專利名稱：改善需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性的制作方法
改善需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性相關(guān)串請的交叉引用本專利申請要求于2010年2月17日提交的美國專利臨時申請61/305，333的權(quán)益，其全文以引用的方式并入本文。序列表信肩、本專利申請附帶以電子方式提交的存于ASCII碼文本文件CL4842sequencelisting. txt的序列表的內(nèi)容,其全文以引用的方式并入本文。發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及微生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，具體地酵母細(xì)胞，其包含二羥酸脫水酶多肽。本發(fā)明也涉及重組宿主細(xì)胞。由于增加了多肽的表達(dá)、細(xì)胞中Fe-S簇的生物合成活性的調(diào)控、或它們的組合的原因，所述宿主細(xì)胞具有增加的二羥酸脫水酶多肽比活性。本發(fā)明也包括使用所述宿主細(xì)胞的方法，以及在宿主細(xì)胞中鑒定多肽的方法，所述多肽增加了 Fe-S簇的生物合成途徑中的通量。
背景技術(shù)：
鐵-硫(Fe-S)簇作為輔因子或輔基，對這類含F(xiàn)e-S簇蛋白質(zhì)的正常功能是必需的。在此類含F(xiàn)e-S簇蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)Fe-S簇有多個重要作用。當(dāng)此類蛋白質(zhì)在細(xì)胞中第一次合成時，他們?nèi)狈Φ鞍踪|(zhì)正確功能所必需的Fe-S簇，被稱為脫輔基蛋白質(zhì)。Fe-S簇是在由參與Fe-S簇生物合成的蛋白質(zhì)催化的一系列反應(yīng)中形成的，并且傳遞給脫輔基蛋白質(zhì)以形成功能的含F(xiàn)e-S簇全蛋白質(zhì)。一個需要有Fe-S簇才能具備正常功能的此類蛋白質(zhì)是二羥酸脫水酶(DHAD)(E. C. 4. 2. I. 9)。DHAD催化2，3- 二羥基異戊酸被轉(zhuǎn)化成α _酮異戊酸，并且2，3- 二羥基戊酸甲酯轉(zhuǎn)化成α-酮戊酸甲酯。所述DHAD酶為天然存在的生物合成途徑中的一部分，該生物合成途徑產(chǎn)生支鏈氨基酸(即纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)和泛酸(維生素Β5)。DHAD催化的2，3- 二羥基異戊酸被轉(zhuǎn)化成α -酮異戊酸也是眾多異丁醇生物合成途徑中的一個普通步驟，其公開于美國專利公開申請公布US20070092957A1中，以引用方式并入本文。其中公開了例如用于生產(chǎn)異丁醇的重組微生物工程。高水平的DHAD酶活可期待增加來自生物合成途徑的產(chǎn)品產(chǎn)量，其包括這種酶活性，包括例如增大的支鏈氨基酸、泛酸和異丁醇的微生物產(chǎn)量。異丁醇具體地用作燃料添加齊U，并且其易獲得性可減少對于石化燃料的需求。然而，由于所有已知的DHAD酶需要Fe-S簇以具有功能，它們必須在具有可提供這些蛋白質(zhì)所需Fe-S簇的遺傳機(jī)制的宿主中表達(dá)。在酵母中，線粒體在Fe-S簇生物合成中起重要作用。如果DHAD在酵母細(xì)胞在酵母胞質(zhì)溶膠中有功能地表達(dá)，需要一個系統(tǒng)來傳輸必需的Fe-S前體或來自線粒體的信號并將Fe-S簇裝配到胞質(zhì)溶膠中的脫輔基蛋白質(zhì)上。在本發(fā)明人的工作之前，酵母是否能為位于細(xì)胞質(zhì)中的任何DHAD提供Fe-S簇是前所未知的(由于新生酵母DHAD位于線粒體中)，更重要的是DHAD在細(xì)胞質(zhì)中高水平表達(dá)時。
在某些條件下需Fe-S簇的脫輔基蛋白質(zhì)合成速率可超過細(xì)胞為其合成并組裝Fe-S簇的能力。在這些條件下積累的缺少簇的脫輔基蛋白質(zhì)不能執(zhí)行它們的正常功能。此類條件能包括I)特別大量表達(dá)需Fe-S簇的脫輔基蛋白質(zhì)；2)自身Fe-S簇生物合成蛋白質(zhì)表達(dá)水平高于正常；或3)宿主細(xì)胞合成Fe-S簇的能力處于減弱的狀態(tài)。發(fā)明概述本文公開了驚人的發(fā)現(xiàn)如果Fe攝入、利用、和/或Fe-S簇生物合成蛋白質(zhì)中的至少一項的水平發(fā)生改變，高水平表達(dá)需Fe-S簇的脫輔基蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞能夠為蛋白質(zhì)提供與其結(jié)合的Fe-S簇。本文提供的是重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸，其中所述至少一種異源性多核苷酸包含高拷貝數(shù)的質(zhì)粒或能夠被調(diào)控的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。還提供了重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸，其中所述至少一種異源性多核苷酸在重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次。還提供了重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞在編碼影響鐵代謝或Fe-S簇生物合成的內(nèi)源性基因中包含至少一種缺失、突變、和/或取代。還提供了重組宿主細(xì)胞，其包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；和編碼影響鐵代謝或Fe-S簇生物合成的多肽的至少一種異源性多核苷酸。在實施方案中，所述編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的異源性多核苷酸選自表7、8和9中基因。在實施方案中，所述編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的異源性多核苷酸選自AFT1、AFT2、CCC1、FRA2和GRX3、以及它們的組合。在實施方案中，多肽是由組成型突變的多核苷酸編碼的。在實施方案中，所述組成型突變選自AFTl L99A、AFT1L102A、AFTlC291F、AFTl C293F、以及它們的組合。在實施方案中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽是由多核苷酸編碼的，其包含高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚰軌虮徽{(diào)控的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在實施方案中， 所述影響Fe-S簇生物合成的多肽是由在重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次的多核苷酸編碼的。在實施方案中，在編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的內(nèi)源性基因中的至少一種缺失、突變、和/或取代，選自CCC1、FRA2和GRX3、以及它們的組合。在實施方案中，編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的至少一種異源性多核苷酸選自AFT1、AFT2、它們的突變體、以及它們的組合。在實施方案中，編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸是以多拷貝表達(dá)的。在實施方案中，所述至少一種異源性多核苷酸包含高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚰軌虮徽{(diào)控的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在實施方案中，所述至少一種異源性多核苷酸在重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次。在實施方案中，所述Fe-S簇生物合成相比于具有內(nèi)源性Fe-S簇生物合成的重組宿主細(xì)胞是增加的。在實施方案中，所述宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞。在實施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞選自糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)和畢赤酵母屬(Pichia)。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽具有以< 10_5的E值匹配表12的序型隱蔽馬爾科夫模型的氨基酸序列，其中所述多肽還包含全部3個保守的半胱氨酸，它們對應(yīng)于變異鏈球菌(Streptococcus mutans)DHAD酶的氨基酸序列中的位點(diǎn)56、129和201，所述變異鏈球菌DHAD酶對應(yīng)于SEQ ID N0:168。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽與SEQ ID NO :168或SEQ ID NO :232具有至少約90%的氨基酸序列同一性。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽具有選自下列的比活性大于對照宿主細(xì)胞的約5倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；大于對照宿主細(xì)胞的約8倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；或大于對照宿主細(xì)胞的約10倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽具有選自下列的比活性大于對照宿主細(xì)胞的約3倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；以及大于對照宿主細(xì)胞的約6倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽具有選自下列的比活性大于約O. 25U/mg ;大于約O. 3U/mg ;大于約O. 5U/mg ;大于約I. OU/ mg ;大于約I. 5U/mg ;大于約2. OU/mg ;大于約3. OU/mg ;大于約4. OU/mg ;大于約5. OU/mg ； 大于約6. OU/mg ;大于約7. OU/mg ;大于約8. OU/mg ;大于約9. OU/mg ;大于約10. OU/mg ;大于約20. OU/mg ;和大于約50. OU/mg ο在實施方案中，所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇，并且在在實施方案中所述重組宿主細(xì)胞包含異丁醇生物合成途徑。本文還提供了制備產(chǎn)品的方法，所述方法包括提供重組宿主細(xì)胞；并在產(chǎn)生所述產(chǎn)物的條件下，將重組宿主細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵碳底物接觸；其中所述產(chǎn)物選自支鏈氨基酸、泛酸、2-甲基-I-丁醇、3-甲基-I-丁醇、異丁醇、以及它們的組合。在實施方案中，所述方法還包括任選地回收所述產(chǎn)品。在實施方案中，所述方法還包括回收所述產(chǎn)品。還提供了制備異丁醇的各種方法，所述方法包括提供重組宿主細(xì)胞；在產(chǎn)生異丁醇的條件下，將重組宿主細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵碳底物接觸。在實施方案中，所述方法還包括任選地回收所述異丁醇。在實施方案中，所述方法還包括回收所述異丁醇。還提供了將2，3- 二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化成α _酮異戊酸的各種方法，包括提供重組宿主細(xì)胞；使重組宿主細(xì)胞在2，3-二羥基異戊酸被轉(zhuǎn)化成α-酮異戊酸的條件下生長。在實施方案中，相比于包含至少一種編碼具有二羥酸脫水酶活性的異源性多核苷酸的對照重組宿主細(xì)胞，所述2，3_ 二羥基異戊酸至α-酮異戊酸的轉(zhuǎn)化的增加量選自(a)至少約5%;(b)至少約10% ； (c)至少約15% ； (d)至少約20% ； (e)至少約25% ； (f)至少約30% ； (g)至少約35% ； (h)至少約40% ；⑴至少約45% ； (j)至少約50% ； (k)至少約60% ；⑴至少約70% ； (m)至少約80% ； (η)至少約90% ;和(ο)至少約95%。還提供了增加重組宿主細(xì)胞中具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽的比活性的各種方法，包括提供重組宿主細(xì)胞；并使重組宿主細(xì)胞在具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽以有功能的形式表達(dá)的條件下生長，有功能的形式具有大于缺乏所述異源性多肽的相同的宿主細(xì)胞的比活性。還提供了提高宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑的通量的各種方法，所述方法包括提供重組宿主細(xì)胞；并使重組宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑的通量增加的條件下生長。提供了包含需Fe-S族蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞；改變所述宿主細(xì)胞中影響Fe-S族生物合成的多肽的表達(dá)或活性；并且使重組宿主細(xì)胞在增加需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性的條件下生長。在實施方案中，所述活性增加量選自大于約10% ;大于約20% ;大于約30% ；大于約40% ;大于約50% ;大于約60% ;大于約70% ;大于約80% ;大于約90% ;和大于約95%、98%、或99%。在實施方案中，活性的增加量選自大于約5倍；大于約8倍；大于約10倍。在實施方案中，活性的增加量選自大于約3倍和大于約6倍。宿主細(xì)胞中增加Fe-S簇生物合成途徑中的通量的多肽的鑒定方法，包括改變影響Fe-S簇生物合成的多肽表達(dá)或活性；測量異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性；并且比較多肽存在改變的表達(dá)或活性時測量的異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性與多肽不存在改變的表達(dá)或活性時測量的異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性，其中所述異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)活性的增加表明Fe-S簇生物合成途徑中的通量的增加。
本文提供了增加宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑中的通量的多肽的鑒定方法，所述方法包括改變影響Fe-S簇生物合成的多肽表達(dá)或活性；測定具有二羥酸脫水酶活性的多肽的活性；并且比較多肽的表達(dá)或活性存在改變時測量的具有二羥酸脫水酶活性的多肽的活性與多肽的表達(dá)或活性不存在改變時測量的具有二羥酸脫水酶活性的多肽的活性，其中所述異源具有二羥酸脫水酶活性的多肽活性的增加表明Fe-S簇生物合成途徑中的通量的增加。在實施方案中，影響Fe-S簇生物合成的多肽的表達(dá)或活性改變包含缺失、突變、取代、表達(dá)、上調(diào)、下調(diào)、改變細(xì)胞定位、改變蛋白質(zhì)的狀態(tài)、和/或加入輔因子。在實施方案中，需Fe-S簇蛋白質(zhì)具有二羥酸脫水酶活性，并且其中所述具有二羥酸脫水酶活性的需Fe-S簇蛋白質(zhì)具有匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其具有< 10_5的E值。其中所述多肽還包含全部三個保守的半胱氨酸，它們對應(yīng)于變異鏈球菌的氨基酸序列中的位點(diǎn)56、129和201，變異鏈球菌對應(yīng)于SEQ ID N0:168。在實施方案中，所述影響Fe-S簇生物合成的多肽為選自表7、8和9中的基因。還提供了包含至少一種編碼多肽的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多肽由本文提供的方法鑒定。在實施方案中，所述宿主細(xì)胞還包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸。在實施方案中，所述編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的異源性多核苷酸以多拷貝表達(dá)。在實施方案中，所述異源性多核苷酸包含高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚓哂心軌虮徽{(diào)節(jié)的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在實施方案中，所述異源性多核苷酸在重組宿主細(xì)胞中整合至少一次。在實施方案中，所述宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞。在實施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞選自糖酵母屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬、伊薩酵母屬和畢赤酵母屬。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。在實施方案中，所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽具有以<10_5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列。其中所述多肽還包含全部三個保守的半胱氨酸，它們對應(yīng)于變異鏈球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位點(diǎn)56、129和201，變異鏈球菌DHAD酶對應(yīng)于SEQ IDNO :168。在實施方案中，所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物選自支鏈氨基酸、泛酸、2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I- 丁醇、異丁醇、以及它們的組合。在實施方案中，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。在實施方案中，所述重組宿主細(xì)胞包含異丁醇生物合成途徑。在實施方案中，所述異丁醇生物合成途徑包含由宿主細(xì)胞中異源性多核苷酸編碼的至少一種多肽。在實施方案中，所述異丁醇生物合成途徑包含條由宿主細(xì)胞中異源性多核苷酸編碼的至少兩個多肽。在實施方案中，本發(fā)明的具有二羥酸脫水酶活性的多肽單體具有選自下列的Fe-S簇加載(a)至少約10% ； (b)至少約15% ； (C)至少約20% ； (d)至少約25% ； (e)至少約30% ； (f)至少約35% ； (g)至少約40% ； (h)至少約45% ；⑴至少約50% ； (j)至少約60% ； (k)至少約70% ；⑴至少約80% ； (m)至少約90% ;和(η)至少約95%。附圖簡述圖IA描繪了用于過表達(dá)來自變異鏈球菌(S. mutans)的IIvD基因的載體的載體圖譜。
圖IB描繪了用于過表達(dá)來自變異鏈球菌染色體上的IlvD基因的整合載體的載體圖譜。圖2描繪了用于克隆AFTl或AFTl突變體和其它受關(guān)注基因的著絲粒載體的載體圖譜。圖3描繪了純化的變異鏈球菌DHAD的紫外-可見吸收光譜。圖4描繪了純化的變異鏈球菌DHAD的EPR光譜。圖5描繪了生物合成異丁醇的生物合成途徑。圖6A描繪了維捏蘭德固氮菌(Azotobacter vinelandii)nif基因的不意圖。圖6B描繪了附加的維涅蘭德固氮菌nif基因的示意圖。圖6C描繪了其中NFU作為過硫化物還原酶的公式的示意圖。圖7描繪了幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)nif基因的示意圖。圖8描繪了大腸桿菌(E. coli)isc基因的示意圖。圖9描繪了大腸桿菌suf基因的示意圖。
圖10描繪了胞質(zhì)溶膠的[2Fe_2S]生物合成和組裝系統(tǒng)的示意圖。圖11描繪了用于過表達(dá)來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的IIvD基因的載體的載體圖譜。表12是基于檢測功能的酶計的二羥酸脫水酶的序型HMM表，檢測是按照于2009年9月29日提交的美國專利公開12/569,636的描述準(zhǔn)備的。表12是在此以電子版形式提交的，并且以引用方式并入本文。發(fā)明詳述本文描述了一種增加與Fe-S簇一起加載的需Fe-S簇蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)的方法。也描述了重組宿主細(xì)胞，其中表達(dá)功能的需Fe-S簇的蛋白質(zhì)，如DHAD酶和異源鐵攝入、利用、或Fe-S簇生物合成蛋白質(zhì)其中至少一種；還有重組宿主細(xì)胞，其中表達(dá)功能的DHAD酶并在涉及鐵利用或Fe-S簇生物合成的天然蛋白質(zhì)中的至少一種缺失、突變、和/或取代；或包含它們的組合的重組宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明描述了一種在宿主細(xì)胞中增加Fe-S簇生物合成途徑的通量的蛋白質(zhì)的鑒定方法。所述還有一種改變需Fe-S簇蛋白質(zhì)活性的多肽的鑒定方法。
除非另外規(guī)定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的意思。如發(fā)生矛盾，將以包括所述定義的本專利申請為準(zhǔn)。此外，除非上下文另有所需，單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。為所有目的，所有的出版物、專利、以及本文提及的其它參考資料均全文以引用方式并入本文。為了進(jìn)一步限定本發(fā)明，本文提供了以下術(shù)語和定義。如本文所用，術(shù)語“包含”、“包含”、“包括”、“包括”、“具有”、“具有”、“含有”或“含
有”或它們的任何其它變型將被理解為是指包括指定的整數(shù)或整數(shù)組 但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備不必僅限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備所固有的元素。此外，除非另外特別說明，否則“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任一項均表示滿足條件A或B :A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。如本文所用，如整個說明書和權(quán)利要求中所使用的，術(shù)語“由組成”或諸如“由組成”的不同時態(tài)的變型表明包括任何列舉的整數(shù)或整數(shù)組，但是無附加整數(shù)或整數(shù)組可加入到指定的方法、結(jié)構(gòu)或組合物中。如本文所用，如整個說明書和權(quán)利要求中所使用的，術(shù)語“基本上由組成”或諸如“基本上由組成”的不同時態(tài)的變型表明包括任何列舉的整數(shù)或整數(shù)組，并且任選地包括未顯著改變指定的方法、結(jié)構(gòu)或組合物的基本或新穎特性的任何列舉的整數(shù)或整數(shù)組。參見M. P. E. P. § 2111. 03。此外，涉及元素或組分實例(即出現(xiàn))的數(shù)目在本發(fā)明元素或組分前的不定冠詞“一個”或“一種”旨在為非限制性的。因此，“一個”或“一種”應(yīng)被理解為包括一種或至少一種，并且元素或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。如本文所用，術(shù)語“發(fā)明”或“本發(fā)明”為非限制性術(shù)語，并且不旨在意指本發(fā)明的任何單獨(dú)實施方案，而是涵蓋如本專利申請所述的所有可能的實施方案。如本文所用，修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語“約”是指可以通過例如以下程序而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化在真實世界中用于產(chǎn)生濃縮物或溶液的一般測定和液體處理操作；通過這些程序中非故意的誤差；通過用于產(chǎn)生組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來源或純度中的差異；等。術(shù)語“約”還包括由于對于起因于特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語“約”來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。在一個實施方案中，術(shù)語“約”是指在報告數(shù)值10%范圍內(nèi)，優(yōu)選地在報告數(shù)值5%范圍內(nèi)。術(shù)語“異丁醇生物合成途徑”是指一種由丙酮酸生成異丁醇的酶(催化)途徑。術(shù)語“兼性厭氧菌”是指能夠在有氧和無氧環(huán)境中生長的微生物。術(shù)語“碳底物”或“能發(fā)酵的碳底物”是指本發(fā)明的宿主生物體能夠代謝的碳源，和尤其選自單糖、寡糖、多糖和單碳底物或它們的混合物的碳源。術(shù)語“Fe-S簇生物合成”是指Fe_S簇的生物合成，包括，例如，F(xiàn)e-S簇的組裝和加載。術(shù)語“Fe-S簇生物合成基因”、“Fe-S簇生物合成蛋白質(zhì)”或“Fe_S簇生物合成途徑”是指那些多核苷酸/基因和編碼的多肽，其涉及Fe-S簇生物合成，包括，例如，F(xiàn)e-S簇的組裝和加載。術(shù)語“鐵攝入和利用”是指能夠影響Fe-S簇生物合成如鐵傳感、攝入、利用和自穩(wěn)態(tài)的過程。“鐵攝入和利用基因”是指那些多核苷酸/基因和編碼的多肽，其涉及鐵傳感、攝入、利用和自穩(wěn)態(tài)。這些多核苷酸/基因中的一部分包含在“Fe Regulon”中，其在文獻(xiàn)中已經(jīng)有過描述并在后面有進(jìn)一步說明。如本文所用，鐵攝入和利用基因和Fe-S簇生物合成基因能夠編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽。如本文所用術(shù)語“比活性”定義為一定量蛋白質(zhì)的活性單位。因此，所述比活性不是直接測定的而是通過計算得到的用I)酶樣品的活性，單位/ml除以2)該樣本中的蛋白質(zhì)濃度，因此所述比活性表示為單位/mg。純的、完全活性的酶樣品的比活性是這種酶的特性。蛋白質(zhì)混合物的比活性是量度由感興趣的活性酶組成的樣品中的蛋白質(zhì)相對分?jǐn)?shù)。本發(fā)明所述多肽的比活性可選自大于約O. 25U/mg ;大于約O. 3U/mg ;大于約O. 4U/mg ;大于約O. 5U/mg ;大于約O. 6U/mg ;大于約O. 7U/mg ;大于約O. 8U/mg ;大于約O. 9U/mg ；大于約I. OU/mg ;大于約I. 5U/mg ;大于約2. OU/mg ;大于約2. 5U/mg ;大于約3. OU/mg ;大于約3. 5U/mg ;大于約4. OU/mg ;大于約5. 5U/mg ;大于約5. OU/mg ;大于約6. OU/mg ;大于 約6. 5U/mg ;大于約7. OU/mg ;大于約7. 5U/mg ;大于約8. OU/mg ;大于約8. 5U/mg ;大于約9. OU/mg ;大于約 9. 5U/mg ;大于約 10. OU/mg ;大于約 20. OU/mg ;或大于約 50. OU/mg。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽的比活性大于約0. 25U/mg。在另一個實施方案中，所述比活性大于約I. OU/mg。在另一個實施方案中，所述比活性大于約2. OU/mg或大于約3. OU/mg。術(shù)語“多核苷酸”旨在涵蓋單個核酸以及多個核酸，和指核酸分子或核酸構(gòu)建體，例如，信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苷酸能夠包含全長cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻譯的5'和3'端序列和編碼序列。所述多核苷酸能夠由任何多核糖核酸或多脫氧核糖核酸組成，其可為非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸能夠由單鏈和雙鏈DNA構(gòu)成，其為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物；單鏈和雙鏈RNA，其為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物；包含DNA和RNA的雜合分子，其可為單鏈或，更典型地雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物?！岸嗪塑账帷卑嘶瘜W(xué)地、酶學(xué)地、或代謝地改性的形式。多核苷酸序列可意為“分離的”，其中它從天然的環(huán)境中移除出來。例如，包含在載體中的編碼具有二羥酸脫水酶活性多肽或多肽片段的異源性多核苷酸，出于本發(fā)明的目的可被認(rèn)為是分離的。分離的多核苷酸的另一個例子包括異源宿主細(xì)胞擁有的重組多核苷酸或溶液中的純化的(部分地或基本上)多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明分離的多核苷酸或核酸還包括此類人工合成生產(chǎn)的分子。DNA聚合物分離的多核苷酸片段形式可由一個或更多個cDNA、基因組DNA或合成DNA片段構(gòu)成。術(shù)語“基因”是指多核苷酸，其能夠表達(dá)為特異性蛋白質(zhì)，任選地包括在編碼序列前面的(5'非編碼序列)和后面的(3'非編碼序列)調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉笔侵柑烊淮嬖诘木哂衅渥约旱恼{(diào)控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包含源自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者源自相同來源、但排列方式與天然存在的排列方式不同的調(diào)控序列和編碼序列。如本文所用，“編碼區(qū)”是指由翻譯為氨基酸的密碼子組成的核酸部分。雖然“終止密碼子”(TAG、TGA、或TAA)不翻譯為氨基酸，它可被考慮作為編碼區(qū)域的一部分，但任何側(cè)翼序列，例如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子、以及等等，不是編碼區(qū)域的一部分。本發(fā)明的兩個或更多個編碼區(qū)域能存在于單種多核苷酸構(gòu)建體中，例如，在單個載體上；或在獨(dú)立的多種多核苷酸構(gòu)建體中，例如，在獨(dú)立的(不同的)載體中。此外，任何載體可包含單個編碼區(qū)域，或可包含兩個或更多個編碼區(qū)域。此外，本發(fā)明的載體、多核苷酸、或核酸可編碼異源編碼區(qū)域。術(shù)語“內(nèi)源性”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽時是指在生物體基因組中天然位置的原生的多核苷酸或基因，或是由基因組這個位置轉(zhuǎn)錄和翻譯的原生的多肽。術(shù)語“異源性”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽時是指在宿主生物體中沒有正常地發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、基因、或多肽?！爱愒础币舶ㄔ木幋a區(qū)域、或它們的一部分，即以不同于對應(yīng)的原生基因的一種形式重新導(dǎo)入源生物體，例如，不在所述生物體基因組中的原生位置上。所述異源性多核苷酸或基因可通過例如基因轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入宿主生物體。異源性基因可包括原生的編碼區(qū)域，其帶有重新導(dǎo)入所述原生宿主的非原生調(diào)節(jié)區(qū)域?！稗D(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化程序?qū)牖蚪M內(nèi)的基因。
術(shù)語“重組基因表達(dá)元件”是指表達(dá)一個或多個特異性蛋白質(zhì)的核苷酸片段，其包括前面的調(diào)控序列(5'非編碼序列)和之后的(3'終止序列)蛋白質(zhì)編碼序列。嵌合基因是重組基因表達(dá)元件。操縱子的編碼區(qū)域可形成重組基因表達(dá)元件，一起的還有可操作地連接的啟動子和終止區(qū)域?！罢{(diào)控序列”是指位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部、或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，并且能影響相關(guān)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或RNA穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、增強(qiáng)子、操縱子、阻遏子、轉(zhuǎn)錄終止信號、翻譯引導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多聚腺苷酸識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。術(shù)語“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的核苷酸序列。一般來講，編碼序列位于啟動子序列的3'端。啟動子可來源于天然基因的全部、或由天然存在的不同啟動子的不同元件組合而成、或甚至包含合成的核酸片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細(xì)胞類型中，或在不同的發(fā)育階段，或響應(yīng)不同的環(huán)境條件或生理條件而引導(dǎo)基因的表達(dá)。通常將在大多數(shù)細(xì)胞類型中、在大多數(shù)情況下引起基因表達(dá)的啟動子稱為“組成型啟動子”。另一方面，“誘導(dǎo)型啟動子”在所述啟動子被啟動子特異的信號或分子誘導(dǎo)或打開時導(dǎo)致基因表達(dá)。還應(yīng)認(rèn)識到因為在大多數(shù)情況下還不能完全確定調(diào)控序列的確切范圍，不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。術(shù)語“可操作地連接”是指單個核酸片段上的核酸序列的關(guān)聯(lián)，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即該編碼序列受到該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以按有義或反義的取向可操作地連接至調(diào)控序列。術(shù)語“表達(dá)”如本文所用是指表達(dá)和積累來源于本發(fā)明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA。表達(dá)也可指將mRNA翻譯成多肽。這個過程包括表達(dá)的核苷酸、基因、或包括在細(xì)胞內(nèi)多肽的功能存在的任何表現(xiàn)，沒有限制，基因敲出以及瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。術(shù)語“過表達(dá)”如本文所用是指表達(dá)高于相同或相關(guān)多核苷酸或基因的內(nèi)源性表達(dá)。如異源性多核苷酸或基因的表達(dá)高于可比的內(nèi)源性基因，或高于以非過表達(dá)多核苷酸或基因方式導(dǎo)入的相同的多核苷酸或基因，則這種異源性多核苷酸或基因就是過表達(dá)的。例如，多核苷酸能在宿主細(xì)胞中以低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)，其僅存在于非常有限或少數(shù)的拷貝中，并且相同的多核苷酸能在宿主細(xì)胞中以高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚰軌虮徽{(diào)控的拷貝數(shù)的質(zhì)粒過表達(dá)，其以多個拷貝形式存在。任何方式都能用于過表達(dá)多核苷酸，只要它增加多核苷酸在宿主細(xì)胞中的拷貝。除了使用高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，或能調(diào)控拷貝數(shù)質(zhì)粒，多核苷酸能通過染色體上多次整合而過表達(dá)。在重組宿主細(xì)胞中本發(fā)明的多肽的表達(dá)或過表達(dá)，能按照技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的方法來量化，并且能以例如細(xì)胞總蛋白質(zhì)百分?jǐn)?shù)來表示。所述總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)能大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約O. 001%的量；大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約O. 01% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約O. 1% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約O. 5% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約 I. 0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約2. 0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約3% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約4. 0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約5% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約6. 0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約7. 0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約8.0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約9. 0% ;大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約10% ;或大于細(xì)胞總蛋白質(zhì)的約20%。在一個實施方案中，多肽的表達(dá)量大于總細(xì)胞蛋白質(zhì)的約O. 5%。在另一個實施方案中，多肽的表達(dá)量大于總細(xì)胞蛋白質(zhì)的約I. O %或大于總細(xì)胞蛋白質(zhì)的約2. 0%。如本為所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指轉(zhuǎn)移核酸片段到宿主生物中，獲得有選擇或無選擇的基因穩(wěn)定遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物體。如本文所用，術(shù)語“質(zhì)粒”和“載體”是指通常攜帶有不屬于細(xì)胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或線性或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列，其中多個核苷酸序列已連接或重組進(jìn)入一種獨(dú)特構(gòu)建體中，該獨(dú)特構(gòu)建體能夠?qū)⑺x基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列與相應(yīng)的3'末端非翻譯序列一起引入細(xì)胞中。如本文所用術(shù)語“密碼子簡并性”是指在遺傳密碼中核苷酸序列允許變化的性質(zhì)，這種變化不影響編碼多肽中的氨基酸序列。技術(shù)人員非常了解具體宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以確定給定氨基酸時所表現(xiàn)出的“密碼子偏好性”。因此，當(dāng)合成基因用以改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)時，希望對基因進(jìn)行設(shè)計，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用頻率。如它是指用于轉(zhuǎn)化各種宿主的基因或編碼區(qū)域的核酸分子，術(shù)語“密碼子優(yōu)化的”是指在基因或編碼區(qū)域的核酸分子中的密碼子改變，反映了在沒有改變DNA編碼的多肽情況下宿主生物典型的密碼子使用情況。此類優(yōu)化包括將至少一種、或多于一種、或顯著的數(shù)目的密碼子替換為在那種生物體中使用頻率更高的一種或多種密碼子。在包含編碼任何多肽鏈的氨基酸的密碼子的核苷酸序列中的差異使得在編碼所述基因的序列中發(fā)生突變。因為每個密碼子由三個核苷酸組成，并且包含DNA的核苷酸限于四個特定堿基，有64個可能的核苷酸組合，它們中的61個編碼氨基酸(剩余的三個密碼子編碼翻譯終止信號)。示出哪個密碼子編碼哪個氨基酸的“遺傳密碼”在本文表I中示出。因此，許多氨基酸由多于一種密碼子編碼。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四個核苷酸三聯(lián)體編碼，絲氨酸和精氨酸由六個核苷酸三聯(lián)體編碼，而色氨酸和甲硫氨酸僅由一個核苷酸三聯(lián)體編碼。這種簡并性允許DNA堿基組合發(fā)生廣泛的改變，并且不改變由該DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。表I 準(zhǔn)基因編碼
權(quán)利要求
1.重組宿主細(xì)胞，包含 (a)編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；和 (b)(i)在編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的內(nèi)源性基因中的至少一種缺失、突變、和/或取代；和/或 ( )編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的至少一種異源性多核苷酸。
2.權(quán)利要求I的重組宿主細(xì)胞，其中所述編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸 (a)包含高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚓哂心軌虮徽{(diào)節(jié)的拷貝數(shù)的質(zhì)粒；或 (b)在所述重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次。
3.重組宿主細(xì)胞，包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸，其中所述至少一種異源性多核苷酸包含高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚓哂心軌虮徽{(diào)節(jié)的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
4.重組宿主細(xì)胞，包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸，其中所述至少一種異源性多核苷酸在所述重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次。
5.權(quán)利要求I或2的重組宿主細(xì)胞，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽由選自表8和9中基因的基因編碼。
6.權(quán)利要求I或2的重組宿主細(xì)胞，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽由選自表7中基因的基因編碼。
7.權(quán)利要求5或6的重組宿主細(xì)胞，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽由選自AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、以及它們的組合的基因編碼。
8.權(quán)利要求7的重組宿主細(xì)胞，其中所述多肽由組成型突變體多核苷酸編碼。
9.權(quán)利要求8的重組宿主細(xì)胞，其中所述組成型突變體選自AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、以及它們的組合。
10.權(quán)利要求I或2的重組宿主細(xì)胞，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽為AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、或 CCCl。
11.權(quán)利要求I或2的重組宿主細(xì)胞，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽為AFTl、AFT2、FRA2、或 CCCl。
12.權(quán)利要求I或2的重組宿主細(xì)胞，其中在編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的內(nèi)源性基因中的至少一種缺失、突變、和/或取代選自FRA2、GRX3、CCC1、以及它們的組合。
13.權(quán)利要求I或2的重組宿主細(xì)胞，其中編碼影響Fe-S簇生物合成的多肽的至少一種異源性多核苷酸選自AFT1、AFT2、以及它們的組合。
14.權(quán)利要求I的重組宿主細(xì)胞，其中所述編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸以多拷貝表達(dá)。
15.權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞，其中所述至少一種異源性多核苷酸包含高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚓哂心軌虮徽{(diào)節(jié)的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
16.權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞，其中所述至少一種異源性多核苷酸在所述重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次。
17.權(quán)利要求1、2、或5-16中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中相比于具有內(nèi)源性Fe-S簇生物合成的重組宿主細(xì)胞，所述Fe-S簇生物合成增加。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的重組宿主細(xì)胞，其中所述酵母宿主細(xì)胞選自糖酵母屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬、伊薩酵母屬和畢赤酵母屬。
20.權(quán)利要求1-19中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。
21.權(quán)利要求1-20中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽具有以< 10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其中所述多肽還包含全部三個保守的半胱氨酸，它們對應(yīng)于變異鏈球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位點(diǎn)56、129和201，所述變異鏈球菌DHAD酶對應(yīng)于SEQ ID NO :168。
22.權(quán)利要求1-21中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :168或SEQ ID NO :232具有至少約90%的同一1f生。
23.權(quán)利要求1-22中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽具有選自下列的比活性 (a)大于對照宿主細(xì)胞的約5倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸； (b)大于對照宿主細(xì)胞的約8倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；和 (c)大于對照宿主細(xì)胞的約10倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸。
24.權(quán)利要求1-22中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽具有選自下列的比活性(a)大于約O. 25U/mg ；(b)大于約O. 3U/mg ；(c)大于約O. 5U/mg ；(d)大于約I. OU/mg ；(e)大于約I. 5U/mg ；(f)大于約2. OU/mg ；(g)大于約3. OU/mg ；(h)大于約4. OU/mg ；(i)大于約5. OU/mg ；(j)大于約 6. OU/mg ；(k)大于約 7. OU/mg ；(I)大于約 8. OU/mg ；(m)大于約 9. OU/mg ；(η)大于約 10. OU/mg ； (o)大于約20. OU/mg ;和 (P)大于約 50. OU/mg ο
25.權(quán)利要求1-24中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。
26.權(quán)利要求25的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞包含異丁醇生物合成途徑。
27.制備產(chǎn)物的方法，包括 (a)提供權(quán)利要求1-24中任一項的重組宿主細(xì)胞； (b)在產(chǎn)生所述產(chǎn)物的條件下，使(a)的重組宿主細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中的可發(fā)酵碳底物接觸； 其中所述產(chǎn)物選自支鏈氨基酸、泛酸、2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I- 丁醇、異丁醇、以及它們的組合。
28.制備異丁醇的方法，包括 (a)提供權(quán)利要求1-24中任一項的重組宿主細(xì)胞； (b)在產(chǎn)生異丁醇的條件下，使(a)的重組宿主細(xì)胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中的可發(fā)酵碳底物接觸。
29.用于將2，3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化成α-酮異戊酸的方法，包括 (a)提供權(quán)利要求1-24中任一項的重組宿主；以及 (b)使(a)的重組宿主細(xì)胞在2，3-二羥基異戊酸被轉(zhuǎn)化成α-酮異戊酸的條件下生長， 其中2，3-二羥基異戊酸被轉(zhuǎn)化成α-酮異戊酸。
30.用于增加重組宿主細(xì)胞中的具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽的比活性的方法，包括 (a)提供權(quán)利要求1-24中任一項的重組宿主細(xì)胞；以及 (b)使(a)的重組宿主細(xì)胞在具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽以有功能的形式表達(dá)的條件下生長，所述有功能的形式具有大于缺乏所述異源性多肽的相同宿主細(xì)胞的比活性。
31.用于增加宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑中的通量的方法，包括 (a)提供權(quán)利要求3-24中任一項的重組宿主細(xì)胞；以及 (b)使(a)的重組宿主細(xì)胞在所述宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑中的通量增加的條件下生長。
32.增加重組宿主細(xì)胞中的需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性的方法，包括 (a)提供包含需Fe-S簇蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞； (b)改變所述宿主細(xì)胞中影響Fe-S簇生物合成的多肽的表達(dá)或活性；以及 (C)使(b)的重組宿主細(xì)胞在需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性增加的條件下生長。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述活性的增加量選自 (a)大于約10%； (b)大于約20%； (c)大于約30%； (d)大于約40%； (e)大于約50%； (f)大于約60%； (g)大于約70%； (h)大于約80%；(i)大于約90% ;和 (j)大于約95%。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述活性的增加量選自 (a)大于約5倍； (b)大于約8倍；和 (c)大于約10倍。
35.增加宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑中的通量的多肽的鑒定方法，包括 (a)改變影響Fe-S簇生物合成的多肽的表達(dá)或活性； (b)測量異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性；以及 (C)比較在步驟(a)的多肽存在改變的表達(dá)或活性時測量的異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性與在步驟(a)的多肽不存在改變的表達(dá)或活性時測量的異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)的活性， 其中所述異源性需Fe-S簇蛋白質(zhì)活性的增加表明所述Fe-S簇生物合成途徑中的通量的增加。
36.增加宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑中的通量的多肽的鑒定方法，包括 (a)改變影響Fe-S簇生物合成的多肽的表達(dá)或活性； (b)測量具有二羥酸脫水酶活性的多肽的活性；以及 (C)比較在步驟(a)的多肽的表達(dá)或活性存在改變時測量的具有二羥酸脫水酶活性的多肽的活性與在步驟(a)的多肽的表達(dá)或活性不存在改變時測量的具有二羥酸脫水酶活性的多肽的活性， 其中具有二羥酸脫水酶活性的多肽活性的增加表明所述Fe-S簇生物合成途徑中的通量的增加。
37.權(quán)利要求30-36中任一項的方法，其中影響Fe-S簇生物合成的多肽的所述表達(dá)或活性改變包括缺失、突變、取代、表達(dá)、上調(diào)、下調(diào)、改變細(xì)胞定位、改變蛋白質(zhì)的狀態(tài)、和/或加入輔因子。
38.權(quán)利要求32-37中任一項的方法，其中所述需Fe-S簇蛋白質(zhì)具有二羥酸脫水酶活性，并且其中所述具有二羥酸脫水酶活性的需Fe-S簇蛋白質(zhì)具有以< 10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其中所述多肽還包含全部三個保守的半胱氨酸，它們對應(yīng)于變異鏈球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位點(diǎn)56、129和201，所述變異鏈球菌DHAD酶對應(yīng)于SEQ ID NO 168o
39.權(quán)利要求32-38中任一項的方法，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽由選自AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、以及它們的組合的基因編碼。
40.重組宿主細(xì)胞，包含至少一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼由權(quán)利要求35-37中任一項的方法鑒定的多肽。
41.權(quán)利要求40的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸。
42.權(quán)利要求41的重組宿主細(xì)胞，其中所述編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的異源性多核苷酸以多拷貝表達(dá)。
43.權(quán)利要求41的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源性多核苷酸包含高拷貝數(shù)的質(zhì)粒或具有能夠被調(diào)節(jié)的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
44.權(quán)利要求41的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源性多核苷酸在重組宿主細(xì)胞DNA中被整合至少一次。
45.權(quán)利要求35或36的方法，其中所述宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述酵母宿主細(xì)胞選自糖酵母屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬、伊薩酵母屬和畢赤酵母屬。
47.權(quán)利要求28-39中任一項的方法，其中所述宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述酵母宿主細(xì)胞選自糖酵母屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬、伊薩酵母屬和畢赤酵母屬。
49.權(quán)利要求40-44中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞為酵母宿主細(xì)胞。
50.權(quán)利要求49的重組宿主細(xì)胞，其中所述酵母宿主細(xì)胞選自糖酵母屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬、伊薩酵母屬和畢赤酵母屬。
51.權(quán)利要求40-44或49-50中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。
52.權(quán)利要求40-44或49-50中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的異源性多肽具有以< 10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其中所述多肽還包含全部三個保守的半胱氨酸，它們對應(yīng)于變異鏈球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位點(diǎn)56、129和201，所述變異鏈球菌DHAD酶對應(yīng)于SEQ ID NO :168。
53.權(quán)利要求40-44或49-50中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生選自支鏈氨基酸、泛酸、2-甲基-I-丁醇、3-甲基-I-丁醇、異丁醇、以及它們的組合的產(chǎn)物。
54.權(quán)利要求53的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。
55.權(quán)利要求54的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞包含異丁醇生物合成途徑。
56.權(quán)利要求1-22中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽具有選自下列的比活性 (a)大于對照宿主細(xì)胞的約3倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸；和 (b)大于對照宿主細(xì)胞的約6倍，所述對照宿主細(xì)胞包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸。
57.權(quán)利要求32的方法，其中所述活性的增加量選自 (a)大于約3倍；和 (b)大于約6倍。
58.權(quán)利要求1-22、40-44、或49-50中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有二羥酸脫水酶活性的多肽的單體具有選自下列的Fe-S簇加載 (a)至少約10%； (b)至少約15%； (c)至少約20%； (d)至少約25%； (e)至少約30%；(f)至少約35%； (g)至少約40%； (h)至少約45%； ⑴至少約50% ； (j)至少約60% ； (k)至少約70% ； (I)至少約80% ； (m)至少約90% ;和 (η)至少約95%。
59.權(quán)利要求29的方法，其中相比于包含編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽的至少一種異源性多核苷酸的對照宿主細(xì)胞，所述2，3-二羥基異戊酸至α -酮異戊酸的轉(zhuǎn)化的增加量選自 (a)至少約5%； (b)至少約10%； (C)至少約15% ； (d)至少約20%； (e)至少約25%； (f)至少約30%； (g)至少約35%； (h)至少約40%； (i)至少約45%； (j)至少約50% ； (k)至少約60% ； (I)至少約70% ； (m)至少約80% ； (η)至少約90% ;和 (ο)至少約95%。
60.權(quán)利要求1、2、或5-26中任一項的重組宿主細(xì)胞，其中所述影響Fe-S簇生物合成的多肽由下列基因編碼ARN1、ARN2、ATX1、CCC2、C0T1、ENB1、FET3、FET5、FIT1、FIT2、FIT3、FRE1、FRE2、FRE3、FRE4、FRE5、FRE6、FTH1、FTR1、HMX1、SIT1、SMF3、TIS11、VHT1、AFT1、AFT2、AM1、ARH1、ATM1、BUD32、CAD1、CCC1、CFD1、CIA1、CMK1、CTH1、CTI6、CYC8、DAP1、DRE2、ERV1、ESA1、FET4、FRA1、FRA2、GEF1、GGC1、GRX1、GRX2、GRX4、GRX5、HDA1、IBA57、ISA1、ISA2、ISU1、ISU2、JACl、MGEl、MRS3、MRS4、MSN5、NARl、NFSl、NFUl、NHP6a、NHP6b、PSEl、SMFl、SNFl、SNF2、SNF3、SNF4、SSQ1、HM12、TUP1、NP 011911. 1、VPS41、YAP5、YFH1、YRA1、ZPR1、iscAnif、nifU、nifS、cysEl、cysE2> iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、Fdx> sufS、sufE> cysE3> sufS2> iscA2、Nfu、nfuA、nfuV> nfu、sufA、sufB、sufC、sufD、sufEl、sufS2、或 sufE2。
61.測量具有二羥酸脫水酶活性的多肽形式的濃度的方法，包括 (a)使用第一層析程序從粗提物中分離含所述多肽的級份； (b)使用第二層析程序從(a)中分離包含所述多肽的一種形式的級份；以及(C)測量(b)中獲得的所述多肽的所述形式的濃度?！?br>
全文摘要
本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，具體地為酵母細(xì)胞，其包含二羥酸脫水酶多肽。本發(fā)明還涉及具有增加的二羥酸脫水酶比活性的重組宿主細(xì)胞，比活性的增加是所述多肽表達(dá)的增加、細(xì)胞Fe-S簇生物合成的調(diào)制、或它們的組合的結(jié)果。本發(fā)明還包括使用所述宿主細(xì)胞的方法，以及用于鑒定增加宿主細(xì)胞中的Fe-S簇生物合成途徑中的通量的多肽的方法。
文檔編號C12N1/19GK102782119SQ201180010056
公開日2012年11月14日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月17日
發(fā)明者B.J.保羅, D.弗林特, R.W.葉 申請人:布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司