專利名稱：無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體性的方法和組合物的制作方法
無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體性的方法和組合物
背景技術(shù)：
產(chǎn)前診斷目前一般使用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析(例如核型)或者DNA分析(例如QF-PCR),其要求通過羊膜穿刺術(shù),絨毛膜絨毛樣檢或者脊索穿刺(chordocentesis)獲得胎兒遺傳材料。盡管如此，這些是創(chuàng)傷性治療程序，并且具有顯著的胎兒死亡風(fēng)險(絨毛膜絨毛樣檢和羊膜穿刺術(shù)為O. 5至1% ) (Hulten, Μ. A.等(2003)Reproduction 126 279-297)。有效產(chǎn)前診斷測試的必要性尤其重要，就唐氏綜合癥(也稱為三染色體21綜合癥)來說，其是產(chǎn)生智力遲鈍頻率最高的形式(具有在世界范圍所有出生嬰兒中700分之一的發(fā)生率)。盡管如此，由于目前的產(chǎn)前測試的風(fēng)險，產(chǎn)前診斷只提供給高風(fēng)險的妊娠(所有妊娠中的6-8%)，其評價是根據(jù)母體血清篩選和胎兒和胎兒超聲波檢查方法。因此，迫切需要發(fā)展不會對胎兒造成危險的診斷方法，也通常被稱為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。在懷孕期間的母體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了游離胎兒DNA (ffDNA) (Lo, Y. M.等(1997)Lancet^迎485-487)，其已經(jīng)成為發(fā)展無創(chuàng)產(chǎn)前測試的重要替代途徑。ffDNA已經(jīng)被成功 用于確定胎兒性別和在母體血漿中的胎兒RhD狀態(tài)(Lo，Y. Μ.等(1998) N. Engl. J. Med. 339 1734-1738 ；Bianchi,D. ff.等(2005)Obstet. Gynecol. 106 :841-844)。盡管如此，對存在于過量母體DNA中的限定量的ffDNA (3至6 % )進(jìn)行直接分析，其對發(fā)展胎兒非整倍體性的無創(chuàng)性測試是巨大挑戰(zhàn)。在所述領(lǐng)域的最新進(jìn)展顯示所述ffDNA的物理和分子特性可以用于將其從循環(huán)母體DNA中鑒別出來或者作為胎兒DNA富集的手段(Chan，K. C.等(2004)Clin. Chem. 50j88-92 ；Poon, L. L.等(2002) Clin. Chem.堅35-41)。例如，按大小進(jìn)行分離的方法已經(jīng)被用于血漿DNA，以富集胎兒DNA，因為胎兒DNA通常比循環(huán)中母體DNA的短(Chan，K. C.等(2004)，supra)。此外，根據(jù)母體血漿中ffDNA是來自胎盤起源的證據(jù)，母體周圍(整體)血液和胎盤DNA之間的表觀遺傳差異已經(jīng)被用于檢測在來自胎兒的母體血漿中的低甲基化基因序歹Ij (maspin/SERPINB5) (Masuzaki，H.等(2004) J. Med. Genet. 41 :289-292 ；Fiori,E.等(2004) Hum. Reprod. 19 :723-724 ；Chim, S. S.等(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 14753-14758)。后來，描述了少量的其它差異胎兒表觀遺傳分子標(biāo)記，包括染色體3上的RASSF1A基因和染色體 21 上的標(biāo)記(Chiu,R. W.等(2007) Am. T. Pathol. 170 :941-950 ；01d,R. W.等(2007) R印rod. Biomed. Online 15 :227-235 ；Chim, S. S.等(2008) Clin. Chem. M :500-511)。盡管這些研究已經(jīng)證明在胎兒DNA(從絨毛膜絨毛樣檢獲得的胎盤DNA)和母體外周血DNA之間的表觀遺傳差異，可以作為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷潛在的胎兒分子標(biāo)記，并且目前為止僅僅限定量的基因組區(qū)域已經(jīng)被識別或檢測出來。大量的研究集中于單基因啟動子區(qū)域(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007, supra),然而其它的已經(jīng)研究了在染色體 21 上的 CpG 島(Old, R. W.等(2007) supra ；Chim, S. S.等(2008) supra)，盡管其僅僅覆蓋一小部分的所述染色體(Fazzari, M. J.等(2004) Nat. Rev. Genet. 5 :446-455) 目前的方法發(fā)展了使用ffDNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，常遭受大量的限制。被研究的一種方法涉及利用甲基化敏感限制酶來消除低甲基化母體DNA從而允許ffDNA的直接聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析(Old，R.W.等(2007)，supra)。盡管如此，差異甲基化DNA的必要區(qū)域(含有甲基化敏感限制酶識別的限制性微點)限制了適合測試的區(qū)域的數(shù)量。被研究的另一種方法涉及利用亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換以允許區(qū)別在母體和胎兒DNA之間的差異甲基化。在這種方法中，亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換之后進(jìn)行甲基化特異性PCR或者甲基化敏感單核苷酸引物延伸和 / 或亞硫酸氫鈉測序(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007) supra ；Chim,
S.S.等(2008)SUpra)。這種方法，盡管有兩個主要問題。首先，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換之后的甲基化狀態(tài)的精確分析取決于非甲基化胞嘧啶到脲嘧啶的完全轉(zhuǎn)換(這個條件很少能達(dá)到)。其次，在從亞硫酸氫鹽處理后獲得的DNA的降解(描述參見于Grunau，C.等(2001)Nucl.Acids Res. 29 E65-5)變得復(fù)雜，甚至進(jìn)一步的極低量的胎兒DNA的測試和定量。另一種最近的方法已經(jīng)直接測序細(xì)胞游離DNA(cell-free DNA)(來自于懷孕婦女的血衆(zhòng)中)，使用高通量鳥槍測序技術(shù)(Fan, H. C.等(2008) Proc. Natl. Acas. Sci. USA105 16266-71 ；Chiu, R. W.等(2008) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 105 :20458-63)。但是，這種方法要求技術(shù)，并且這種方法的成本高使得它的應(yīng)用對多數(shù)實驗室診斷來說相當(dāng)困難?！ひ虼?，需要其它的途徑和方法，作為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體性，以減少胎兒死亡的風(fēng)險并允許篩選所有的妊娠，而不僅限于高風(fēng)險妊娠。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種新的途徑，其根據(jù)檢測ffDNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。已經(jīng)識別在每種被檢測染色體上(染色體13、18、21、X和Y)的大量(多于2000)差異甲基化區(qū)域(DMR)(其在母體外周血和胎兒DNA(胎盤DNA)之間被差異甲基化)，通過利用具有高分辨率tiling寡核苷酸陣列(tilingoligonucleotide array)分析的系統(tǒng)稱合甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)，其能夠以高通量的途徑全染色體范圍地識別DNA甲基化模式。進(jìn)一步的，這些DMR的子集的代表性實施例(其在胎兒DNA中高甲基化，在母體外周血中低甲基化)已經(jīng)被用來精確預(yù)測三染色體21，這種預(yù)測方法是基于從在母體血液樣品中的低甲基化DNA物理分離高甲基化DNA (其通常在胎齡的早期妊娠階段，并且沒有對高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或者酶消化)，然后測定在所述高甲基化DNA樣品中的多個DMR的水平。因此，已經(jīng)證明了本公開的DMR和診斷胎兒非整倍體性的方法的有效性。因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及使用母體血液樣品進(jìn)行產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體性的方法，所述方法包括 a)在母體血液樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得高甲基化DNA樣品；b)在所述高甲基化DNA樣品中，測定多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述聞甲基化DNA樣品的聞甲基化值；c)將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與所述多個DMR的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值進(jìn)行比較(例如，相匹配胎齡的正常母體高甲基化參考值)；以及d)基于所述比較診斷胎兒非整倍體性。在優(yōu)選的實施方案中，所述母體血液樣品是母體外周血樣品。更優(yōu)選的，所述高甲基化DNA通過甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)從低甲基化DNA物理分離。更優(yōu)選的，在高甲基化DNA從低甲基化DNA中物理分離之后，對所述高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增，例如通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)。
所述多個DMR更優(yōu)選地選自在附錄A-E中的列表。在多個實施方案中，所述多個DMR的水平測定為至少3個、至少5個、至少8個、至少10個或至少12個DMR，例如選自在附錄A-E中的列表。此外，也可以使用控制區(qū)(例如兩個控制區(qū))。更優(yōu)選的，在所述高甲基化DNA樣品中的所述多個DMR的水平通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time QPCR)測定。在一個實施方案中，多個DMR的水平也在總未處理母體血液DNA樣品中測定作為LM-PCR效率的對照。更優(yōu)選的，將所述高甲基化DN A樣品的所述高甲基化值與標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值比較(例如從懷有正常胎兒的婦女中獲得的母體DNA中測定的值)，當(dāng)所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值高于所述標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值時，進(jìn)行胎兒非整倍體性的診斷。在優(yōu)選的實施方案中，所述多個DMR在診斷三染色體21的染色體21上。更優(yōu)選的，在染色體21上的所述多個DMR包括三個或更多、五個或更多、或者八個或更多選自以下的區(qū)域堿基對 39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，堿基對 44161178-44161323 (SEQ IDNO :34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，堿基對 33320735-33320829 (SEQ IDNO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ IDNO 38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO 39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ IDNO 40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID NO 41)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ IDNO 42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO 43)，堿基對 37841284-37841411 (SEQ IDNO :44)，及其組合。用于三染色體21診斷的染色體21上的優(yōu)選的DMR是SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42、43和44。在其它實施方案中，所述多個DMR在選自以下的染色體上染色體13、染色體18、X染色體和Y染色體。在又一方面中，本發(fā)明涉及使用母體外周血樣品進(jìn)行三染色體21的產(chǎn)前診斷方法，所述方法包括 a)在母體外周血樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA和高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得高甲基化DNA樣品；b)在所述高甲基化DNA樣品中，測定在染色體21上的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述聞甲基化DNA樣品的聞甲基化值，其中在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的8個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，堿基對 44161178-44161323 (SEQID N0:34)，堿基對44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，堿基對 33320735-33320829 (SEQ ID N0:36)，堿基對42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，堿基對42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ ID N0:42)，堿基對44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，堿基對 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合，和其中所述多個DMR的水平通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time QPCR)測定；c)將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與染色體21上的所述多個DMR的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值進(jìn)行比較；以及
d)基于所述比較診斷三染色體21。用于三染色體21診斷的在染色體21上的DMR是SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42,43和44。更優(yōu)選的，所述高甲基化DNA通過甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)從低甲基化DNA物理分離。更優(yōu)選的，在高甲基化DNA從低甲基化DNA中物理分離之后，對所述高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增，例如通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)。在一個實施方案中，多個DMR的水平也在總未處理母體血液DNA樣品中測定作為LM-PCR效率的對照。在又一實施方案中，將所述高甲基化DNA樣品的高甲基化值與正常母體血液樣品的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值進(jìn)行比較，當(dāng)所述高甲基化DNA樣品的高甲基 化值高于所述標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值時，進(jìn)行三染色體21的診斷。在又一方面中，本發(fā)明涉及適用于診斷胎兒非整倍體性的識別目標(biāo)染色體上差異甲基化區(qū)域(DMR)的方法，所述方法包括a)提供⑴正常成年女性外周血DNA樣品(PB樣品)；和(ii)正常胎盤DNA樣品(PL樣品)；b)在a)的每個樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得⑴分離的PB樣品；和(iii)分離的PL樣品；c)在b)的每個分離樣品中，測定目標(biāo)染色體上多個區(qū)域的水平；以及d)選擇在所述分離的PB樣品中低甲基化和在所述分離的PL樣品中高甲基化的區(qū)域，從而識別所述目標(biāo)染色體上的差異甲基化區(qū)域(DMR)。在一個實施方案中，其中所述PL樣品包括兩種不同的樣品，早期妊娠PL樣品和晚期妊娠PL樣品，其中步驟d)進(jìn)一步包括選擇在所述早期妊娠分離的PL樣品和所述晚期妊娠分離的PL樣品中具有相等程度的甲基化的區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，所述目標(biāo)染色體是染色體21。在其它實施方案中，所述目標(biāo)染色體選自染色體13、染色體18、X染色體和Y染色體。在優(yōu)選的實施方案中，所述非整倍體是三染色體性。在又一實施方案中，所述非整倍體是單染色體性。在又一方面中，本發(fā)明涉及三染色體21的產(chǎn)前診斷試劑盒，所述試劑盒包括a) 一種或多種核酸組合物，用以測定在染色體21上的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平；以及b)使用這種核酸組合物進(jìn)行染色體21的產(chǎn)前診斷的說明書。更優(yōu)選的，在染色體21上的所述多個DMR是選自在附錄A中的列表。更優(yōu)選的，在染色體21上的所述多個DMR包括三個或更多、五個或更多、或者八個或更多的選自以下的區(qū)域堿基對 39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，堿基對 44161178-44161323 (SEQ ID NO:34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，堿基對 33320735-33320829 (SEQ ID NO:36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID NO:40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ ID NO:42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，堿基對 37841284-37841411 (SEQ ID NO:44)，及其組合。用于三染色體21診斷的在染色體21上的DMR是SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42、43 和 44。在所述試劑盒的優(yōu)選的實施方案中，所述核酸組合物包括選自以下的一種或多種寡核苷酸引物SEQ ID NO :1-24，及其組合。在又一實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于控制區(qū)檢測的寡核苷酸引物(例如兩個或更多個)。在又一實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括這樣的構(gòu)件，該構(gòu)件用于在血液樣品中從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化。更優(yōu)選的，所述從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA的構(gòu)件包括用于免疫沉淀甲基化DNA的抗體。在又一實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括擴(kuò)增高甲基化DNA的構(gòu)件。在優(yōu)選的實施方案中，擴(kuò)增所述高甲基化DNA的構(gòu)件包括進(jìn)行連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)的寡核苷酸連接體和/或寡核苷酸引物。在又一方面中，本發(fā)明涉及核酸組合物，包含選自以下的一種或多種隔離的寡核苷酸引物SEQ ID NO :1-24，及其組合。 附圖
簡述圖I是其顯示通過核苷酸陣列分析的CHR21 (A)區(qū)域的DNA甲基化的富集的圖表。所述圖表顯示在第3期妊娠胎盤和周圍(全部)血液之間的甲基化差異，以及周圍(全部)血液、第I期妊娠和第3期妊娠胎盤DNA樣品的單獨甲基化狀態(tài)。圖2是顯示CHR21㈧的DNA甲基化的富集(來自核苷酸陣列分析和實時定量PCR，使用外周血、第一期妊娠和第3期妊娠胎盤DNA樣品)的圖表。所述Y軸指示與外周血DNA樣品相比的胎盤相對富集倍數(shù)，所述X軸指示染色體位置(以bp計)?；揖€代表覆蓋染色體21特定區(qū)域的寡核苷酸，而黑線代表當(dāng)應(yīng)用實時熒光定量PCR時所述PCR產(chǎn)物(CHR21 (AD&CHR21 (A2))。點線代表從第一期妊娠胎盤獲得的結(jié)果，而實線代表從第3期妊娠胎盤獲得的結(jié)果。圖3是顯示CHR21 (B4)的DNA甲基化的富集(通過在MeDiP和輸入復(fù)制的DNA樣品上的實時定量PCR)的條形圖。開放的棒是周圍(全部)血液樣品，灰色的棒是第一期妊娠胎盤DNA樣品，黑色的實棒是第3期妊娠胎盤DNA樣品。所述誤差桿指示在技術(shù)副本之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。WB :全部(周圍)血液，PL :胎盤。圖4是顯示CHR13(HYP1)的DNA甲基化的富集(使用實時定量PCR)的條形圖。開放的棒是相對于周圍(全部)血液的輸入DNA，黑色的實棒是相對于周圍(全部)血液的的免疫沉淀DNA，1PL&2PL是第3期妊娠胎盤，3PL是第I期妊娠胎盤。WB是全部(周圍)血液，PL是胎盤。圖5是識別差異甲基化區(qū)域(DMR)的方法流程圖。圖6是無創(chuàng)性診斷測試三染色體21 (NID21)的發(fā)展和確認(rèn)的方法流程圖。圖7是所述DNA甲基化比率分析策略的圖解性說明，其用于使用母體外周血分析的三染色體21無創(chuàng)性檢測，通過對定位在染色體21上的胎兒特異性DNA甲基化區(qū)域的相
對定量。圖8是DNA甲基化比率測定的分析途徑的圖解性說明。圖9是BoxPlot箱線圖表示，該結(jié)果從4個DMR獲得在正常和三染色體21上的EP1、EP4、EP7 和 ΕΡΙΟ。發(fā)明詳述本發(fā)明是至少部分根據(jù)發(fā)明人對多種差異甲基化區(qū)域(DMR)的識別，所述差異甲基化區(qū)域(DMR)在胎兒DNA中表現(xiàn)高甲基化和在母體DNA中表現(xiàn)低甲基化。更進(jìn)一步地，本發(fā)明是至少部分根據(jù)本發(fā)明人的證明高甲基化胎兒DNA能從低甲基化母體DNA中純化出來，通過物理分離這兩種DNA群，其不對這兩種DNA群進(jìn)行化學(xué)改變或者酶消化，從而導(dǎo)致在樣品中富集高甲基化胎兒DNA。更進(jìn)一步的，本發(fā)明人已經(jīng)精確地診斷在一組母體外周血樣品中的三染色體21，使用本文公開的DMR的代表性實施例，從而證明識別的DMR和公開的診斷胎兒非整倍體性中方法的有效性。本公開的多個方面在下述部分被進(jìn)一步地描述。I.胎兒非整倍體性的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法 在一個方面中，本發(fā)明提供了使用母體血液樣品進(jìn)行胎兒非整倍體性的產(chǎn)前診斷方法，所述方法包括 a)在母體血液樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得高甲基化DNA樣品；b)在所述高甲基化DNA樣品中，測定多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述聞甲基化DNA樣品的聞甲基化值；c)將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與所述多個DMR的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值進(jìn)行比較(例如下文進(jìn)一步公開的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值)；以及d)基于所述比較診斷胎兒非整倍體性。母體血液樣品所述母體血液樣品能通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得，例如使用枕頭和注射器。在優(yōu)選的實施方案中，所述母體血液樣品是母體外周血樣品?？蛇x擇地，所述母體血液樣品是外周血的分離部分，例如母體血漿樣品。一旦獲得所述血液樣品，總DNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(其非限制性實施例是QIAmp DNA Blood MidiKit(Qiagen))從所述樣品中提取出來。通常，然后分離所述總DNA，更優(yōu)選的得到大小約300bp-800bp。例如，所述總DNA可以通過超聲波降解。從低甲基化DNA分離高甲基化DNA在本方法中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA以獲得高甲基化DNA樣品，其沒有對所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化。更優(yōu)選的，這種物理分離通過甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)實現(xiàn)，這種技術(shù)已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述(參見例如 Weber, Μ.等(2005) Nat. Genet. 37 :853-862 ；和 Rakyan,等(2008) Genome Res. 18 1518-1529 ;其表述都以參考的方式并入本文)。在所述MeDiP技術(shù)中，所述輸入DNA是變性的，與直接抗5_甲基胞嘧啶的抗體孵育，然后通過免疫沉淀分離得到所述甲基化DNA。例如，為了實現(xiàn)免疫沉淀，所述抗-5-甲基胞嘧啶抗體可以被連接到固體支持物上(例如免疫磁珠、瓊脂糖微球或順磁珠)，以允許從溶液中沉淀(直接免疫沉淀)甲基化DNA?？蛇x擇地，次級抗體或試劑可以用于識別所述抗-5-甲基胞嘧啶抗體(例如所述抗體的恒定區(qū))，并且其被連接到固體支持物上，從而允許從溶液中沉淀(非直接免疫沉淀)所述甲基化DNA。對直接或非直接免疫沉淀來說，其它在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于在一個樣品中進(jìn)行物理分離的途徑，例如可以使用所述生物素/抗生物素蛋白體系或者生物素/鏈霉親和素體系。例如，所述抗-5-甲基胞嘧啶抗體可以被連接到生物素上，然后抗生物素蛋白或者鏈霉親和素被連接到固體支持物上，用以允許從溶液中沉淀所述甲基化DNA。在現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于導(dǎo)致免疫沉淀的其它變體對于本發(fā)明來說也是合適的，這對于普通技術(shù)人員來說是非常明顯的。因此，如本文使用的，所述術(shù)語“甲基化DNA免疫沉淀”或者“MeDiP”目的是包含任意和所有方法，在這些方法中，使區(qū)別高甲基化DNA和低甲基化DNA的抗體與來自所述母體血液樣品的DNA接觸，接著從溶液中沉淀所述高甲基化DNA (例如特異性地和所述抗體結(jié)合的所述DNA)。在實現(xiàn)從所述母體血液樣品中所述低甲基化DNA中物理分離所述高甲基化DNA的過程中，所述樣品中的所述DNA沒有被化學(xué)改變或者酶消化。如本文使用的，所述術(shù)語“化學(xué)改變”是指使所述DNA與非抗體化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，所述非抗體化學(xué)物質(zhì)能區(qū)別高甲基化DNA和低甲基化DNA，例如亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換。因此，在這種即時方法中，所述母體血液樣品的DNA不遭受亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換或任何其他相似(非抗體)化學(xué)反應(yīng)(其區(qū)別高甲基化DNA和低甲基化DNA)。盡管如此，如本文使用的，所述術(shù)語“酶消化”是指使所述DNA與一種或多種甲 基化敏感限制酶反應(yīng)，從而去除低甲基化DNA。因此，在這種即時方法中，所述所述母體血液樣品的DNA沒有用甲基化敏感限制酶處理以區(qū)別高甲基化DNA和低甲基化DNA。應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管如此，來自所述母體外周血樣品(其通常在從所述低甲基化DNA分離所述高甲基化DNA前進(jìn)行)的DNA的破碎，其通常是通過超聲波剪切實現(xiàn)，也可以通過用限制性酶消化DNA實現(xiàn)。盡管如此，這種所述DNA的一般消化實現(xiàn)破碎的方法不是用甲基化敏感限制酶實現(xiàn)的。因此，不被“酶消化”的所述母體血液樣品的所述DNA的要求并不打算排除使用非-甲基化敏感限制酶來實現(xiàn)所述母體血液樣品DNA.的全部破碎(即，粉碎)。DNA 擴(kuò)增在所述診斷方法中，通常在從在所述母體血液樣品中的所述低甲基化DNA中物理分離所述高甲基化DNA后，對所述高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增。如本文使用的，所述術(shù)語“擴(kuò)增”意思是所述DNA的其它副本被制備從而增加所述DNA的拷貝數(shù)，其通常是使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來實現(xiàn)的。所述高甲基化DNA的擴(kuò)增的優(yōu)選方法是連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)，其已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中被描述過(參見例如Ren，B.等(2000) Science益2306-2309 jP0berley，M. J.等(2004)Methods EnzymoI. 376 :315-334 ;兩篇文章的內(nèi)容都通過參考的方式并入本文)。在LM-PCR中，連接體末端通過平頭連接連接到DNA片段樣品上，然后在PCR中使用識別所述連接體末端核苷酸序列的寡核苷酸引物，從而擴(kuò)增所述(所述連接體已經(jīng)被連接到其上的)DNA片段。因此，在即時診斷方法的優(yōu)選實施方案中，在來自所述母體血液樣品的DNA被破碎(例如破碎成大約300-800bp)之后，和在所述高甲基化DNA被從所述低甲基化DNA(例如通過MeDiP)物理分離出來之前，連接臂通過平頭連接被連接到破碎的DNA上。然后，在從低甲基化DNA中物理分離所述高甲基化DNA之后，所述回收的高甲基化DNA使用寡核苷酸引物進(jìn)行PCR，所述寡核苷酸引物識別連接到所述DNA上的連接體末端。這導(dǎo)致所述高甲基化DNA樣品的擴(kuò)增。差異甲基化區(qū)域(DMR)本發(fā)明的診斷方法使用多個差異甲基化區(qū)域(DMR)。如本文使用的，所述術(shù)語“差異甲基化區(qū)域”或者“DMR”是指在染色體DNA中的區(qū)域，其在胎兒和母體DNA中被差異甲基化，為了更優(yōu)選地實現(xiàn)本發(fā)明，選擇的DMR是這些，其在胎兒DNA中高甲基化，在母體DNA中低甲基化。也就是說，這些區(qū)域(選定的DMR)在胎兒DNA中，相對于母體DNA表現(xiàn)更大(或更多)的甲基化程度。在理論上，在目標(biāo)染色體中具有上述特性的任意DMR可以用于所述即時診斷方法。特別地，識別這些DMR的方法在下文和所述實施例中(參見實施例I和2)詳細(xì)描述。此外，已經(jīng)識別了適合在所述診斷方法中使用的多種(大約2000)的DMR(對每種染色體，染色體13、18、21、X和Y)。這些DMR在附錄A-E中列出，其為染色體21、13、18、X和Y分別提供了選定的DMR。如本文中使用的，所述術(shù)語“多個DMR”是指兩種或更多個DMR。在優(yōu)選的實施方案中，所述多個DMR選自附錄A-E中的列表，分別對于染色體21、13、18、X或者Y。在多個實施方案中，所述多·個DMR的水平被測定為至少兩個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個或者至少12個DMR。又，最優(yōu)選的，所述多個DMR選自附錄A-E中的列表。在優(yōu)選的實施方案中，所述多個DMR在診斷三染色體21的染色體21上。在尤其優(yōu)選的實施方案中，在染色體21上的所述多個DMR包括兩個或更多，3個或更多，4個或更多，5個或更多，6個或更多，7個或更多，8個或更多，9個或更多，10個或更多，11個或更多，或12個選自以下的區(qū)域堿基對39279856-39280004(SEQ ID NO :33)，堿基對44161178-44161323 (SEQID NO :34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID N0:35)，堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID N0:37)，堿基對42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID N0:39)，堿基對22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID N0:43)，堿基對37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合。關(guān)于這些區(qū)域的術(shù)語，所述術(shù)語“堿基對39279856-39280004”(諸如此類)是指在染色體21上的差異甲基化區(qū)域的第一個和最后一個堿基對位置。因此，所述在染色體21上的“堿基對39279856-39280004”代表性的DMR，那么所述DMR包括在染色體21上的區(qū)域，其起始堿基對39279856，終止堿基對39280004 (因此，這個區(qū)域包含148堿基對的區(qū)域)。擴(kuò)增上述列出的DMR的寡核苷酸引物在實施例3中和在表7中被進(jìn)一步描述，其顯示在SEQ ID NO :1-24中。上述列出的DMR的核苷酸序列被在表8和SEQ ID NO 33-44中示出。如同在實施例3中詳細(xì)描述的，在SEQ ID NO :33_44中示出的12個DMR中的8個的子集被選擇出來，并被識別，足以精確診斷在(在懷有三染色體21的胎兒的婦女的懷孕期間的)母體血液樣品中的三染色體21。用于本發(fā)明的所述染色體21診斷方法的在染色體21上的這8個優(yōu)選的DMR由以下組成堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO 43)和堿基對 37841284-37841411 (SEQ ID NO 44)。在多個其它實施方案中，所述多個DMR在選自以下的染色體上染色體13、染色體
18、X染色體和Y染色體，其允許這些染色體的任何一種的非整倍體性診斷。
對照的DMR也可以在本發(fā)明的診斷方法中使用。例如，所述診斷方法中可以包括另一個已知的高甲基化DMR，其作為高甲基化的對照。優(yōu)選的對照高甲基化區(qū)域包括CHR13 (HYPl)(其引物在 SEQ ID NO :25 和 26 中示出)，以及 CHR13 (HYP2)(其引物在 SEQ IDN0:27和28中示出)。此外，CHR13 (HYPl)的PCR產(chǎn)物的核苷酸擴(kuò)增序列在表8中和在SEQID N0:45中示出。此外或可選擇地，所述診斷方法可以包括另一種已知的低甲基化DMR，其作為低甲基化的對照。優(yōu)選的對照低甲基化區(qū)域包括CHR22 (Ul)(其引物在SEQ ID NO 29和30中示出)、以及CHR22(U2)(其引物在SEQ ID NO :31和32中示出)。此外，CHR22 (Ul)的PCR產(chǎn)物的核苷酸擴(kuò)增序列在表8中和在SEQ ID N0:46中示出。對照DMR以及其引物，在實施例I中進(jìn)一步被討論，在表6、7和8中進(jìn)一步被描述。在附錄A-E中示出的任意DMR的實際核苷酸序列容易從本文以及現(xiàn)有技術(shù)提供的信息獲得。更加具體的，每個在附錄A-E中示出的DMR通過在特定染色體上的起始和終止堿基對限定，例如上文描述的染色體21的“堿基對39279856-39280004”。已經(jīng)測定染色體.21、13、18、X和Y中的每一條完整核苷酸序列，并且已經(jīng)可以從公開的現(xiàn)有技術(shù)中獲得。例如，這5條染色體的每一條完整核苷酸序列可以從UCSC基因組瀏覽器數(shù)據(jù)庫(UCSCGenomeBrowser)第 36 版 Build 36 (http: //genome, ucsc. edu)中獲得。此外，在這 5 條染色體的每條中的特定起始和終止的堿基對位置可以被輸入到基因庫瀏覽器(Genome Browser)中，以獲得在染色體上的一段DNA核苷酸序列。此外，可以根據(jù)所述DMR的核苷酸序列，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，來設(shè)計檢測和/或擴(kuò)增DMR的寡核苷酸引物。因此，本文提供的所述信息，在附錄A-E中示出的所述每個DMR的起始和終止堿基對位置，以及由普通技術(shù)人員使用現(xiàn)有技術(shù)的其它染色體序列容易獲得的DMR的核苷酸序列，例如這些容易從UCSC基因庫瀏覽器(UCSC Genome Brower)獲得的序列，附錄A-E中示出的DMR的每條完整核苷酸序列此處都通過參考的方式并入本文。測定DMR的水平在所述即時診斷方法中，在所述高甲基化DNA從所述低甲基化DNA物理分離后，以及優(yōu)選的在對所述回收的高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，測定在所述高甲基化DNA樣品中的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，從而獲得所述高甲基化DNA樣品中的高甲基化值。如本文使用的，所述術(shù)語“測定所述多個DMR的水平”意思是測定所述DMR的數(shù)量(amount)、發(fā)生程度(prevalence)、或者拷貝數(shù)。其基礎(chǔ)是在具有胎兒非整倍體性的胎兒中，與正常胎兒相比，作為所述非整倍體的結(jié)果其具有大量的(即較高的拷貝數(shù))的DMR。在優(yōu)選的實施方案中，在所述高甲基化DNA樣品中的所述多個DMR的水平通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RealTime QPCR)測定，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)。代表性的，Real Time QPCR的非限定性條件在實施例中給出。在一個實施方案中，測定所述在未處理母體血液DNA總樣品中多個DMR的水平(例如通過Real Time QPCR)，作為LM-PCR效率的對照。如本文使用的，所述術(shù)語“未處理母體血液DNA總樣品”是指從母體血液獲得的DNA樣品，其沒有遭受處理(從所述低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA)。測定在所述高甲基化DNA樣品中的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，從而獲得所述高甲基化DNA樣品的高甲基化值。如本文使用的，所述術(shù)語“高甲基化值”意思是包括在所述樣品中DMR的水平的任意定量的表述。例如，從Real Time QPCR獲得的所述原始數(shù)據(jù)可以根據(jù)多種對照和數(shù)據(jù)統(tǒng)計進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得一種或多種描述在所述高甲基化DNA樣品中的多個DMR的每個的水平的數(shù)值。代表性的，可以在樣品中應(yīng)用的非限定性對照實施例和數(shù)據(jù)分析在實施例3中詳細(xì)描述。盡管如此，普通技術(shù)人員容易理解用于評估實施例3中數(shù)據(jù)的特定數(shù)據(jù)測試是代表性統(tǒng)計途徑，并且所述可以應(yīng)用于所述即時發(fā)明的可替代統(tǒng)計途徑是基于在實施例和圖形中提供的指導(dǎo)。與標(biāo)準(zhǔn)化參考值的比較一旦在存在于母體外周血的高甲基化胎兒DNA(也稱為檢測“DNA”)的高甲基化值被測定，這個值將被拿來與標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值(對于在所述檢測DNA中中相同多個DMR而言)作比較，然后根據(jù)這個比較結(jié)果，作出胎兒非整倍體性(或缺少這種胎兒非整倍體性)的診斷。
通常，將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與正常胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考聞甲基化值進(jìn)行比較，并且當(dāng)所述聞甲基化DNA樣品的所述聞甲基化值聞于正常胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值時，作出胎兒非整倍體性的診斷。也就是說，設(shè)置“正常”高甲基化值，其是根據(jù)從存在與母體外周血的正常胎兒DNA (即從沒有胎兒非整倍體性的胎兒中獲得的DNA)獲得的數(shù)據(jù)，然后當(dāng)所述檢測DNA的高甲基化值高于所述“正?！敝禃r，作出所述檢測樣品胎兒非整倍體性的診斷。更優(yōu)選的，用于與所述“檢測DNA”相比較的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值的測定，其使用來自懷有相應(yīng)胎齡的正常胎兒(即沒有胎兒非整倍體性的胎兒)的婦女母體外周血樣品(即沒有胎兒非整倍體性的胎兒)，例如，如果所述檢測DNA是來自3個月胎齡的胎兒，那么所述標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值的測定使用來自懷有3個月胎齡的正常胎兒的母體外周血樣品。例如，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值為“1”，那么如果所述檢測DNA的高甲基化值高于“I”表明其為非正常胎兒，而等于“I”或者小于“I”的高甲基化值表明其為正常胎兒。另外或者可選擇地，可以將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與胎兒非整倍體性的胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值進(jìn)行比較，當(dāng)所述檢測DNA的高甲基化值與胎兒非整倍體性胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值相當(dāng)時，作出胎兒非整倍體性的診斷。也就是說，可以設(shè)置“非正?！被蛘摺疤悍钦扼w性”的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值，根據(jù)從母體外周血的胎兒非整倍體性胎兒DNA(即來自具有胎兒非整倍體性的胎兒DNA)獲得的數(shù)據(jù)，當(dāng)所述檢測DNA的高甲基化值與“非正?！被蛘摺疤悍钦扼w性”的數(shù)值相當(dāng)(相似，在相同的范圍內(nèi))時，可以作出胎兒非整倍體性的診斷。為了建立正常胎兒的所述標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值，選擇了一組懷有健康胎兒的健康懷孕婦女。這些婦女具有相似的胎齡，其使用本發(fā)明的方法對于篩選條件(例如先兆子癇，胎兒染色體非整倍體和早產(chǎn))處于合適的懷孕期。與此相似，使用來自一組健康非懷孕婦女的樣品可以建立標(biāo)準(zhǔn)化參考值。選定的懷孕婦女和她們懷有的胎兒的健康狀態(tài)，通過建立好的、常規(guī)使用的方法(包括但不限於檢測婦女的血壓、記錄妊娠最初，和使用CVS和羊膜穿刺術(shù)進(jìn)行胎兒遺傳分析)確定。進(jìn)一步的，所選定組的懷有健康胎兒的健康懷孕婦女必須必須具有合理的大小，以確保正常胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。更優(yōu)選的，所述選定的組包括至少10個婦女。為了建立正常胎兒的所述標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值，來自這些懷有正常胎兒的母體血液樣品經(jīng)歷相同的步驟(a)和(b)(上文描述的診斷方法)，稱為從低甲基化DNA物理分離高甲基化DNA(沒有對所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化)以獲得高甲基化DNA樣品；然后測定在所述高甲基化DNA樣品中的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述高甲基化DNA樣品的高甲基化值。與此相似，“非正?！碧旱臉?biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值可以使用相同的途徑(如上文描述的建立“正?！碧旱臉?biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值)建立，除了用于建立所述“非正?！眳⒖贾档乃瞿阁w血液樣品是來自(其已經(jīng)使用傳統(tǒng)無創(chuàng)性診斷方法被測定懷有胎兒非整倍體性的胎兒的)懷孕婦女。這些實施例，特別是實施例3，以詳細(xì)的合適的數(shù)據(jù)分析途徑描述，所述途徑可以用來分析從DNA樣品中獲得的數(shù)據(jù)。例如，數(shù)據(jù)分析可以使用在實施例中詳細(xì)描述的曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney U test),費歇爾檢驗(Fisher test)和步進(jìn)模型分析(stepwisemodel analysis)。但是,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解用于評估在實施例中的數(shù)據(jù)的特定統(tǒng)計檢驗是代表性的統(tǒng)計途徑，并且本發(fā)明也可以根據(jù)在實施例和附圖中提供的指導(dǎo)來 應(yīng)用可選擇的統(tǒng)計途徑。II.三染色體21的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷檢驗在又一方面中，本發(fā)明提供三染色體21的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷檢驗(本文也稱為“NID21檢驗”)。如在實施例3中詳細(xì)討論的，已經(jīng)使用在實施例I和2中描述的DMR發(fā)展和證實了 NID21檢驗。在所述檢驗的發(fā)展過程中，染色體21上的12個DMR(如本文公開的)被檢驗，使用來自40個案例的母體血液樣品，20個正常和20個非正常(即從已知懷有三染色體21胎兒的婦女中)。所述結(jié)果的統(tǒng)計分析(如在實施例3中詳細(xì)描述的)顯示了最富有信息的染色體區(qū)域，證明了只有8個特定DMR(其來自總的起始檢驗的12個DMR)的檢驗足夠?qū)崿F(xiàn)100%敏感度和精確度，在所有正常和非正常案例的診斷中。因此，在又一方面中，本發(fā)明提供了使用母體外周血樣品進(jìn)行三染色體21的產(chǎn)前診斷方法，所述方法包括a)在母體外周血樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA和高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得高甲基化DNA樣品；b)在所述高甲基化DNA樣品中，測定在染色體21上的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述聞甲基化DNA樣品的聞甲基化值，其中在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的8個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，堿基對 44161178-44161323 (SEQID N0:34)，堿基對44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，堿基對 33320735-33320829 (SEQ ID N0:36)，堿基對42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，堿基對42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ ID N0:42)，堿基對44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，堿基對 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合，以及其中所述多個DMR的水平通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time QPCR)測定；c)將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與染色體21上的所述多個DMR的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值進(jìn)行比較；以及d)基于所述比較診斷三染色體21。
在優(yōu)選的實施方案中，在染色體21上的所述多個DMR由8個具有以下核苷酸序列的區(qū)域組成堿基對 33320735-33320829 (SEQ ID NO 36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQID NO :37)，堿基對42355712-42355815 (SEQ IDNO :38)，堿基對42357215-42357341 (SEQ IDNO 39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID NO 40)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ IDNO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO 43)和堿基對 37841284-37841411 (SEQ IDNO 44)。更優(yōu)選的，所述高甲基化DNA通過甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)從低甲基化DNA物理分離(在上文第I部分進(jìn)一步描述)。更優(yōu)選的，在高甲基化DNA從低甲基化DNA中物理分離之后，對所述高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增，例如通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)(如在第I部分詳細(xì)描述的)。在實施例3和表7中進(jìn)一步詳細(xì)描述了用于擴(kuò)增上文列出的染色體21的DMR的寡核苷酸引物，并且其在SEQ IDNO 1~24中列出。因此，所述診斷方法也可以使用對照DMR。例如，所述診斷方法可以包括已 知高甲基化的一種或多種DMR，作為高甲基化的對照。優(yōu)選的對照高甲基化區(qū)域包括CHR13 (HYPl)，其引物在SEQ ID NO :25和26中示出(并且其核苷酸序列在SEQ ID NO 45中示出);以及CHR13(HYP2)，其引物在SEQID NO :27和28中示出。另外或者可選擇地，另一個已知被低甲基化的DMR可以被包括在所述診斷方法中，作為低甲基化的對照。優(yōu)選的對照低甲基化區(qū)域包括CHR22 (Ul)，其引物在SEQ ID N0:29和30中示出(并且其核苷酸序列在SEQ ID N0:46中示出);以及CHR22 (U2)，其引物在SEQ ID NO :31和32中示出。對照DMR，及其引物在實施例I中被進(jìn)一步討論，并且在表6中進(jìn)一步被描述。在一個實施方案中，多個DMR的水平也在總未處理母體血液DNA樣品中測定作為LM-PCR效率的對照(如上文第I部分所描述的)。更優(yōu)選的，將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與正常胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值作比較，并且當(dāng)所述高甲基化DNA樣品的高甲基化值高于正常胎兒的所述標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值時，進(jìn)行三染色體21的診斷。也就是說，可以根據(jù)從存在于母體外周血的正常胎兒DNA(即從不具有胎兒非整倍體性的胎兒獲得的DNA)(如上文詳細(xì)描述的)中獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)定“正常的”高甲基化值(對于在染色體21上的多個DMR)，當(dāng)所述檢測DNA的高甲基化值高于所述“正?！敝禃r作出所述檢測樣品三染色體21的診斷。例如，在實施例3中已經(jīng)計算了所述12個DMR的“正常”高甲基化值，據(jù)此，選定了 8個優(yōu)選的DMR，其足夠允許在檢測樣品中三染色體21的精確診斷。另外或者可選擇地，可以將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與三染色體21胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值作比較，當(dāng)所述檢測DNA的高甲基化值可以與三染色體21胎兒的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值相比時，作出三染色體21的診斷。也就是說，可以設(shè)定“非正?！备呒谆?對于在染色體21上的多個DMR而言)，根據(jù)從三染色體21胎兒DNA (即從具有三染色體21的胎兒獲得的DNA)獲得的數(shù)據(jù)；并且當(dāng)所述檢測DNA的所述高甲基化值與所述“非正常值”相當(dāng)(相近，在相同的范圍內(nèi))時，作出所述檢驗樣品三染色體21的診斷。III.識別差異甲基化區(qū)域的方法在又一方面中，本發(fā)明提供識別差異甲基化區(qū)域(DMR)(其在胎兒DNA中高甲基化,在母體DNA中低甲基化)的方法，基于從低甲基化DNA中中的高甲基化DNA的物理分離。如在實施例I和2中的詳細(xì)描述，本文所描述的途徑已經(jīng)在染色體-范圍內(nèi)得到應(yīng)用，來識別多種在染色體21、13、18、X和Y上的差異甲基化區(qū)域，其在胎兒DNA中表現(xiàn)較高水平的甲基化(高甲基化)，相對于成年女性外周血DNA而言。此外，可以應(yīng)用這些相同的途徑來識別在這些相同染色體上的其他DMR和識別其它染色體上的新DMR。因此，在又一方面中，本發(fā)明提供一種適用于診斷胎兒非整倍體性的識別目標(biāo)染色體上差異甲基化區(qū)域(DMR)的方法，所述方法包括a)提供(i)正常成年女性外周血DNA樣品(PB樣品)；和(ii)正常胎盤DNA樣品(PL樣品)；b)在a)的每個樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述·高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得⑴分離的PB樣品；和(iii)分離的PL樣品;c)在b)的每個分離樣品中，測定目標(biāo)染色體上多個區(qū)域的水平；和d)選擇在所述分離的PB樣品中低甲基化和在所述分離的PL樣品中高甲基化的區(qū)域，從而識別所述目標(biāo)染色體上的差異甲基化區(qū)域(DMR)，其適合在本文描述的診斷方法中使用。在一個實施方案中，所述PL樣品包括兩種不同的樣品，早期妊娠PL樣品和晚期妊娠PL樣品，其中步驟d)進(jìn)一步包括選擇在所述早期妊娠分離的PL樣品和所述晚期妊娠分離的PL樣品中具有相等程度的甲基化的區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，所述目標(biāo)染色體是染色體21。在多個其它實施方案中，所述目標(biāo)染色體選自染色體13、染色體18、X染色體和Y染色體。更優(yōu)選的，所述非整倍體是三染色體。如本文使用的，“正常成年女性”是不具有染色體非整倍體性的女性。如本文使用的，“正常胎盤DNA”是來自不具有胎兒非整倍體性的胎兒胎盤的DNA。在每個樣品中，所述高甲基化DNA從低甲基化DNA物理分離，其沒有對所述高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，如上文第I部分詳細(xì)描述的。更優(yōu)選的，這種分離是使用甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)實現(xiàn)的，如在第I部分所描述的，以獲得所述“分離的”樣品。如本文使用的所述術(shù)語“分離的PB樣品”和“分離的PL樣品”是指所述部分的原始外周血樣品或者原始胎盤DNA樣品，其被認(rèn)為含有已經(jīng)從低甲基化DNA分離的高甲基化DNA。例如，當(dāng)使用MeDiP進(jìn)行分離，所述“分離的”樣品是已經(jīng)被免疫沉淀的部分的外周血或者胎盤DNA。更優(yōu)選的，在分離之后，擴(kuò)增所述分離的PB樣品和所述分離的PL樣品的DNA，更優(yōu)選的通過LM-PCR擴(kuò)增。因此，在這個實施方案中，連接末端是在分離之前通過平頭連接連接到所述DNA，并且在分離之后，使用識別連接末端的寡核苷酸引物(如上文第I部分中詳細(xì)描述的)，在所述分離的DNA樣品中進(jìn)行PCR。所述多個目標(biāo)染色體上的區(qū)域的水平在分離的樣品中被測定(如在上文第I部分中描述的)，更優(yōu)選的通過Real Time QPCR。也如同上文描述的，對照和統(tǒng)計分析可以被應(yīng)用到所述原始數(shù)據(jù)，以測定所述多個區(qū)域的高甲基化值。最后，為了識別在目標(biāo)染色體上的特定差異甲基化區(qū)域(DMR)，選定在來自正常成年女性的分離的外周血(PB)樣品中是低甲基化的而在來自正常胎兒的分離的胎盤(PL)中是高甲基化的區(qū)域。IV.本發(fā)明的試劑盒在又一方面中，本發(fā)明提供能用于本發(fā)明診斷方法的試劑盒。這種試劑盒通常包括至少一種試 劑和所述試劑盒的使用說明。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供三染色體21的產(chǎn)前診斷試劑盒，所述試劑盒包括a) 一種或多種核酸組合物，用以測定在染色體21上的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平；和b)使用所述核酸組合物進(jìn)行無創(chuàng)三染色體21的產(chǎn)前診斷的說明書?？梢赃x擇在染色體21上的所述多個DMR，例如在附錄A的列表中所示出的所述染色體21DMR。更優(yōu)選的，在染色體21上的所述多個DMR包括至少一個選自以下的區(qū)域堿基對 39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，堿基對 44161178-44161323 (SEQ ID N0:34)，堿基對44161239-44161371 (SEQID NO :35)，堿基對 33320735-33320829 (SEQ ID N0:36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ ID N0:42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，堿基對 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合。在其它實施方案中，在染色體21上的所述多個DMR包括兩個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、或10個或更多的上文所列出的區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，在染色體21上的所述多個DMR由分別具有以下序列的8個區(qū)域組成SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42、43和44。擴(kuò)增上文列出的12個DMR的寡核苷酸引物在實施例3和表7中進(jìn)一步詳細(xì)描述，并且在SEQ ID NO 1~24示出。因此，在所述試劑盒優(yōu)選的實施方案中，所述核酸序列包括選自SEQ IDNO 1-24的一種或多種寡核苷酸引物及其組合。此外，一種或多種擴(kuò)增對照高甲基化或低甲基化區(qū)域的寡核苷酸引物可以被包括在所述試劑盒內(nèi)。例如，優(yōu)選的對照高甲基化區(qū)域包括CHR13 (HYPl)和 CHR13(HYP2) ;CHR13 (HYPl)的引物在 SEQ ID NO :25 和 26 (并且其具有的核酸序列在SEQ ID N0:45中示出)中示出；CHR13(HYP2)的引物在SEQ ID N0:27和28中示出。優(yōu)選的對照甲基化區(qū)域包括CHR22 (Ul)和CHR22(U2) ；CHR22(U1)的引物在SEQ IDNO 29和30中示出(并且其具有的核酸序列在SEQ ID NO :46中示出；CHR22(U2)的引物在SEQID NO 31和32中示出。對照DMR及其引物，在實施例I中被進(jìn)一步討論，并且在表6中被進(jìn)一步描述。在又一實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA的方法，其沒有對在血液樣品中的所述高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化。優(yōu)選的從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA的方法包括免疫沉淀甲基化DNA的抗體，例如與5-甲基胞喃唳特異結(jié)合的抗體。在又一實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括高甲基化DNA的擴(kuò)增方法。優(yōu)選的高甲基化DNA的擴(kuò)增方法包括寡核苷酸連接體和/或進(jìn)行連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)的寡核苷酸引物。V.核酸組合物在又一方面中，本發(fā)明提供在本發(fā)明所述方法和試劑盒的核酸組合物。這些核酸組合物對于檢測DMR是有效的。例如，在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸組合物包括一種或多種寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物能有效擴(kuò)增本發(fā)明一種或多種DMR，例如選自附錄A中的列表一種或多種DMR。更優(yōu)選的，所述寡核苷酸引物是“隔離的”，意思是它們是從其它具有不同(預(yù)期外的)特異性的引物中純化出的、或分離出的，從其它具有不同。此外，所述“隔離的”寡核苷酸引物是從其它核酸中純化出來、或者分離出來，所述核酸可能側(cè)翼具有所述引物序列并存在于天然或原生的位置中，例如在染色體DNA中或者其它核酸的天然或原生形式中。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供包括一種或多種隔離的寡核苷酸引物的核酸組合物，用于擴(kuò)增EP1-EP12 (如在表7中描述的)的DMR，選自以下組GCTGGACCAGAAAGTGTTGAG(SEQ ID NO : I)，GTGTGCTGCTTTGCAATGTG (SEQ ID NO :2)，GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT(SEQ ID NO :3)，CCACCGTCACTGTTCCTAGA(SEQ ID NO :4)，CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO 5), GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO :6)，CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO :7)，CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO :8)，TGCAGGATATTTGGCAAGGT(SEQ ID NO :9)，CTGTGCCGGTAGAAATGGTT(SEQ ID NO :10)，TGAATCAGTTCACCGACAGC(SEQ ID NO 11), GAAACAACCTGGCCATTCTC(SEQ ID NO :12)，·CCGTTATATGGATGCCTTGG(SEQ ID NO 13), AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ ID NO :14)，CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO 15), ACCATGCTCAGCCAATTTTT(SEQ ID NO :16)，GACCCAGACGATACCTGGAA(SEQ ID NO 17), GCTGAACAAAACTCGGCTTC(SEQ ID NO :18)，CCACATCCTGGCCATCTACT(SEQ ID NO : 19)，TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ ID NO :20)，TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO :21)，CCCCACAGGGTTCTGGTAAT(SEQ ID NO :22)，ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO :23)，TTATGTGGCCTTTCCTCCTG (SEQ ID NO: 24)，及其組
八
口 ο在又一實施方案中，本發(fā)明提供包括一種或多種隔離的寡核苷酸引物的核酸組合物(用于擴(kuò)增對照高甲基化或低甲基化區(qū)域)，選自CAGGAAAGTGAAGGGAGCTG (SEQID NO 25), CAAAACCCAATGGTCAATCC(SEQ ID NO :26)，AATGATTGTGCAGGTGGTGA(SEQ IDNO 27), GAGCGCCTTGAGTAGAGGAA(SEQ ID NO :28)，AAGGTGCCCAATTCAAGGTA(SEQ ID NO:29)，CTTCCCCACCAGTCTTGAAA(SEQ ID NO :30)，TGAGAGCGGATGACAGATTG(SEQ ID NO :31)，GGTCCCTCCCTTTTCTGTCT(SEQ ID NO:32)，及其組合。VI.實施例本發(fā)明通過下文的非限制性的實施例進(jìn)一步解釋。本申請涉及的所有的參考文獻(xiàn)、附錄、基因庫(Genbank)整體、引用的專利和公開專利申請都以它們整體通過參考的方式并入本文。實施例I :在胎盤和外周血之間差異甲基化位點的識別在這個實施例中，識別了染色體13、18、21、X和Y中的差異甲基化區(qū)域(DMR)，使用具有高分辨率的系統(tǒng)稱合的tiling寡核苷酸陣列(tilingoligonucleotide array)分析，能夠高通量染色體范圍地識別DNA甲基化模式。在這個實施例中描述的實驗其描述頁參見于Papageorgiou, E. A.等(2009)Am. J. Pathol. 174 :1609-1618,其全部內(nèi)容,包括所有增補(bǔ)的數(shù)據(jù)和材料，都清禁地通過參考的方式并入本文。
材料和方法人類樣品在這項研究中使用的樣品是從AMS生物技術(shù)(歐洲)有限公司(牛津郡，英國)獲得的。這些最初來源于所述Biochain Institute (Hayward, CA)的樣品，同意使用經(jīng)過倫理審查委員會(ethical Internal Review Board, I RB)核準(zhǔn)的協(xié)議書?？偣?，這項研究中使用了 5份正常女性外周血樣品和5份正常胎盤DNA樣品。所述胎盤DNA樣品的3個從早期妊娠中(懷孕的前3個月)獲得，其中一個來自女性胎兒妊娠，其中兩個來自男性胎兒妊娠。剩余的2個胎盤DNA樣品來自后期妊娠(懷孕的后3個月)中獲得，其中一個來自女性胎兒妊娠，另一個來自男性胎兒妊娠。MeDiP分析聯(lián)合LM-PCR擴(kuò)增 所述MeDIP 分析(Weber, Μ.等(2005)Nat. Genet. 37 :853-862)之后接著進(jìn)行連接-介導(dǎo)的 PCR(LM-PCR)，如在 Ren，B.等(2000) Science益:2306-2309 和 Oberley,M.J.等(2005) Methods Enzvmol. 376 :315-334,中描沭的，伯是帶有其它修飾。簡而言之，在100 μ I總體積中的2. 5 μ gDNA最初通過超聲波剪切成約300bp-1000bp大小，使用 Virsonic300sonicator (Virtis ；Gardiner, NY)。所述破碎的 DNA 在與以下物質(zhì)混合后是平頭末端1X NEB 緩沖劑 2(New England BioLabs ;Ipswich, UK)、IOX BSA(NewEnglandBioLabs ;Ipswich, UK)、IOOmM dNTP 混合物、T4DNA 聚合酶(3U/ μ I) (NewEnglandBioLabs ；Ipswich, UK)、以及蒸餾水達(dá)到終體積為120 μ I。在12°C孵育20分鐘后，所述反應(yīng)根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用所述DNA Clean和Concentrator-5 (Zymo Research Corp ；Glasgow, Scotland)清理干凈。但是,所述最終的洗脫步驟在30 μ I的EB緩沖劑中進(jìn)行,其由QiAquick PCR純化試劑盒(Qiagen ；ffest Sussex,UK)提供。然后將所述被清理的樣品與以下物質(zhì)混合40μ I的退火連接體(50 μ Μ) (SIGMA Genosys ；Gillingham, UK)(所述退火連接體的描述參見 Ren，B.等(2000) supra, Oberley, M. J.等(2004) supra)、T4DNA 連接酶IOX 緩沖劑(Roche ；Mannheim, Germany)、6μ I 的 T4DNA 連接酶(5U/ μ I) (Roche ；Mannheim,Germany)、以及蒸懼水直到終體積為101 μ I。所述樣品然后在16°C孵育過夜，以允許連接上街頭。所述樣品的純化使用上文描述的DNA Clean和Concentrator-5 進(jìn)行。然后將所述洗脫的樣品與 IOOmM dNTP 混合物、Ix PCR Gold Buffer (Roche ;Mannheim, Germany)、I. 5mM MgCl2 (Roche ；Mannheim, Germany)和 5U AmpliTaq 聚合酶混合。然后將所述樣品在70°C下孵育10分鐘以填充DNA突出臂，使用上文描述的DNA Clean和Concentrator-5 進(jìn)行純化。50ng的DNA被遷移和作為輸入基因組對照DNA保留。所述剩余的連接的DNA樣品(700ng-l. 2 μ g)經(jīng)歷了如上文所描述的MeDiP (Weber, Μ.等(2005) supra),所述反應(yīng)按比例縮小。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，對所述免疫沉淀的DNA樣品使用所述DNA Clean和Concentrator-5 (使用700 μ I結(jié)合緩沖劑)進(jìn)行清理。連接-介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)使用IOng的每個輸入量和免疫沉淀DNA碎片，使用Advantage-GC Genomic PCRi式劑盒(Clontech ;Saint-Germain-en_Laye,France)進(jìn)行。所應(yīng)用的熱循環(huán)條件是95°C、2分鐘，20個循環(huán)(94°C、30秒和68°C、3分鐘)，以及68°C、10分鐘。在PCR擴(kuò)增之后,所述反應(yīng)使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen ;West Sussex,UK)純化，然后在50 μ I的蒸餾水中預(yù)熱到50°C。雜交陣列
所述輸入和所述免疫沉淀DNA碎片被送到Roche NimbleGen Inc (Reykjsvik,Iceland)進(jìn)行雜交，所述輸入和所述免疫沉淀DNA碎片來自于女性外周血DNA樣品、第3期妊娠胎盤DNA樣品和第I期妊娠胎盤DNA樣品(兩個胎盤樣品都從男性胎兒妊娠獲得)。所使用的陣列平臺是高精度tiling寡核苷酸陣列，其對染色體13、18、21、X和Y具有特異性，其中染色體13具有225bp的平均探針間距(median probe spacing),染色體18具有170bp的平均探針間距，染色體21具有70bp的平均探針間距，染色體X具有340bp的平均探針間距，染色體Y具有20bp的平均探針間距。簡而言之，每個樣品的輸入基因組對照DNA和免疫沉淀DNA都用熒光染料(Cy3，Cy5)差異標(biāo)記，然后將其在寡核苷酸陣列上共雜交。所述原始數(shù)據(jù)在ArrayEroressftittD:// www. ebi. ac. uk/microarray-as/ae/)中取出，其登陸號(accession number)E-TABM-507。TilinR寡核苷酸陣列的數(shù)據(jù)分析
為了計算胎盤和外周血之間的相對甲基化差異，從外周血DNA中獲得的所述寡核苷酸陣列標(biāo)準(zhǔn)化的Iog2的比率值(免疫沉淀對輸入分?jǐn)?shù))，是從來自胎盤DNA中使用R統(tǒng)計計算環(huán)境(http://www. r-pro ject. orR)獲得的Iog2的比率值(免疫沉淀對輸入分?jǐn)?shù))中減去的。正差異代表在胎盤DNA中的相對高甲基化，負(fù)差異代表相對低甲基化。然后建立所述被減去的Iog2比率值數(shù)據(jù)(log2ratio data)的通用特征格式(General FeatureFormat, GFF)的文件，其結(jié)果使用 SignalMap viewer (NimbleGen system ；Reykjsvik,Iceland)顯示，并結(jié)合染色體13、18、21、X和Y的基因、CpG島和CG含量?；驍?shù)據(jù)從Ensembl 基因組瀏覽器(NCBI build36) (http://www. ensembl. orR.)下載下來，而所述CpG 島和 CG 含量從 UCSC 基因組瀏覽器，(NCBI build36) (http: //Renome. ucsc. edu.)下載下來。為了對在外周血和胎盤之間的明顯差異甲基化富集區(qū)域的進(jìn)行自動選擇，我們使用所述Smith-Waterman動態(tài)規(guī)劃算法,所述Smith-Waterman動態(tài)規(guī)劃算法適合于Array-CGH(Sff-ARRAY)，其先前曾被用于 CopyNumber Variation (CNV)的調(diào)用(Price,T.S.等(2005)Nucleic Acids Res. 16 :3455-3464) 這種算法被用于識別連續(xù)寡核苷酸的片段或“島”，其顯示在胎盤DNA中相對于外周血DNA的甲基化富集或甲基化缺失。每個寡核苷酸陣列數(shù)據(jù)的分析以染色臂為單位。檢測在O. 2和I之間的SW-ARRAY的閾值(tj，以識別相對高分的片段或者“島”的調(diào)用最適值，根據(jù)對至少兩個連續(xù)寡核苷酸(其具有相同甲基化狀態(tài)，并在從不同的閾值Utl)獲得的分值中顯示最高分)的識別。直接比較由SW-ARRAY識別的差異甲基化區(qū)域、基因位置、啟動子區(qū)域(其被定義為在每個基因的5’端的上游2kb的區(qū)域)和CpG。同時識別所述基因組的差異甲基化區(qū)域的上述分析，其利用MeDiP作為富集方法，然后進(jìn)行用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的拷貝數(shù)(即用于例如三染色體21的識別)的定量分析，其選定的區(qū)域在所述胎兒內(nèi)是高甲基化的，這很重要。因此，我們識別所有區(qū)域，其中所述免疫沉淀對于輸入的比率在所述胎盤中是正的，在所述外周血樣品中是負(fù)的(在所述胎盤中高甲基化)。對于其它被調(diào)查的其它分析系統(tǒng)，其要求在胎盤中有低甲基化DNA，因此我們記錄所有區(qū)域(其中所述免疫沉淀對于輸入的比率在所述胎盤中是負(fù)的，在所述外周血樣品中是正的)。為了實現(xiàn)這個，從從胎盤DNA(只有這里所述比率值的標(biāo)志是不同的)獲得所述Iog2比率值(免疫沉淀對于輸入分?jǐn)?shù))中，減去從外周血DNA獲得的所述寡核苷酸陣列標(biāo)準(zhǔn)化的Iog2比率值(免疫沉淀對于輸入分?jǐn)?shù))。小量在胎盤中的最大差異甲基化區(qū)域(在染色體21上的8個區(qū)域和在染色體18上的一個區(qū)域加上所述SERPINB5啟動子區(qū)域)，是從這些數(shù)據(jù)中選擇出來，以設(shè)置這些數(shù)據(jù)通過使用任意的大于I. O的微分比率(至少一個連續(xù)探針顯示其Iog2比率值> I)進(jìn)一步確定和分析其發(fā)展。TilinR寡核苷酸陣列數(shù)據(jù)通過使用實時定暈PCR的i正實在染色體21上和染色體18上選定的甲基化富集區(qū)域通過實時定量PCR證實。對于這個目的，我們使用5個女性外周血DNA樣品和5個胎盤DNA樣品，兩者都具有第一期(妊娠前3個月)和第三期(妊娠后3個月)妊娠胎齡。使用primerf網(wǎng)頁地址(http://frodo. wi. mit. edu/.),設(shè)計目標(biāo)區(qū)域的特異性引。所述因為設(shè)計被最優(yōu)化，使產(chǎn)物在80-150bp的長度，如同優(yōu)化SYBR綠色熒光溶解曲線分析所推薦的。另外，所有引物的Tm值被選定為接近60°C。引物序列和PCR產(chǎn)物序列的特性通過使用Blat將其繪圖到所述人類參考序列上進(jìn)行確認(rèn)。引物購買自Sigma Genosys (Gillingham, UK)。每種定量PCR反應(yīng)在終體積為25 μ I中進(jìn)行，其內(nèi)伴隨有20ng的免疫沉淀甲基·化DNA或者輸入基因組DNA.。我們使用SYBR Green PCR master混合液(Eurogentec ;Seraing, Belgium)和 ABI Prism 7900HT 序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)。在使用正?；蚪MDNA檢測一系列的稀釋液(150-900nM)后，選定每種引物的最初濃度。對每個選定的引物濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線在I : 2系列稀釋(200ng下至3. 125ng)上計算，最終，所述樣品反應(yīng)物按一式三份進(jìn)行。所述擴(kuò)增程序由以下組成2分鐘、50°C和10分鐘、95°C，接著進(jìn)行40個循環(huán)；所述每個循環(huán)包括15秒的95°C變性、以及I分鐘的60°C退火/延伸。在擴(kuò)增之后，溶解曲線分析通過加熱所述反應(yīng)混合物從60加熱至95°C (以O(shè). 2°C /s的速率)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物是通過瓊脂糖凝膠電泳常規(guī)檢驗非特異性產(chǎn)物。為了評估在MeDiP后的靶標(biāo)序列的富集，我們計算了在所述檢驗DNA(免疫沉淀的或輸入的DNA) (Cltest)和未處理正常基因組DNA(CT_tMl)(在所述免疫沉淀的DNA對于輸入的基因組DNA中)之間的計算循環(huán)差值(ACT)，(ACT = CT_tMl_CTtest)。另外，為了評估胎盤樣品相對于外周血的甲基化富集，我們計算了胎盤免疫沉淀的DNA對于外周血免疫沉淀的DNA的比率值。而且，我們的寡核苷酸陣列結(jié)果表明的在外周血和胎盤DNA樣品中具有相似DNA甲基化狀態(tài)的對照區(qū)域，在每次跑膠中使用，以檢測可能的MeDiP或者PCR擴(kuò)增偏差。在單個個體之間或在技術(shù)重復(fù)試驗之間的甲基化富集的變異性中間值(median variability)和重復(fù)性中間值(medianreproducibility)的獲得,是通過計算所有不同檢驗樣品或者特定區(qū)域的技術(shù)副本之間的比率值的平均值(平均的IP/INPUT)，然后每個比率值被所述平均比率值除，從而獲得每次檢驗的重復(fù)性(其表示為百分?jǐn)?shù))(IPi/INPUTi)/mean (IPi/INPUTi, IPi i/INPUTii,...)=Ri(IPi :所述“ith”樣品的免疫沉淀的，INPUTi :所述“ith”樣品的輸入的DNA，RI =所述“ith”樣品的重復(fù)性)。所述重復(fù)性中間值(median reproducibility)通過計算所有所述不同的重復(fù)性值的中間值得到median(Ri, Riis,...)。最后,所述變異性(variability)通過使用以下公式計算(I-Ri)xlOO = Vi,以及變異性中間值(median variability)median (Vi, Vii, . . .). (Vi =所述“ith” 樣品的變異性)。結(jié)果差異甲基化標(biāo)記侯詵物的詵擇在胎盤和外周血DNA樣品中獲得染色體13、18、21、X和Y標(biāo)準(zhǔn)化寡核苷酸陣列Iog2的比率值，并最初用來計算胎盤和外周血DNA之間的比例差值(相對甲基化)。我們用SW-ARRAY來識別外周血和胎盤之間的差異甲基化區(qū)域。在所有染色體中，發(fā)現(xiàn)的用于區(qū)域鑒定的最佳SW-ARRAY起點為O. 9。分別對于染色體21、13、18、X和Y而言，由SW-ARRAY分析確定的外周血DNA中第一孕期和第三孕期的差異甲基化區(qū)域，如附錄A-E所示。我們發(fā)現(xiàn)，確定的高甲基化區(qū)域數(shù)目約等于所有五個染色體測定的高甲基化區(qū)域的總數(shù)目，總結(jié)見下表I。此外，第一和第三孕期胎盤的差異甲基化區(qū)域的總數(shù)是可以相比的，概括為下表I?；蛭恢玫淖R別位點、啟動子區(qū)、以及CpG島位置的直接關(guān)系，顯示在附錄A-E中。表I :在染色體13、18、21、X和Y之間，與外周血DNA樣品相比，胎盤中的差異甲基化區(qū)域。
' ------------------ - ----
HYPER.的 HYPO. 總 HYPER^ HYPO 的
CHR.*妊娠期
N°f的 N0J N0. %§%||
13 第一期 13101336 2646 49.550,5
13 第三期 13111318 2629 49.950.1
18 第一期 19671888 3855 51.048.9
18 第三期 19571944 3901 50.249.8
21 第一期 10631015 2078 51.148.8
21 第三期 10421040 2082 50.049.9
X 第一期 19921951 3943 50.549.5
X 第三期 19951989 3984 50,149.9
Y第一期 11921120 2312 51.648.4
Y笫三期 1986 1990 3976 49.950.0*染色體汴高基化區(qū)域數(shù)量；；|低基化區(qū)域數(shù)量；§高基化區(qū)域百分比；11低基化區(qū)域百分比；已識別區(qū)域的17. 5-43. 6%位于基因內(nèi)部，而且在不同染色體之間以及不同的孕期內(nèi)，他們的甲基化狀態(tài)不同，總結(jié)如下表2。對13號和Y染色體而言，大多數(shù)差異甲基化區(qū)域(位于基因內(nèi))是在第一孕期胎盤中被低甲基化，但是大多數(shù)在第3孕期胎盤中變成高甲基化。在21號和X染色體中，大多數(shù)區(qū)域在第一和第三孕期胎盤中都為低甲基化，而在18號染色體內(nèi)發(fā)現(xiàn)高甲基化和低甲基化的區(qū)域數(shù)目相等，總結(jié)如下表2。表2 :染色體13、18、21、X和Y內(nèi)基因的差異甲基化區(qū)域。
權(quán)利要求
1.一種使用母體血液樣品進(jìn)行產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體性的方法，所述方法包括 a)在母體血液樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得高甲基化DNA樣品； b)在所述高甲基化DNA樣品中，測定多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述高甲基化DNA樣品的聞甲基化值； c)將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與所述多個DMR的標(biāo)準(zhǔn)化參考高甲基化值進(jìn)行比較；以及 d)基于所述比較診斷胎兒非整倍體性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述母體血液樣品是母體外周血樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中高甲基化DNA通過甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)從低甲基化DNA中物理分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在高甲基化DNA從低甲基化DNA中物理分離之后，對所述高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述高甲基化DNA通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)擴(kuò)增。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述多個DMR選自附錄A-E中的列表。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中對于至少3個DMR，測定所述多個DMR的水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中對于至少5個DMR，測定所述多個DMR的水平。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中對于至少8個DMR，測定所述多個DMR的水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中對于至少10個DMR，測定所述多個DMR的水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任意一項所述的方法，其中所述多個DMR選自附錄A-E中的列表。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述高甲基化DNA樣品中的所述多個DMR的水平通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time QPCR)測定。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中多個DMR的水平也在總未處理的母體血液DNA樣品中測定作為LM-PCR效率的對照。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與正常母體血液DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值進(jìn)行比較，并且當(dāng)所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值高于所述正常母體血液DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值時，進(jìn)行胎兒非整倍體性的診斷。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中對于三染色體21的診斷，所述多個DMR在染色體21上。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的3個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，堿基對44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，堿基對42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，堿基對22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，堿基對37841284-37841411 (SEQ ID NO :44)，及其組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的8個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，堿基對44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，堿基對42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，堿基對22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，堿基對37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在染色體21上的所述多個DMR由8個具有以下核苷酸序列的區(qū)域組成堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36)，堿基對42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，堿基對42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)和堿基對37841284-37841411(SEQ ID NO :44)。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述多個DMR在選自以下的染色體上染色體13、染色體18、X染色體和Y染色體。
20.一種使用母體外周血樣品進(jìn)行三染色體21產(chǎn)前診斷的方法，所述方法包括 a)在母體外周血樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得高甲基化DNA樣品； b)在所述高甲基化DNA樣品中，測定在染色體21上的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平，以獲得所述聞甲基化DNA樣品的聞甲基化值， 其中，在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的8個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，堿基對 44161178-44161323 (SEQ ID NO:34)，堿基對44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，堿基對 33320735-33320829 (SEQ ID NO:36)，堿基對42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，堿基對 32268843-32268943 (SEQ ID NO:42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，堿基對 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合，以及 其中，所述多個DMR的水平通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time QPCR)測定； c)將所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與染色體21上的所述多個DMR的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值進(jìn)行比較；以及 d)基于所述比較診斷三染色體21。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中高甲基化DNA通過甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)從低甲基化DNA物理分離。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，在對高甲基化DNA從低甲基化DNA中物理分離之后，對所述高甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述高甲基化DNA通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)擴(kuò)增。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中多個DMR的水平也在總未處理母體血液DNA樣品中測定作為LM-PCR效率的對照。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述高甲基化DNA樣品的所述高甲基化值與正常母體血液DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考高甲基化值進(jìn)行比較，并且當(dāng)所述高甲基化DNA樣品的所述聞甲基化值聞于所述正常母體血液DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)化正常參考聞甲基化值時，進(jìn)行三染色體21的診斷。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在染色體21上的所述多個DMR由8個具有以下核苷酸序列的區(qū)域組成堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36)，堿基對42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，堿基對42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)和堿基對37841284-37841411(SEQ ID NO :44)。
27.一種適用于診斷胎兒非整倍體性的識別目標(biāo)染色體上差異甲基化區(qū)域(DMR)的方法，所述方法包括 a)提供 (i)正常成年女性外周血DNA樣品(PB樣品)；和 ( )正常胎盤DNA樣品(PL樣品)； b)在a)的每個樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化，以獲得 ⑴分離的PB樣品；和 (iii)分離的PL樣品； c)在b)的每個分離樣品中，測定目標(biāo)染色體上多個區(qū)域的水平；以及 d)選擇在所述分離的PB樣品中低甲基化的區(qū)域和在所述分離的PL樣品中高甲基化的區(qū)域，從而識別所述目標(biāo)染色體上的差異甲基化區(qū)域(DMR)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PL樣品包括兩種不同的樣品-早期妊娠PL樣品和晚期妊娠PL樣品，其中步驟d)進(jìn)一步包括選擇在所述早期妊娠分離的PL樣品和所述晚期妊娠分離的PL樣品中具有相等程度的甲基化的區(qū)域。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述目標(biāo)染色體是染色體21。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述目標(biāo)染色體選自染色體13、染色體18、X染色體和Y染色體。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述非整倍體性是三染色體性或者單染色體性。
32.—種三染色體21的產(chǎn)前診斷試劑盒，所述試劑盒包括 a)一種或多種核酸組合物，其用以測定在染色體21上的多個差異甲基化區(qū)域(DMR)的水平；以及 b)使用這種核酸組合物進(jìn)行染色體21的產(chǎn)前診斷的說明書。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中在染色體21上的所述多個DMR選自在附錄A-E中的列表。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的3個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，堿基對44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，堿基對42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，堿基對22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，堿基對37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合。
35.根據(jù)權(quán)利要求3 2所述的試劑盒，其中在染色體21上的所述多個DMR包括選自以下的8個或多個區(qū)域堿基對39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，堿基對44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，堿基對 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，堿基對33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，堿基對 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，堿基對42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，堿基對 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，堿基對22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，堿基對 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，堿基對37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其組合。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中在染色體21上的所述多個DMR由8個具有以下核苷酸序列的區(qū)域組成堿基對33320735-33320829(SEQ ID NO :36)，堿基對42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，堿基對 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，堿基對42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，堿基對 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，堿基對32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，堿基對44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)和堿基對37841284-37841411(SEQ ID NO :44)。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中所述核酸組合物包含選自以下的一種或多種寡核苷酸引物 GCTGGACCAGMAGTGTTGAG (SEQ ID NO I), GTGTGCTGCTTTGCMTGTG (SEQ ID NO 2), GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT (SEQ ID NO 3), CCACCGTCACTGTTCCTAGA (SEQ ID NO:4)，CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO 5), GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO:6)，CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO 7), CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO:8)，TGCAGGATATTTGGCAAGGT (SEQ ID NO 9), CTGTGCCGGTAGAAATGGTT (SEQ ID NO 10)，TGAATCAGTTCACCGACAGC (SEQ ID NO 11), GAAACAACCTGGCCATTCTC (SEQ IDNO 12),CCGTTATATGGATGCCTTGG (SEQ ID NO 13),AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ IDNO 14),CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO 15),ACCATGCTCAGCCAATTTTT (SEQ IDNO 16),GACCCAGACGATACCTGGAA (SEQ ID NO 17),GCTGAACAAAACTCGGCTTC (SEQ IDNO 18),CCACATCCTGGCCATCTACT (SEQ ID NO 19),TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ IDNO 20),TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO 21),CCCCACAGGGTTCTGGTAAT (SEQ IDNO 22),ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO 23),TTATGTGGCCTTTCCTCCTG(SEQ ID NO 24)，及其組合。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括這樣的構(gòu)件，該構(gòu)件用于在血液樣品中從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA進(jìn)行化學(xué)改變或酶消化。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中使所述從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA的構(gòu)件包括免疫沉淀甲基化DNA的抗體。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增高甲基化DNA的構(gòu)件。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑盒，其中用于擴(kuò)增所述高甲基化DNA的構(gòu)件包括執(zhí)行連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(LM-PCR)的寡核苷酸連接體或者寡核苷酸引物。
42.—種核酸組合物,包含選自以下的一種或多種分離的寡核苷酸引物 GCTGGACCAGMAGTGTTGAG (SEQ ID NO I), GTGTGCTGCTTTGCMTGTG (SEQ ID NO 2), GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT (SEQ ID NO 3), CCACCGTCACTGTTCCTAGA (SEQ ID NO:4)，CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO 5), GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO:6)，CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO 7), CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO:8)，TGCAGGATATTTGGCAAGGT (SEQ ID NO 9), CTGTGCCGGTAGAAATGGTT (SEQ ID NO 10)，TGAATCAGTTCACCGACAGC (SEQ ID NO : 11)，GAAACAACCTGGCCATTCTC (SEQ IDNO 12),CCGTTATATGGATGCCTTGG (SEQ ID NO 13),AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ IDNO 14),CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO 15),ACCATGCTCAGCCAATTTTT (SEQ IDNO 16),GACCCAGACGATACCTGGAA (SEQ ID NO 17),GCTGAACAAAACTCGGCTTC (SEQ IDNO 18),CCACATCCTGGCCATCTACT (SEQ ID NO 19),TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ IDNO 20),TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO 21),CCCCACAGGGTTCTGGTAAT (SEQ IDNO 22),ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO :23)，TTATGTGGCCTTTCCTCCTG(SEQ ID NO 24)，及其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供胎兒非整倍體性無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法和組合物。識別了多種差異甲基化區(qū)域(DMR)。某些所述的DMR在成人女性血液DNA中低甲基化，在胎兒DNA中高甲基化；而其它的在成年女性血液DNA高甲基化，在胎兒DNA低甲基化。此外，在成人女性血液DNA中低甲基化并且在胎兒DNA中高甲基化的DMR，已經(jīng)表明，以精確預(yù)測存在于妊娠期母體血液樣品中胎兒DNA的非整倍體性。在本發(fā)明的方法中，高甲基化DNA優(yōu)選通過甲基化DNA免疫沉淀從低甲基化DNA中物理分離。
文檔編號C12Q1/68GK102892899SQ201180009757
公開日2013年1月23日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者P·C·帕特薩里斯, E·A·帕帕喬治烏 申請人:Nipd遺傳學(xué)有限公司