變株CHCCl2339和母菌株CHCC9204在37 °C在乳中孵育過(guò)夜之后，使發(fā)酵乳達(dá)到13°C，并用配備有鉆孔圓盤的棒子輕輕攪拌，直到每個(gè)樣品變得均勻?yàn)橹?。在配備有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變儀(StressTech, Reologica Instruments,瑞典)上評(píng)估每個(gè)樣品的流變性質(zhì)。
利用在21步中從0. 27到3001/s變化的剪切速率進(jìn)行粘度測(cè)試。先増加后降低剪切速率，并記錄剪切應(yīng)カ和表觀粘度的上升和下降曲線。延遲時(shí)間和積分時(shí)間分別是5s和10s。為進(jìn)行進(jìn)ー步分析，選擇300s-l的剪切應(yīng)力。流變學(xué)測(cè)量的結(jié)果顯示，突變株CHCC12339導(dǎo)致凝膠硬度(G*)與CHCC9204相比增加了 22%，參看圖3。在該圖中，比較了抗噬菌體突變株CHCC12339(78. OPa)和母菌株CHCC9204 (64. OPa)的凝膠硬度值(G*)。實(shí)施例4 :嗜熱鏈球菌菌株CHCC5086的抗噬菌體突變株的分離從母菌株CHCC5086 (登記在Chr. Hansen培養(yǎng)物保藏中心)分離抗噬菌體突變株。一起涂布0. Iml的CHCC5086的M17-2 %乳糖過(guò)夜培養(yǎng)物與每毫升含有Ixl0exp08個(gè)噬菌體粒子的0. Iml噬菌體CHPC1089，并在37°C孵育過(guò)夜之后，在含有IOmM MgCl2/CaCl2的M17-2%乳糖瓊脂平板上分離突變株。
在幾個(gè)突變株中，將稱為CHCC13140的一個(gè)突變株進(jìn)行菌落純化三次，并在M17乳糖瓊脂平板上在37°C使用噬菌體CHPC1089針對(duì)噬菌體攻擊在空斑中進(jìn)行重新測(cè)試，并且證實(shí)了噬菌體抗性(在空斑試驗(yàn)中沒(méi)有觀察到單一空斑)。也在乳的酸化試驗(yàn)中測(cè)試了 CHCC13140，顯示酸化活性與母菌株相當(dāng)?？故删w突變株CHCC13140在發(fā)酵乳中的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的分析使突變株CHCC13140和母菌株CHCC5086在乳中37°C下孵育過(guò)夜之后，使發(fā)酵乳達(dá)到13°C，并用配備有鉆孔圓盤的棒子輕輕攪拌，直到每個(gè)樣品變得均勻?yàn)橹?。在配備有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變儀(StressTech, Reologica Instruments,瑞典)上評(píng)估姆個(gè)樣品的流變性質(zhì)。利用在21步中從0. 27到3001/s變化的剪切速率進(jìn)行粘度測(cè)試。先増加后降低剪切速率，并記錄剪切應(yīng)カ和表觀粘度的上升和下降曲線。延遲時(shí)間和積分時(shí)間分別是5s和10s。為進(jìn)行進(jìn)ー步分析，選擇300s-l的剪切應(yīng)力。流變學(xué)測(cè)量的結(jié)果顯示，突變株CHCC13140導(dǎo)致剪切應(yīng)カ與CHCC5086相比增加了14%，參看圖4。在該圖中，比較了抗噬菌體突變株CHCC13140(剪切應(yīng)カ33. OPa)和母菌株CHCC5086 (28. OPa)的剪切應(yīng)カ數(shù)據(jù)。實(shí)施例5 :鏈球菌菌株的半乳糖陽(yáng)性突變株的制備獲得gal+菌株的一般方法在分離突變株之前，將母菌株(例如CHCC6008)劃線于含有2%半乳糖的M17瓊脂平板(M17-gal平板)上。CHCC6008在作為唯一的碳水化合物源的半乳糖上不生長(zhǎng)，因此母菌株被視為gal-。然后將母菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物涂布于M17_gal平板上，并且在37°C生長(zhǎng)兩天后可分離若干菌落。在M17_gal平板上純化若干突變株，并在含有2%半乳糖作為唯一碳水化合物的M17肉湯中重新測(cè)試。突變株可通過(guò)例如基因工程、輻射和/或化學(xué)處理來(lái)獲得，或者突變株可以是自發(fā)突變株。在含有2%半乳糖(半乳糖作為唯一的碳水化合物加入)的M17中在37°C孵育16小時(shí)之后，如果PH值降低至少I. 0的值，那么突變株被視為半乳糖陽(yáng)性，所述突變株是以每毫升培養(yǎng)基至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。CHCC6008沒(méi)有顯著降低M17_gal肉湯的pH，但純化的突變株之一 CHCCl 1342在37°C生長(zhǎng)16小時(shí)后達(dá)到pH 5. 4，因此被視為CHCC6008的半乳糖發(fā)酵(gal+)突變株。半乳糖發(fā)酵菌株的分離分離作為嗜熱鏈球菌菌株CHCC6008( = ST6008, DSM18111)的半乳糖發(fā)酵突變株的突變株。在突變株分離步驟之前既不用任何誘變化合物也不用UV光對(duì)CHCC6008細(xì)胞進(jìn)行誘變。分離的菌株因此類似于CHCC6008的自發(fā)半乳糖陽(yáng)性突變株。在分離突變株之前，將CHCC6008劃線于含有2%半乳糖的M17瓊脂平板(M17_gal平板)上。CHCC6008在作為唯一碳水化合物源的半乳糖上不生長(zhǎng)。然后將CHCC6008的過(guò)夜培養(yǎng)物涂布于M17_gal平板上，且在37°C生長(zhǎng)兩天后可分 離若干菌落。在M17-gal平板上純化若干突變株，并在含有2%半乳糖作為唯一的碳水化合物的M17肉湯中重新測(cè)試。CHCC6008沒(méi)有顯著降低M17_gal肉湯的pH，但純化的突變株之一 CHCCl 1379在37°C生長(zhǎng)10小時(shí)后達(dá)到pH 5. 3，因此被視為CHCC6008的半乳糖發(fā)酵突變株。菌株CHCC11342和CHCC11976按同樣的方法分離。通過(guò)基因工程分離突變株半乳糖陽(yáng)性突變株也可通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)產(chǎn)生。使用在galK-10啟動(dòng)子盒內(nèi)攜帶突變核苷酸的寡核苷酸，利用PCR對(duì)特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。將攜帶期望突變的PCR片段克隆到載體質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化到嗜熱鏈球菌目標(biāo)菌株中，并且將突變整合到染色體中并通過(guò)重組來(lái)交換野生型galK啟動(dòng)子區(qū)域。菌株的分離如上進(jìn)行。發(fā)酵乳中的質(zhì)構(gòu)分析孵育次日，使發(fā)酵乳達(dá)到13°C并用配備有鉆孔圓盤的棒子輕輕攪拌，直到樣品變得均勻?yàn)橹?。在配備有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變儀(StressTech, Reologica Instruments,瑞典)上評(píng)估樣品的流變性質(zhì)。利用在21步中從0. 27到3001/s變化的剪切速率進(jìn)行粘度測(cè)試。先增加后降低剪切速率，并記錄剪切應(yīng)力和表觀粘度的上升和下將曲線。延遲時(shí)間和積分時(shí)間分別是5s和10s。為進(jìn)行進(jìn)一步分析，選擇300s-l的剪切應(yīng)力。流變儀結(jié)果顯示，CHCC11379的剪切應(yīng)力與CHCC6008相比提高了 10% (CHCC11379的剪切應(yīng)力值為74. OPa (帕斯卡)，母菌株CHCC6008為67. 5Pa)。乳中的質(zhì)構(gòu)分析在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用CHCC11379作為酸奶培養(yǎng)物的一部分，其中來(lái)自嗜熱鏈球菌的菌株在脫脂奶中在43°C與來(lái)自德氏乳桿菌保加利亞亞種的菌株共同培養(yǎng)。當(dāng)酸奶生產(chǎn)中的唯一區(qū)別是使用CHCCl 1379而不是野生型CHCC6008時(shí)，剪切應(yīng)力也增加了 10% (含CHCCl 1379的酸奶培養(yǎng)物的剪切應(yīng)力為105. OPa，而含CHCC6008的酸奶培養(yǎng)物的剪切應(yīng)力為 94. 7Pa)。來(lái)自CHCC11379的galK啟動(dòng)子區(qū)域的測(cè)序?yàn)榱私沂緂al陽(yáng)性突變株CHCCl 1379的突變類型，對(duì)galK基因(編碼來(lái)自嗜熱鏈球菌的半乳糖激酶)的開(kāi)端進(jìn)行測(cè)序。
對(duì)于CHCCl 1379，鑒別了 galK啟動(dòng)子區(qū)域中的突變(見(jiàn)下文)。各個(gè)的突變將最可能導(dǎo)致與母菌株6008相比提高的啟動(dòng)子活性，這對(duì)觀察到的gal陽(yáng)性表型進(jìn)行了解釋。這是基于以下事實(shí)_10啟動(dòng)子盒的共同序列是“ TATAAT”，且CHCC6008的-10盒(區(qū)域)(“TACGAT”)的核苷酸3的突變導(dǎo)致與CHCC11379中的共同序列(“TATGAT”)相似度更高的-10盒。CHCCl1379 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTATGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID NO 5 CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID NO 2AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID NO 3共同序列AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO 4-35-10
RBS來(lái)自CHCC11379的galK基因的啟動(dòng)子區(qū)域。用灰色代碼標(biāo)識(shí)CHCC11379galk啟動(dòng)子內(nèi)的點(diǎn)突變。標(biāo)記來(lái)自嗜熱鏈球菌STlll (Genbank登記號(hào)AY704368)的公開(kāi)的galK序列以用于比較。-35 :-35啟動(dòng)子區(qū)域；_10 :-10啟動(dòng)子區(qū)域；RBS :核糖體結(jié)合位點(diǎn)。本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，包括發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳模式。對(duì)于所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在閱讀以上描述后，那些優(yōu)選實(shí)施方案的變化可變得顯而易見(jiàn)。發(fā)明人預(yù)期普通技術(shù)人員使用適當(dāng)?shù)拇祟愖兓野l(fā)明人意圖以本文具體說(shuō)明以外的方式實(shí)施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括隨附權(quán)利要求書中陳述的主題的適用法律所允許的所有修改和等同方式。此外，除非本文另外指出或上下文另外明顯矛盾，否則本發(fā)明涵蓋上述要素在其所有可能變化中的任何組合。保藏和專家解決方案嗜熱鏈球菌菌株CHCCl 1977和CHCCl 1342分別在2009年9月8日以保藏號(hào)DSM22935 和 DSM22932 保藏于 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B,D_38124Braunschweig,Germany)。CHCC6008 已經(jīng)在2006年3月29日以保藏號(hào)DSM18111保藏于DSMZ。噬菌體CHPC658、CHPC1057和CHPCl 152于2010年8月27日保藏于DSMZ，并被分別賦予保藏號(hào) DSM23961、DSM23962 和 DSM23994。在DSMZ的其它保藏物CHCC10019(DSM19252)和 CHCC3984(DSM19251):保藏日期 2007 年 4 月 3 日，CHCC2008 (DSM22584)和 CHCC5086 (DSM22587):保藏日期 2009 年 5 月 19 日，CHCCl 1379 (DSM22884):保藏日期 2009 年 8 月 26 日，CHCCl 1976 (DSM22934):保藏日期 2009 年 9 月 8 日，CHCCl3140 (DSM 24023)、CHCC12813 (DSM24074)和 CHPC1089 (DSM24022):保藏日期2010年9月29日；CHCC12339(DSM24090):保藏日期 2010 年 10 月 14 日。
嗜熱鏈球菌CHCC5086 (DSM22587):保藏日期2009年5月19日。CHCC9204 (DSM19243):保藏日期 2007 年 3 月 29 日。已經(jīng)根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(Budapest Treatyon the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurposes of Patent Procedure)的條款進(jìn)行了保藏。申請(qǐng)人:要求保藏的微生物的樣品只能供申請(qǐng)人批準(zhǔn)的專家使用。參考文獻(xiàn)Appl. Environ. Microbiol. 71，7，第 3659-67 頁(yè)(2005)；International Journal of Food Microbiology 113 (2007) 195-200 ；
Applied And Environmental Microbiology, 2002 年 2 月，第 784-790 頁(yè)；J Dairy Sci 92:477-482(2009)W02008/040734A1, W02007/025097A2, US7241610B2, W02007/144770A2,W02004/085607A, W02008/148561A, W011000879A, W011000883A, W010023178A本專利文件中所引用的所有參考文獻(xiàn)皆以引用的方式以其整體并入本文中。
權(quán)利要求
1.一種制備乳酸細(xì)菌(當(dāng)所述細(xì)菌用于對(duì)乳進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，所述細(xì)菌例如產(chǎn)生比母菌株高的剪切應(yīng)力和/或凝膠硬度)的方法，其包括以下步驟 a)提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)；和 b)分離母菌株的突變株，與母菌株相比，所述突變株對(duì)于更多的噬菌體(例如更多的噬菌體類型或更多的噬菌體菌株)具有抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其包括以下步驟 al)在步驟a)之后，使所述乳酸細(xì)菌菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由 CHPC658 (DSM 23961)、CHPC1057 (DSM23962)、CHPC1089 (DSM 24022)和CHPCl 152 (DSM 23994)以及它們的突變株或變異株組成的群組的噬菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其包括以下步驟 a)提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)； al)使所述乳酸細(xì)菌菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPC1152以及它們的突變株或變異株組成的群組的噬菌體； a2)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育經(jīng)過(guò)暴露的細(xì)菌細(xì)胞；和 b)分離母菌株的突變株，所述突變株沒(méi)有被所述噬菌體溶解。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其包括以下步驟 c)例如在步驟al)之前、期間和/或之后，或在步驟a)之后，使母菌株發(fā)生突變(例如通過(guò)化學(xué)處理或輻射處理，或借助于基因工程技術(shù))。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其包括以下步驟 d)例如在步驟c)之前、期間和/或之后，或在步驟al)之前、期間和/或之后， 在所述菌株的galK基因或galK調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子)中引入突變(例如 通過(guò)化學(xué)處理或輻射處理，或借助于基因工程技術(shù))。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其包括以下步驟 -提供乳酸細(xì)菌菌株(母菌株)； -使母菌株發(fā)生突變(例如通過(guò)化學(xué)處理或輻射處理，或借助于基因工程技術(shù))； -使所述乳酸細(xì)菌菌株暴露于噬菌體，例如能夠溶解母菌株的噬菌體，例如選自由CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPC1152以及它們的突變株或變異株組成的群組的噬菌體； -在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育經(jīng)過(guò)暴露的細(xì)菌細(xì)胞；和 -分離母菌株的突變株，所述突變株沒(méi)有被所述噬菌體溶解。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變被引入到galK基因的啟動(dòng)子區(qū)域中。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變被引入到galK基因的-10區(qū)域(Pribnow盒)中或Pribnow盒與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域中。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變導(dǎo)致與母菌株相比，提高的半乳糖發(fā)酵活性。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變導(dǎo)致 -galK基因的Pribnow盒與核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，例如野生型Pribnow盒下游的序列TTCAGT (SEQ ID NO 6)中的C被選自由A、T和G組成的群組的核苷酸取代；和/或 -野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQ ID NO 7)中的C和G中的一個(gè)或兩個(gè)被獨(dú)立選自由A和T組成的群組的核苷酸取代；和/或 -野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQ ID NO 7)中的C被獨(dú)立選自由A和T組成的群組的核苷酸取代；和/或 -野生型-10區(qū)域(TACGAT，SEQ ID NO 7)中的C被T取代；和/或 —10 區(qū)域具有核苷酸序列 TATGAT (SEQ ID NO :8)、TATTAT (SEQ IDNO :9)或 TACTAT (SEQID NO 10)。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其包含一個(gè)或多個(gè)其它步驟，所述其它步驟選自由以下各項(xiàng)組成的群組 Cl)篩選具有噬菌體抗性的突變株，例如與母菌株相比提高的噬菌體抗性；和 c2)篩選具有Gal+表型的突變株，例如與母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變株是自發(fā)突變株、通過(guò)利用例如化學(xué)處理或輻射處理對(duì)母菌株進(jìn)行誘變而獲得的突變株、或借助于基因工程技術(shù)獲得的突變株。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變株具有噬菌體抗性、實(shí)質(zhì)性噬菌體抗性和/或與母菌株相比具有提高的噬菌體抗性，并且其中所述噬菌體選自由以下各項(xiàng)組成的群組能夠溶解母菌株的噬菌體、CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPC1152以及它們的突變株或變異株。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌(母菌株)選自由以下各項(xiàng)組成的群組中的種乳球菌屬(Lactococcus spp·)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)(例如嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus))、乳桿菌屬(Lactobacillus spp·)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp·)、偽明串珠菌屬(Pseudoleuconostoc spp·)、片球菌屬(Pediococcus spp.)、短桿菌屬(Brevibacterium spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp·)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium spp.)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌(母菌株)選自具有選自由以下各項(xiàng)組成的群組的一個(gè)或多個(gè)特征的菌株對(duì)乳進(jìn)行質(zhì)構(gòu)化的能力，生產(chǎn)多糖如胞外多糖或莢膜多糖的能力，當(dāng)在乳中孵育時(shí)產(chǎn)生粘性的能力，以及當(dāng)在乳中孵育時(shí)增加剪切應(yīng)力的能力。
16.通過(guò)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法可獲得的乳酸細(xì)菌或菌株。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的乳酸細(xì)菌或菌株，其在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約70Pa(例如大于73Pa、大于77Pa或大于80Pa)的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述乳酸細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的細(xì)菌或菌株，其屬于嗜熱鏈球菌或德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)。
19.一種屬于嗜熱鏈球菌的細(xì)菌菌株，選自由以下各項(xiàng)組成的群組CHCC11342 (DSM22932),CHCCl 1977 (DSM22935) ,CHCC12339 (DSM24090)和 CHCCl3140 (DSM 24023)以及它們?nèi)我环N的突變株和變異株，例如在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約70Pa(例如大于73Pa、大于77Pa或大于80Pa)的剪切應(yīng)力的突變株和變異株，所述剪切應(yīng)力是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述突變株和變異株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。
20.—種屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種的細(xì)菌菌株，選自由CHCC12813(DSM24074)和CHCC12841以及它們的突變株和變異株組成的群組。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的細(xì)菌或菌株，其在發(fā)酵乳中產(chǎn)生大于約60Pa(例如大于65Pa、大于69Pa或大于72Pa)的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的細(xì)菌或菌株，其在發(fā)酵乳中產(chǎn)生從60到IOOPa(例如65到90Pa、69到85Pa或72到80Pa)范圍內(nèi)的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力是在37°C生長(zhǎng)12小時(shí)后測(cè)量的，所述細(xì)菌或菌株例如以每毫升乳至少10E4個(gè)細(xì)胞的量接種。
23.一種組合物，包含前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的乳酸細(xì)菌或菌株，例如屬于選自由以下各 項(xiàng)組成的群組的菌株的細(xì)菌CHCC11342 (DSM 22932)、CHCCl 1977 (DSM22935)、CHCC12339、CHCCl3140 (DSM 24023)、CHCC12813以及它們?nèi)我环N的突變株和變異株。
24.一種組合物，包含呈混合物形式或呈組件試劑盒形式的以下菌株 -屬于乳桿菌屬的菌株；和 -前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的菌株或乳酸細(xì)菌，例如屬于嗜熱鏈球菌，例如選自由CHCCl 1342 (DSM 22932)、CHCC11977 (DSM22935)、CHCC12339 和 CHCC13140 (DSM 24023)以及它們?nèi)我环N的突變株和變異株組成的群組的菌株。
25.一種組合物，包含呈混合物形式或呈組件試劑盒形式的以下菌株 -屬于嗜熱鏈球菌的菌株；和 -前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的菌株或乳酸細(xì)菌，屬于乳桿菌屬，例如屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種的菌株。
26.一種組合物，包含呈混合物形式或呈組件試劑盒形式的以下菌株 -前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的菌株或乳酸細(xì)菌，屬于嗜熱鏈球菌，例如選自由CHCCl 1342 (DSM 22932)、CHCC11977 (DSM22935)、CHCC12339 和 CHCC13140 (DSM 24023)以及它們?nèi)我环N的突變株和變異株組成的群組的菌株；和 -前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的菌株或乳酸細(xì)菌，屬于乳桿菌屬，例如屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種的菌株。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中屬于乳桿菌屬的菌株是屬于產(chǎn)多糖(例如雜多糖、同多糖)和/或產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的乳桿菌屬的菌株。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其包含至少lOexplOCFU(細(xì)胞形成單位)的屬于乳桿菌屬的菌株；和/或至少lOexplOCFU的屬于嗜熱鏈球菌的菌株。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的組合物，其包含至少lOexplOCFU(細(xì)胞形成單位)的屬于產(chǎn)多糖(例如同多糖)和/或產(chǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶的乳桿菌屬的菌株；和至少lOexplOCFU的屬于嗜熱鏈球菌的菌株。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其可用作起子培養(yǎng)物，且采取冷凍、凍干或液體形式。
31.一種生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的方法，包括用前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的乳酸細(xì)菌、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的菌株或前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物對(duì)乳底物進(jìn)行發(fā)酵。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括用屬于乳桿菌屬的菌株對(duì)所述乳底物進(jìn)行發(fā)酵，所述菌株例如德氏乳桿菌保加利亞亞種、約氏乳桿菌(Ljohnsonii)或發(fā)酵乳桿菌(L. fermentum)的菌株，例如選自由 CHCC10019 (DSM19252)、CHCC2008 (DSM22584)或CHCC3984(DSM19251)以及這些菌株中任一種的突變株和變異株組成的群組的菌株。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述乳底物在用屬于乳桿菌屬的菌株進(jìn)行發(fā)酵之前、期間或之后，用前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物、菌株或細(xì)菌，例如屬于嗜熱鏈球菌的菌株進(jìn)行發(fā)酵。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述乳底物在用屬于產(chǎn)多糖乳桿菌屬的菌株進(jìn)行發(fā)酵期間，用屬于嗜熱鏈球菌的菌株或細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，包括在發(fā)酵之前、期間和/或之后向所述乳底物中加入酶，例如選自由以下各項(xiàng)組成的群組的酶能交聯(lián)蛋白質(zhì)的酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶和粗制凝乳酶。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，包括在發(fā)酵之前、期間和/或之后向所述乳底物中加入酶，例如選自由以下各項(xiàng)組成的群組的酶能交聯(lián)蛋白質(zhì)的酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶和胃粗制凝乳酶。
37.一種乳制品，例如通過(guò)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法可獲得的發(fā)酵乳制品(例如酸奶或白脫奶)或乳酪(例如新鮮乳酪或帕斯塔費(fèi)拉塔乳酪)。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的乳制品，其任選地包含選自由以下各項(xiàng)組成的群組的成分水果濃縮汁、糖漿、益生菌培養(yǎng)物、著色劑、增稠劑、調(diào)味劑和防腐劑；和/或其任選地采取攪拌型產(chǎn)品、靜置型產(chǎn)品或可飲用產(chǎn)品的形式。
39.通過(guò)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法可獲得的一種乳制品(例如發(fā)酵乳制品)，其任選地包含選自由以下各項(xiàng)組成的群組的成分水果濃縮汁、糖漿、益生菌培養(yǎng)物、著色劑、增稠劑、調(diào)味劑和防腐劑；和/或其任選地采取攪拌型產(chǎn)品、靜置型產(chǎn)品或可飲用產(chǎn)品的形式。
40.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的乳制品，其通過(guò)用本發(fā)明的乳酸細(xì)菌(例如屬于嗜熱鏈球菌的菌株，例如DSM 22935)和選自保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的乳酸細(xì)菌對(duì)乳底物(例如牛奶)進(jìn)行發(fā)酵制備。
41.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的乳制品，其具有作為剪切應(yīng)力測(cè)量的大于IOOPa的粘度。
42.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的乳制品，其具有作為剪切應(yīng)力測(cè)量的在100到200Pa范圍內(nèi)，例如在100到150Pa范圍內(nèi)或在105到125Pa范圍內(nèi)的粘度。
43.一種噬菌體，選自由 CHPC658 (DSM 23961)、CHPC1057 (DSM23962)、CHPC1089 (DSM24022)和CHPC1152(DSM 23994)以及它們的突變株和變異株組成的群組，所述突變株和變異株例如能夠與母噬菌體溶解相同菌株的突變株和變異株。
44.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的噬菌體，選自由CHPC658以及其突變株和變異株組成的群組，例如能夠溶解菌株CHCC10019 (DSM19252)的突變株和變異株，和/或不能溶解菌株CHCC12813的突變株和變異株。
45.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的噬菌體，選自由CHPCl152以及其突變株和變異株組成的群組，例如能夠溶解菌株CHCC6008和/或CHCC11342的突變株和變異株，和/或不能溶解菌株CHCC11977的突變株和變異株。
46.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的噬菌體，選自由CHPC1057以及其突變株和變異株組成的群組，例如能夠溶解菌株CHCC9204的突變株和變異株，和/或不能溶解菌株CHCC12339的突變株和變異株。
47.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的噬菌體，選自由CHPC1089以及其突變株和變異株組成的群組，例如能夠溶解菌株CHCC5086的突變株和變異株，和/或不能溶解菌株CHCCl3140的突變株和變異株。
48.一種細(xì)菌菌株，其在權(quán)利要求I到15任一項(xiàng)所述的方法中可用作母菌株，選自由CHCCl 1342 (DSM22932), CHCC10019 (DSM19252)、CHCCl 1379 (DSM 22884)、CHCCl 1976 (DSM22934)、CHCC9204 (DSM19242)、CHCC5086 (DSM22587)和它們的突變株組成的群組。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有質(zhì)構(gòu)化性質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞、包含所述細(xì)胞的起子培養(yǎng)物以及用所述起子培養(yǎng)物發(fā)酵的乳制品。
文檔編號(hào)A23L1/054GK102770527SQ201180007721
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者托馬斯·簡(jiǎn)森, 迪特·埃勒高·克里斯琴森 申請(qǐng)人:科·漢森有限公司