專(zhuān)利名稱(chēng)：篩選核酸配體的方法
篩選核酸配體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選核酸配體的方法，且尤其涉及篩選對(duì)靶物質(zhì)具有親和性且與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體的方法。
背景技術(shù)：
適體是指與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的核酸配體。在1990年，Gold等人首先建議其基本概念。已知通過(guò)使用利用對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力作為指標(biāo)的稱(chēng)之為SELEX方法的方法選擇及獲得適體的方法。短語(yǔ)〃通過(guò)指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)性進(jìn)化(the Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 〃縮寫(xiě)為〃SELEX〃。直到現(xiàn)在，已公開(kāi)廣泛的分子作為適體的靶物質(zhì)。報(bào)道的靶物質(zhì)的例包括，例如，各種蛋白，酶，肽，抗體，受體，激素，氨基酸，抗生素和其他各種化合物。利用對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力作為指標(biāo)的SELEX方法已常改善對(duì)靶物質(zhì)的親和性和特異性，由此實(shí)現(xiàn)各種特定目的。此外，對(duì)于利用與靶物質(zhì)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化作為指標(biāo)的方法，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 07/960, 093公開(kāi)了，通過(guò)使用SELEX和凝膠電泳的組合選擇具有特定結(jié)構(gòu)性質(zhì)的核酸(例如，彎曲的DNA)。而且，已知使用結(jié)構(gòu)-切換信號(hào)傳導(dǎo)適體中的適體的體外選擇，由此旨在獲得利用與靶物質(zhì)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化的傳感器的適體。作為利用經(jīng)歷與靶物質(zhì)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化的核酸配體的傳感器，使用，例如，熒光報(bào)告子的方法發(fā)現(xiàn)是特別有用的。關(guān)于以上使用熒光報(bào)告子的方法，已開(kāi)發(fā)各種方法。報(bào)道的方法的例包括基于適體的單生色團(tuán)報(bào)告子方法，適體信標(biāo)(基于適體的雙生色團(tuán)報(bào)告子方法),解毒物(DNA/DNA雙鏈體至DNA/靶復(fù)合物結(jié)構(gòu)-切換方法，QDNA),原位標(biāo)記方法，嵌合適體方法，及熒光染色方法。與靶物質(zhì)結(jié)合后核酸配體的結(jié)構(gòu)變化提供影響傳感器的SNR (信號(hào)-噪音比)或檢測(cè)限的重要功能。強(qiáng)烈期望的是開(kāi)發(fā)精確地調(diào)控結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)和獲得結(jié)合靶物質(zhì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化的配體的簡(jiǎn)單，系統(tǒng)性和穩(wěn)健的技術(shù)。引用文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)PTL I :美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) No. 07/960，09非專(zhuān)利文獻(xiàn)NPL I Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 9, 1963-1968
發(fā)明內(nèi)容一般而言，獲得核酸配體的方法，以SELEX方法為代表，旨在通過(guò)利用對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力作為指標(biāo)從核酸候選配體庫(kù)選擇對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體。以上公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 07/960, 093的方法提供利用從與靶物質(zhì)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化得到的物理性質(zhì)變化的選擇。此方法可有效獲得作為全核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合分子的經(jīng)歷結(jié)構(gòu)變化的核酸配體。但是，無(wú)法指明核酸序列的哪個(gè)部分經(jīng)歷與靶物質(zhì)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化和/或哪個(gè)部分形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。該方法不利用與靶物質(zhì)結(jié)合后特定特異性預(yù)設(shè)計(jì)的核酸序列之間的雙鏈體形成作為結(jié)構(gòu)變化的指標(biāo)。在結(jié)構(gòu)-切換信號(hào)傳導(dǎo)適體的適體的體外選擇中，通過(guò)利用對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力和與靶物質(zhì)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化的能力二者作為指標(biāo)開(kāi)發(fā)了在DNA/DNA雙鏈體至DNA/靶復(fù)合物結(jié)構(gòu)-切換方法(基于適體的雙生色團(tuán)報(bào)告子方法)中使用的傳感器，通過(guò)選擇能經(jīng)歷結(jié)構(gòu)變化的適體獲得的傳感器。此方法預(yù)先加工多個(gè)結(jié)構(gòu)域作為核酸候選配體庫(kù)的保守的序列結(jié)構(gòu)域。但是，各保守的序列結(jié)構(gòu)域不提供互補(bǔ)序列，且不具有在保守的序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子內(nèi)雙鏈體的功能。此外，保守的序列結(jié)構(gòu)域包括多個(gè)引物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)和中心-固定的序列基序。相比使用共同序列的穩(wěn)健的和系統(tǒng)性(合理的)方法，在DNA/DNA雙鏈體至DNA/靶復(fù)合物結(jié)構(gòu)-切換方法中使用的此適體傳感器是獲得具有結(jié)構(gòu)變化的能力而保持對(duì)靶物質(zhì)的親和性的標(biāo)記的適體分子的方法。特別是，2種標(biāo)記的-寡DNA (FDNA, QDNA)分別互補(bǔ)于中心-固定的序列基序及保守的引物結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一而形成雙鏈體。接下來(lái)，F(xiàn)DNA和QDNA之間的距離在由與靶物質(zhì)結(jié)合所致的結(jié)構(gòu)變化后變化，或所述距離在FDNA解離后變化，然后檢測(cè)靶物質(zhì)。但是，此方法在與靶物質(zhì)結(jié)合之后不調(diào)控結(jié)構(gòu)變化(雙鏈體形成)。此外，預(yù)測(cè)到，以上結(jié)構(gòu)變化的程度不保持恒定，也被預(yù)測(cè)難以通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合調(diào)控FDNA的解離。因而，可不精確地調(diào)控FDNA和QDNA之間的距離。關(guān)于獲得用于利用核酸配體中的結(jié)構(gòu)變化的傳感器的核酸配體(分子信標(biāo)適體)序列的方法，通常使用的是如下方法，其包括由SELEX方法獲得序列，然后通過(guò)再加工序列賦予結(jié)構(gòu)變化的能力。例如，有對(duì)具有在與靶物質(zhì)結(jié)合后經(jīng)歷結(jié)構(gòu)變化(雙鏈體形成)的能力的分子信標(biāo)適體的報(bào)道。該方法可不賦予對(duì)靶物質(zhì)的親和性，由于序列在獲得核酸配體后被再加工，以給序列賦予結(jié)構(gòu)變化的能力?；蛘撸⒁獾?，造成依賴(lài)于相應(yīng)序列的再加工的必要。由此，當(dāng)前情況表明，以上方法不可認(rèn)為是穩(wěn)健的方法，因?yàn)樾枰獙?duì)于獲得的各核酸配體重復(fù)優(yōu)化加工。此外，有通過(guò)作為解毒劑添加互補(bǔ)于由SELEX方法獲得的核酸配體序列的序列來(lái)調(diào)控結(jié)構(gòu)變化的感覺(jué)方法。但是，對(duì)靶物質(zhì)的親和性可變化，且個(gè)體配體也需要優(yōu)化加工(例如，序列，序列長(zhǎng)度，錯(cuò)配的插入，序列位置)。S卩，尚不存在通過(guò)利用核酸配體候選體庫(kù)對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力和在與靶物質(zhì)結(jié)合后在已設(shè)計(jì)為保守的序列結(jié)構(gòu)域的多個(gè)互補(bǔ)序列之中形成分子內(nèi)雙鏈體的結(jié)構(gòu)變化的能力二者作為指標(biāo)就核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法。為解決用以上-提及的常規(guī)技術(shù)的問(wèn)題而密集研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)利用對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力和結(jié)構(gòu)變化能力二者作為指標(biāo)篩選核酸配體的方法。本發(fā)明的篩選核酸配體的方法是就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法。所述方法包括下列步驟(a)制備核酸配體候選體庫(kù)，所述核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域及用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域；(b)在靶物質(zhì)缺失下使候選配體庫(kù)接觸支持部，其中與包括在核酸配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在支持部的表面，然后通過(guò)利用在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及去除不形成分子間雙鏈體的核酸配體 ’及(C)通過(guò)在靶物質(zhì)存在下使靶物質(zhì)接觸步驟(b)中獲得的余下形成分子間雙鏈體的核酸配體來(lái)解離分子間雙鏈體，然后分離及收集具有通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合形成、的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體，其中方法包括至少一次步驟(b)及至少一次步驟(C)。此外，另一本發(fā)明的篩選核酸配體的方法是就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法。所述方法包括下列步驟(a’)制備核酸配體候選體庫(kù)，所述核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域及用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域；(b’ )在靶物質(zhì)存在下使候選配體庫(kù)與支持部接觸，其中與包括在核酸配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在支持部的表面，然后通過(guò)利用在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及收集不形成分子間雙鏈體的核酸配體 ’及U，)自步驟(b’)中分離的及收集的核酸配體去除靶物質(zhì)；及((1’)在靶物質(zhì)缺失下使支持部與步驟(c’)中獲得的去除靶物質(zhì)的核酸配體接觸，然后分離及收集在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的核酸配體。發(fā)明效果本發(fā)明可提供有效和系統(tǒng)性篩選對(duì)靶物質(zhì)具有親和性及與以上靶物質(zhì)結(jié)合之后在保守的序列結(jié)構(gòu)域中在彼此互補(bǔ)的多個(gè)預(yù)設(shè)計(jì)的序列之中形成特定分子內(nèi)雙鏈體的核酸配體的新方法。形成分子內(nèi)雙鏈體的保守的序列結(jié)構(gòu)域可用于通過(guò)使用另一靶物質(zhì)以類(lèi)似方式篩選的情況，從而各種傳感器裝置可系統(tǒng)性地和容易生產(chǎn)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的核酸配體可貢獻(xiàn)于利用在與靶物質(zhì)結(jié)合反應(yīng)之后核酸配體的結(jié)構(gòu)變化的各種領(lǐng)域的應(yīng)用(例如，各種生物傳感器，分子開(kāi)關(guān)，診斷劑)。尤其是，以上配體作為標(biāo)記的適體有效，其中將報(bào)告子分子(例如，熒光分子)加工為導(dǎo)入形成分子內(nèi)雙鏈體的區(qū)。例如，在基于適體的雙生色團(tuán)報(bào)告子方法中的適體傳感器中，在與靶物質(zhì)結(jié)合之后，2種類(lèi)型的標(biāo)記的分子之間的距離可精確地調(diào)控。而且，標(biāo)記的適體的特征的例包括隨著通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合后形成分子內(nèi)雙鏈體，與靶物質(zhì)的復(fù)合物的更多穩(wěn)定性。本發(fā)明的進(jìn)一步特征會(huì)從以下例示實(shí)施方式的說(shuō)明參照附圖而顯而易見(jiàn)。

圖I圖I是例證作為核酸配體候選體庫(kù)制備的核酸序列區(qū)的示意性模式圖。圖2A圖2A是例證本發(fā)明的分離步驟的示意性模式圖。圖2B圖2B是例證本發(fā)明的分離步驟的示意性模式圖。圖2C圖2C是例證本發(fā)明的分離步驟的示意性模式圖。圖3A圖3A是例證核酸序列的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的圖。圖3B圖3B是例證核酸序列的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的圖。圖3C圖3C是例證核酸序列的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的圖。圖3D圖3D是例證核酸序列的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的圖。圖3E圖3E是例證核酸序列的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的圖。圖3F圖3F是例證核酸序列的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果的圖。圖4圖4是例證顯示分離步驟之后核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度比的結(jié)果的圖。實(shí)施方式在下文中，使用圖，表，式和例來(lái)例證本發(fā)明的實(shí)施方式。此外，需知，這些圖，表，式，例和描述僅用于例證，不用于限制本發(fā)明的范圍。無(wú)需多言，另外的實(shí)施方式在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要它們遵循本發(fā)明的要旨。第I實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明的第I實(shí)施方式篩選核酸配體的方法是就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法，所述方法包括下列步驟(a) (C)。特別是，所述方法包括下列步驟Ca)制備核酸配體候選體庫(kù)，所述核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域及用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域；(b)在靶物質(zhì)缺失下使候選配體庫(kù)接觸支持部，其中與包括在核酸配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在支持 部的表面，然后通過(guò)利用作為接觸結(jié)果在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及去除不形成分子間雙鏈體的核酸配體 ’及(C)通過(guò)在靶物質(zhì)存在下使靶物質(zhì)接觸形成分子間雙鏈體及在步驟(b)中獲得的余下核酸配體來(lái)解離分子間雙鏈體，然后分離及收集具有通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合形成的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體，其中方法包括至少一次步驟(b)及至少一次步驟(c )?；蛘?，步驟(C)包括收集步驟(b)中獲得的余下形成分子間雙鏈體的核酸配體，使核酸配體與靶物質(zhì)混合，并使混合物與支持部接觸，然后通過(guò)利用不形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及收集具有與靶物質(zhì)結(jié)合后形成的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體。此外，在本發(fā)明中包括步驟(b)及步驟(C)的分離步驟可重復(fù)多次，并且次數(shù)不限制。例如，只要保持靶向的核酸序列群的分子數(shù)與未靶向的核酸配體群的分子數(shù)的比，或保持能鑒定靶向的核酸配體的分子數(shù)的比，從而實(shí)現(xiàn)篩選，則不限制次數(shù)。描述圖的編號(hào)。參照數(shù)字I表示用于PCR的(正向)引物序列。參照數(shù)字2表示莖-形成區(qū)(互補(bǔ)于參照數(shù)字4)。參照數(shù)字3表示隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域。參照數(shù)字4表示莖-形成區(qū)(互補(bǔ)于參照數(shù)字2)。參照數(shù)字5表示用于PCR的(反向)引物序列。參照數(shù)字6表示基材。參照數(shù)字7表示鏈霉親和素。參照數(shù)字8表示生物素。參照數(shù)字9表示包括莖-形成區(qū)的序列區(qū)。參照數(shù)字10表示靶物質(zhì)。如圖I和2A，2B和2C中例證，本實(shí)施方式的核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)10的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域3，用于形式特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域2和4。此外，根據(jù)本發(fā)明的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)可僅在核酸配體與給定靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)形成。此外，互補(bǔ)地結(jié)合于保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)的序列區(qū)布置在支持部9表面。使支持部接觸在核酸配體候選體庫(kù)中包括本發(fā)明的具有彼此互補(bǔ)的多個(gè)前保守的序列區(qū)(保守的序列結(jié)構(gòu)域)的靶向的核酸配體的核酸配體候選體庫(kù)。在此實(shí)施方式中，具有旨在的功能的核酸配體可通過(guò)利用候選配體庫(kù)中保守的序列結(jié)構(gòu)域之中形成分子內(nèi)互補(bǔ)雙鏈體的能力和與布置在支持部上的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域形成分子間互補(bǔ)雙鏈體的能力之間的差異來(lái)篩選。由于相比在分子間在分子內(nèi)更容易形成互補(bǔ)雙鏈體，當(dāng)在靶物質(zhì)缺失下(即，平衡偏倚)使候選配體庫(kù)接觸支持部時(shí)，在保守的序列結(jié)構(gòu)域之中容易形成分子內(nèi)互補(bǔ)雙鏈體。特別是，相比與布置在支持部的表面上的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域的分子間雙鏈體的形成，分子內(nèi)雙鏈體形成的可能性高。通過(guò)使用此現(xiàn)象，可分離及去除在保守的序列結(jié)構(gòu)域之中具有分子內(nèi)雙鏈體的核酸配體(未靶向的核酸配體)(圖2A)。本發(fā)明的靶向的核酸配體是與布置在支持部的表面上的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域形成分子間雙鏈體的核酸(圖2B)。通過(guò)在靶物質(zhì)存在下使靶向的核酸配體與靶物質(zhì)接觸及彼此結(jié)合來(lái)從支持部的表面分離靶向的核酸配體(圖2C)。因此，可篩選本發(fā)明的結(jié)合靶物質(zhì)的靶向的核酸配體。此外，僅本發(fā)明的能形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體結(jié)合靶物質(zhì)。由此，僅從支持部分離本發(fā)明的形成了與布置在支持部的表面上的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域結(jié)合的分子間雙鏈體的靶向的核酸配體。此外，本文中的短語(yǔ)"在靶物質(zhì)存在下"是指在具有游離靶物質(zhì)的條件或在具有結(jié)合到支持部的靶物質(zhì)的條件中存在。相反，短語(yǔ)"在靶物質(zhì)缺失下"是指既不在具有游離靶物質(zhì)的條件存在，也不在具有結(jié)合到支持部的靶物質(zhì)的條件存在。第2實(shí)施方式相反，在靶物質(zhì)存在下進(jìn)行相同的過(guò)程致使在靶向的核酸配體與待分離、富集及收集的靶物質(zhì)結(jié)合后核酸配體在保守的序列結(jié)構(gòu)域之中形成分子內(nèi)雙鏈體結(jié)構(gòu)。因此，根據(jù)本發(fā)明的第2實(shí)施方式的篩選核酸配體的方法是就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法，所述方法包括下列步驟(a’ ) (d’)。 特別是，所述方法包括下列步驟(a’ )制備核酸配體候選體庫(kù)，所述核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域及用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域；(b’ )在靶物質(zhì)存在下使候選配體庫(kù)與支持部接觸，其中與包括在核酸配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在支持部的表面，然后通過(guò)利用在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及收集不形成分子間雙鏈體的核酸配體；(c’ )自步驟(b’)中分離的及收集的核酸配體去除靶物質(zhì)；及(d’)在靶物質(zhì)缺失下使支持部與步驟(c’)中獲得的去除靶物質(zhì)的核酸配體接觸，然后分離及收集在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的核酸配體。第3 第5實(shí)施方式本發(fā)明的第3實(shí)施方式提供組合常規(guī)SELEX方法的篩選。特別是，該實(shí)施方式還在步驟(b)或(b’ )之前包括以下步驟使候選配體庫(kù)與靶物質(zhì)接觸，從而對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物；去除不形成復(fù)合物的核酸配體；自復(fù)合物僅分離及收集具有更高親和性的核酸配體；及擴(kuò)增具有更高親和性的核酸配體以產(chǎn)生富集的核酸配體的候選配體庫(kù)。此外，該實(shí)施方式還在步驟(d)或(d’ )之后包括以下步驟使靶物質(zhì)與形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的去除靶物質(zhì)的核酸配體接觸，步驟(d)或(d’)中獲得的核酸配體，從而對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物；去除不形成復(fù)合物的核酸配體；自復(fù)合物僅分離及收集具有更高親和性的核酸配體；及擴(kuò)增核酸配體以富集具有更高親和性的核酸配體。本發(fā)明的第4實(shí)施方式提供鑒定形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體的序列的方法，所述配體根據(jù)以上3種篩選方法的實(shí)施方式獲得。此實(shí)施方式特別在下列實(shí)施例中描述。本發(fā)明的第5實(shí)施方式提供用于就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)由此進(jìn)行以上相應(yīng)實(shí)施方式的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的試劑盒。該試劑盒包括核酸配體候選體庫(kù)，其包括用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域和隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域；及支持部，與保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在其表面。以下是在本發(fā)明中使用的支持部等的描述。除非另外描述，它們可應(yīng)用于全部實(shí)施方式。支持部/固定作為本實(shí)施方式的支持部的材料，可采用用于DNA微陣列和核酸純化的支持部材料。它們的例包括塑料，無(wú)機(jī)聚合物，金屬，金屬氧化物，天然的聚合物，它們的復(fù)合材料等。塑料的特定例包括聚乙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯，聚酰胺，苯酚樹(shù)脂，環(huán)氧樹(shù)脂，聚碳二亞胺樹(shù)脂，聚酰亞胺和丙烯酸樹(shù)脂等。此外，無(wú)機(jī)聚合物的特定例包括玻璃，石英，碳，硅膠，石墨等。此外，金屬和金屬氧化物的特定例包括金，鉬，銀，銅，鐵，鋁，磁體，鐵素體，礬土，氧化硅，順磁體，磷灰石等。天然的聚合物的例包括聚氨基酸，纖維素，殼多糖，殼聚糖，藻酸酯和其衍生物。本實(shí)施方式的支持部的形狀不特別限制。固定核酸的官能團(tuán)可導(dǎo)入支持部的表面材料，但其可不導(dǎo)入。在該情況中，固定可直接通過(guò)物理吸附進(jìn)行。固定核酸(例如，DNA)的常規(guī)知道的方法可在本發(fā)明中用于各種支持部表面。有隨機(jī)固定(例如，利用核酸的疏 水性的物理吸附，利用源于主鏈磷酸酯的負(fù)電荷的靜電吸附)由于對(duì)于支持部/分子的更低結(jié)合親和力而無(wú)法保留一定量的固定的可能性。因此，對(duì)于低-分子量核酸(寡聚體)的固定，可使用化學(xué)鍵。尤其是，核酸末端可固定于其上。例如，對(duì)于核酸直接固定到金的情況，可使用末端硫醇化的核酸。當(dāng)將羧酸基導(dǎo)入支持部的表面時(shí)，與末端胺基化的核酸的脫水和縮合致使固定進(jìn)行。而且，當(dāng)鏈霉親和素或親和素固定于支持部的表面時(shí)，可使用末端生物素化的核酸。為了輔助核酸候選配體庫(kù)與固定于支持部的核酸(保守的序列)的反應(yīng)，可在支持部和保守的序列之間插入接頭。接頭的插入允許在支持部的固相反應(yīng)期間待還原的分子的位阻。此外，接頭的長(zhǎng)度和種類(lèi)可依賴(lài)于反應(yīng)效率適當(dāng)選擇。而且，為了輔助反應(yīng)，支持部可加工成微粒。微?；率贡砻娣e變大，由于更低反應(yīng)體積，在高濃度條件下的反應(yīng)和假-液相反應(yīng)伴隨攪拌，這應(yīng)具有促進(jìn)效應(yīng)。此外，可使用微粒，以便簡(jiǎn)化分離步驟。使用的例包括微粒的離心，用微粒-包裝的柱純化，使用磁體分離和恢復(fù)等。作為從結(jié)合于支持部的核酸分離游離核酸的技術(shù)，可采用常規(guī)知道的技術(shù)。此外，從游離靶物質(zhì)純化結(jié)合于核酸的支持部的技術(shù)也可以類(lèi)似方式采用常規(guī)知道的技術(shù)。核酸配體、核酸配體候選體庫(kù)、及核酸根據(jù)本實(shí)施方式的術(shù)語(yǔ)〃核酸配體〃是指在化學(xué)感覺(jué)中具有期望效果的人工核酸。核酸配體常被稱(chēng)為〃適體"。本文所用術(shù)語(yǔ)〃適體〃是與〃核酸配體〃具有相同的含義的術(shù)語(yǔ)，除非另外特別描述。期望效果的例包括，但不限于，與靶物質(zhì)結(jié)合，催化性地改變靶物質(zhì)，抑制靶物質(zhì)的效應(yīng)，促進(jìn)靶物質(zhì)與其他分子的反應(yīng)等。在一實(shí)施方式中，這些效應(yīng)通過(guò)特異于靶物質(zhì)的親和性發(fā)揮。該靶物質(zhì)是非結(jié)合于核酸配體的核酸的化合物，所述結(jié)合由主要依賴(lài)于Watson/Crick氏堿基對(duì)或三聯(lián)體結(jié)合的機(jī)理介導(dǎo)。S卩，一個(gè)核酸與另一核酸雜交的那些未包括在本申請(qǐng)中。根據(jù)本實(shí)施方式的〃核酸配體候選體庫(kù)〃(在下文中，可稱(chēng)之為〃核酸候選配體庫(kù)")是具有各種序列的核酸的混合物，包括期望的適體的混合物。核酸配體候選體庫(kù)可源于天然地存在的核酸或其部分，化學(xué)合成的核酸，酶學(xué)地合成的核酸或由以上技術(shù)的組合產(chǎn)生的核酸。本實(shí)施方式的核酸配體候選體庫(kù)中包括的適體具有發(fā)揮以上期望效果的通用序列(例如，隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域)，及相鄰于隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域的多個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域。保守的序列結(jié)構(gòu)域數(shù)是至少2。各結(jié)構(gòu)域具有彼此互補(bǔ)的序列，其提供形成核酸的分子內(nèi)雙鏈體的前提。對(duì)于結(jié)構(gòu)域數(shù)是3或更大的情況，配體可具有，但不限于，作為組合彼此互補(bǔ)的至少一對(duì)序列結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本實(shí)施方式的"特定二級(jí)結(jié)構(gòu)"是指在保守的序列結(jié)構(gòu)域中的不同互補(bǔ)序列之中形成的至少分子內(nèi)雙鏈體。結(jié)構(gòu)包括形成包括鄰近布置的通用序列的分子內(nèi)雙鏈體的那些。此外，源于雙鏈體的三級(jí)結(jié)構(gòu)不特別限制。限定以上隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域的序列或核苷酸可被保守的序列結(jié)構(gòu)域分隔。隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域中的核苷酸數(shù)可依賴(lài)于核酸配體候選體庫(kù)的庫(kù)中分子數(shù)和實(shí)際篩選系統(tǒng)的體積，濃度等測(cè)定。例如，保守的序列結(jié)構(gòu)域可設(shè)計(jì)為插入在隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)，從而隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域夾在其間。該設(shè)計(jì)可確保一維定位，其中分子內(nèi)保守的序列結(jié)構(gòu)域位置遠(yuǎn)離。該定位致使由篩選獲得的適體經(jīng)歷與靶物質(zhì)相互作用后的結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)結(jié)構(gòu)變化，保守的序列結(jié)構(gòu)域可預(yù)期形成分子內(nèi)雙鏈體，并彼此最接近。
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保守的序列結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度(保守的序列結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度)不特別限制，但可為在不存在靶物質(zhì)的條件下不主要在保守的序列結(jié)構(gòu)域之中形成分子內(nèi)雙鏈體的長(zhǎng)度。例如，進(jìn)行本發(fā)明的步驟(a)，及就作為輸入量處理的總核酸配體候選體庫(kù)量估計(jì)在步驟(a)之后收集的核酸配體候選體庫(kù)量。然后，可適當(dāng)測(cè)定提供適當(dāng)?shù)暮Y選用回收率的保守的序列結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度。尤其是選擇完美互補(bǔ)序列，且于室溫在生理?xiàng)l件下，保守的序列結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度是5聚體和10聚體之間。保守的序列結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度可依賴(lài)于篩選的溫度，鹽濃度和pH及序列Tm值，等適當(dāng)修飾。例如，用于核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的軟件(例如，mfold)可以特定程度預(yù)測(cè)是否二級(jí)結(jié)構(gòu)在特定特異性核酸配體中在加工的保守的序列結(jié)構(gòu)域中容易形成。此外，保守的序列可不是完美互補(bǔ)。例如，保守的序列可包括錯(cuò)配喊基對(duì)，諸如G_G, G-T, G-A, A-A, A-C, C-C, C-T和T-T。在此情況中，保守的序列長(zhǎng)度不限制。保守的序列結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度不代表在具有靶物質(zhì)與根據(jù)本發(fā)明獲得的核酸配體的相互作用的條件下實(shí)際上形成雙鏈體的核苷酸數(shù)。結(jié)構(gòu)分析(例如，NMR分析)致使在與靶物質(zhì)實(shí)際結(jié)合期間適體中待分析的保守的序列結(jié)構(gòu)域之中形成雙鏈體的核苷酸數(shù)和位置。如果必需，最終核酸配體可通過(guò)下列步驟產(chǎn)生。首先，鑒定根據(jù)本發(fā)明獲得的一種或更多核酸配體。接下來(lái)，分析與靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)的適體結(jié)構(gòu)。然后，測(cè)定在包括與靶物質(zhì)結(jié)合的區(qū)及加工的保守的序列結(jié)構(gòu)域的區(qū)的近端的實(shí)際雙鏈體-形成位點(diǎn)。保守的序列結(jié)構(gòu)域可涉及通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合代表的期望效果。但是，作為各種序列設(shè)計(jì)的序列區(qū)可從各種靶物質(zhì)的系統(tǒng)性篩選的觀點(diǎn)來(lái)看為適合的。此外，根據(jù)本實(shí)施方式的〃核酸〃是指(單鏈或雙鏈)DNA和RNA，或其化學(xué)修飾的分子之一。修飾的例包括，但不限于，3’和5’修飾，諸如封頭。例還包括磷酸化，胺化，生物素化，硫醇化，熒光標(biāo)記等。對(duì)于本發(fā)明的篩選方法中獲得的適體應(yīng)用適合的修飾可預(yù)先進(jìn)行。此外，修飾可沿著序列進(jìn)行到中途。尤其是，修飾的例包括提供另外的化學(xué)基團(tuán)的那些，由此，核酸配體或全核酸配體的核苷酸合并另外的電荷，極化率，氫鍵合，靜電相互作用和流動(dòng)性。這些修飾致使對(duì)靶物質(zhì)的親和性的變異及結(jié)合能力增加。該修飾的例包括，但不限于，在位置2’的糖修飾，在第5位的嘧啶修飾，在第8位的嘌呤修飾，在環(huán)外胺的修飾，4-硫脲苷取代和5-溴-或5-碘-尿嘧啶取代，或還包括主鏈修飾，甲基化，罕見(jiàn)堿基配對(duì)組合(例如，異構(gòu)化堿基的異胞苷和異胍組合)等。當(dāng)在本發(fā)明中進(jìn)行擴(kuò)增步驟時(shí)，可選擇所述允許擴(kuò)增的修飾方法。反應(yīng)條件期望用于在本發(fā)明的篩選方法中的步驟的條件設(shè)置為條件與適體的實(shí)際使用條件相同(例如，溶液條件(例如，溫度，PH，鹽濃度，添加劑))。尤其是，其可包括，可在相同的條件(例如，溶液條件(例如，溫度，PH，鹽濃度))下進(jìn)行個(gè)體分離步驟和接觸游離靶物質(zhì)的步驟。關(guān)于向支持部添加非特異性吸附抑制物，條件可與實(shí)際使用的那些不同。靶物質(zhì)本實(shí)施方式的靶物質(zhì)是指期望且是目標(biāo)對(duì)象的化合物或分子。靶物質(zhì)可為廣泛的分子(例如，以蛋白，低-分子量化合物諸如代謝物為代表的生物聚合體)。靶物質(zhì)的特定例可包括，但不是特別限于，蛋白，肽，碳水化合物，糖，糖蛋白，激素，抗體，代謝物，過(guò)渡態(tài)
類(lèi)似物，輔因子，抑制物，藥物，營(yíng)養(yǎng)物等。即，只要能結(jié)合核酸配體并形成與配體的相互作用，靶物質(zhì)不具有特定限制，且可依賴(lài)于其目的適當(dāng)選擇。與SELEX方法組合具有更多對(duì)靶物質(zhì)的親和性的核酸序列可從核酸配體候選體庫(kù)通過(guò)使用還包括下列本發(fā)明的篩選核酸配體的方法中的步驟的方法得到。特別是，在步驟(b)或(b’)之前還包括下列步驟(i) (iv)。步驟(i)是使祀物質(zhì)與候選配體庫(kù)接觸的步驟，由此通過(guò)對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物。步驟(ii)是去除不形成復(fù)合物的核酸配體的步驟。步驟(i i i )是自復(fù)合物僅分離及收集具有更高親和性的核酸配體的步驟。步驟(iv)是通過(guò)擴(kuò)增具有更高親和性的核酸配體產(chǎn)生富集的核酸配體候選體庫(kù)的步驟。以上步驟落入稱(chēng)之為SELEX方法名下?？蓪⒈旧暾?qǐng)方法與常規(guī)知道的SELEX方法或其改良的方法組合。組合中的組合方式和步驟順序不特別限制。作為一實(shí)施方式，首先，進(jìn)行SELEX方法。然后，獲得具有更高親和性的核酸配體候選體庫(kù)。那之后，在靶物質(zhì)缺失下分離及去除本發(fā)明的未靶向的在保守的序列結(jié)構(gòu)域之中具有分子內(nèi)雙鏈體的核酸配體。最終，分離及收集在游離靶物質(zhì)存在下在保守的序列結(jié)構(gòu)域之中形成分子內(nèi)雙鏈體的本發(fā)明的靶向的核酸。此外，在本發(fā)明的步驟(d)或(d’)之后，可包括下列步驟(I) (IV)。步驟(I)是使靶物質(zhì)與形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的去除靶物質(zhì)的核酸配體接觸的步驟，步驟(d)或步驟(d’ )中獲得的配體，由此由對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物。步驟(II)是去除不形成復(fù)合物的核酸配體的步驟。步驟(III)是自復(fù)合物僅分離及收集具有更高親和性的核酸配體的步驟。步驟(IV)是通過(guò)擴(kuò)增富集具有更高親和性的核酸配體的步驟。從如盡可能減少收集期間的損失或減少偏移的具有更少步驟數(shù)的方法的觀點(diǎn)來(lái)看，該組合對(duì)于篩選單元是期望的。分離步驟可與SELEX方法重復(fù)相同的次數(shù)，但數(shù)不特別限制。例如，對(duì)于最后一輪SELEX方法中獲得的核酸候選配體庫(kù)，靶向的核酸序列可通過(guò)利用雙鏈體-形成能力中的差異(一旦有)重復(fù)分離步驟來(lái)獲得。此外，利用雙鏈體-形成能力中的差異的分離步驟數(shù)可依賴(lài)于其目的各自確定。分離步驟數(shù)可各不同。當(dāng)組合SELEX方法時(shí)，利用雙鏈體-形成能力的分離步驟的反應(yīng)條件(例如，溫度，pH，鹽濃度)可與使核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物形成的SELEX方法中步驟的那些相同。添加劑(例如，向支持部的對(duì)于靶物質(zhì)或核酸候選配體庫(kù)的非特異性吸附抑制物)可適當(dāng)變化，因?yàn)樗鼈円蕾?lài)于支持部和其表面官能團(tuán)的類(lèi)型，靶物質(zhì)類(lèi)型等。通過(guò)SELEX方法獲得具有更高對(duì)靶物質(zhì)的親和性的核酸序列的原理可用于本申請(qǐng)，且不特別限制。一般而言，在SELEX方法中，進(jìn)行這樣的步驟，其使候選配體庫(kù)與靶物質(zhì)接觸，由此由相比步驟(i)中獲得的候選配體庫(kù)具有更高對(duì)靶物質(zhì)的親和性的核酸序列形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物。接下來(lái)，將靶物質(zhì)固定于固體支持物，并使與核酸候選配體庫(kù)反應(yīng)。然后，過(guò)程包括反應(yīng)之后洗滌及收集形成復(fù)合物的核酸候選配體庫(kù)。通過(guò)改變?cè)诜磻?yīng)期間的嚴(yán)格度并在此過(guò)程洗滌，可獲得具有更高親和性的核酸序列。嚴(yán)格度包括反應(yīng)期間的溫度，緩沖劑PH，鹽濃度，添加劑及洗滌等，且可依賴(lài)于其目的修飾。以上固體支持物被定義為致使靶物質(zhì)經(jīng)共價(jià)鍵或非-共價(jià)鍵連接的任何表面。固體支持物的例包括，但不限于，膜，塑料，順磁珠，負(fù)荷的紙，尼龍，Langmuir-Blodgett膜,官能化的玻璃，鍺，硅，PTFE，聚苯乙烯，砷化鎵，金和銀?？蔀楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其他物質(zhì)，所述物質(zhì)包括能具有布置在表面的官能團(tuán)(例如，氨基，羧基，氫硫基，羥基)的那 些。這些表面的例包括任何拓?fù)鋵W(xué)表面，包括，但不限于，球形表面，具溝的表面和球面。相反，通過(guò)不使用固體支持物接觸游離靶物質(zhì)而使復(fù)合物形成，之后是通過(guò)利用來(lái)自復(fù)合物的物理性質(zhì)自余下核酸候選配體庫(kù)分級(jí)分離是可能的。例如，可利用等溫電泳和層析。本文所述的擴(kuò)增步驟可采用常規(guī)知道的方法，及，例如，可通過(guò)PCR方法達(dá)到。核酸候選配體庫(kù)由PCR方法擴(kuò)增。然后，例如，自雙鏈體，由PCR方法使用生物素化的引物擴(kuò)增之后，可用鏈霉親和素柱分離及去除由擴(kuò)增形成的雙鏈體中核酸配體序列的相反鏈(互補(bǔ)鏈)。擴(kuò)增步驟及其后的分離和純化步驟不限于以上描述的方法。當(dāng)進(jìn)行擴(kuò)增步驟時(shí)，核酸候選配體庫(kù)的序列包括通用序列結(jié)構(gòu)域(例如，隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域)及保守的序列結(jié)構(gòu)域，以及引物序列結(jié)構(gòu)域，其是保守的序列，用于擴(kuò)增。被稱(chēng)之為PCR擴(kuò)增的引物序列結(jié)構(gòu)域可在核酸候選配體庫(kù)的兩端加工。引物序列結(jié)構(gòu)域不特別限制。但是，可選擇不容易與上述保守的序列結(jié)構(gòu)域形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列。此允許PCR擴(kuò)增有效進(jìn)行。用于預(yù)測(cè)核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)的軟件(例如，mfold軟件)可用作測(cè)定方法。引物序列結(jié)構(gòu)域可通過(guò)設(shè)置部分通用序列結(jié)構(gòu)域作為一些模型序列，設(shè)置為保守的序列結(jié)構(gòu)域和用于擴(kuò)增的引物序列結(jié)構(gòu)域，并檢查保守的序列結(jié)構(gòu)域和用于擴(kuò)增的引物序列結(jié)構(gòu)域之間二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成的能力來(lái)選擇。此外，可將保守的序列結(jié)構(gòu)域的全區(qū)或其部分用作用于擴(kuò)增的引物序列結(jié)構(gòu)域的部分。一實(shí)施方式可包括布置保守的序列結(jié)構(gòu)域，如通用序列(隨機(jī)序列)夾在其間，且用于擴(kuò)增的引物序列結(jié)構(gòu)域是還布置在保守的序列結(jié)構(gòu)域兩端(圖I)。一實(shí)施方式可還包括，將部分保守的序列結(jié)構(gòu)域用作引物序列結(jié)構(gòu)域，以減少對(duì)用于擴(kuò)增的引物序列結(jié)構(gòu)域的核酸配體結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。核酸序列可插入相應(yīng)序列結(jié)構(gòu)域之間作為接頭部分。適體傳感器和另外的使用根據(jù)本發(fā)明獲得的核酸配體被認(rèn)為是以高精確度進(jìn)行藥物遞送的多功能藥物或物質(zhì)，鑒定為能與涉及，例如，特定代謝通路，或涉及蛋白的代謝物特異性相互作用的核酸配體的配體。而且，認(rèn)為能與模擬反應(yīng)中間體的分子特異性相互作用的適體的鑒定致使經(jīng)歷不穩(wěn)定反應(yīng)中間體的多步驟反應(yīng)有效進(jìn)行。此外，通過(guò)將配體吸附或附接于石英結(jié)晶單元，表面等離子體共振基材，電極或表面聲波裝置來(lái)可將核酸配體用作所謂的生物傳感器。尤其是，使用的例可包括生物-傳感器，分子開(kāi)關(guān)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等，其利用根據(jù)本申請(qǐng)的與靶物質(zhì)結(jié)合后的特定結(jié)構(gòu)變化。
實(shí)施例盡管以下詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I首先，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，由此展示在靶物質(zhì)存在或缺失下的分離，利用分子內(nèi)莖區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)-形成能力的分離，如描述于圖2A，2B和2C。將序列加入chl-47適體序列(SEQ ID NO: I)的兩端，所述chl-47適體序列是對(duì)于靶物質(zhì)(膽 酸)的適體序列，描述于Nucleic Acids Research, 2000，vol. 28，No. 9，1963-1968，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)膽酸適體序列(SEQID N0:2)。以上SEQ ID NO:2設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)膽酸適體序列，并通過(guò)使用用于預(yù)測(cè)核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的軟件(mfold軟件)在于20°C具有5mM的Mg2+和300mM的Na+條件下使經(jīng)歷結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)描述于圖3A和3B的2種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)作為對(duì)于膽酸的標(biāo)準(zhǔn)適體的穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。兩種結(jié)構(gòu)包括包含莖區(qū)，第I莖-環(huán)區(qū)和第2莖-環(huán)區(qū)的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(即，3-式連接)，與公開(kāi)于以上之前報(bào)道的出版物的那些類(lèi)似。當(dāng)考慮以上之前報(bào)道的出版物時(shí)，結(jié)合于膽酸的區(qū)預(yù)測(cè)為3-式連接位點(diǎn)。SEQ ID NO: I :5’ -GATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTC-3，SEQ ID NO: 2 :5，-CAATTGATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTCAGATAGTATGTTCATCAG-3’描述于圖3A和3B的莖區(qū)各具有具有9bp或IObp的區(qū)。為了展示本發(fā)明的原理，莖區(qū)的長(zhǎng)度被適當(dāng)縮短，由此在恒定溫度改變莖-形成能力。然后，進(jìn)行由本發(fā)明的分離步驟的分離。在莖區(qū)中從圖I中區(qū)2和區(qū)4的兩端各刪除2bp和3bp的序列(在區(qū)2和區(qū)4之間形成)設(shè)計(jì)為莖缺失組(SEQ ID N0:3和4)。將2種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)(圖3C和3D)預(yù)測(cè)為具有2bp缺失的序列的穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。而且，將2種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)(圖3E和3F)預(yù)測(cè)為具有3bp缺失的序列的穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。接下來(lái)，預(yù)測(cè)相應(yīng)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，及將圖I中區(qū)2和區(qū)4之間形成的莖的堿基對(duì)長(zhǎng)度總結(jié)于表I。表I例證了缺失組的序列和莖區(qū)的預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度之間的關(guān)系，從而認(rèn)識(shí)莖長(zhǎng)度和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)中的差異。然后，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)膽酸適體序列和其缺失組序列進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。SEQ ID NO: 3 :5，-CAATTTCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3’SEQ ID NO: 4 :5’-CAATTCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGAGATAGTATGTTCATCAG-3’表I由niFOLD預(yù)測(cè)..
__(圖丨中區(qū)2和區(qū)4之間形成的)莖區(qū)長(zhǎng)度^_
3bp 缺失 6; 7bp__- 4.66, - 4.87 kcal/mol
2bp 缺失 ~ O, 6bp__-15.22, -15.03 kcal/mol
標(biāo)準(zhǔn)序列 I 9，iObp-16,14, -16.32 kcal/mol實(shí)施例2在實(shí)施例I中設(shè)計(jì)的序列在SIGMA Genosys Inc中合成為寡聚體。通過(guò)使用PCR用引物序列(SEQ ID NO: 5和6)檢查PCR條件。結(jié)果顯示，將生產(chǎn)自TAKARA BIO Inc.的TAKARA LA Taq用作酶(根據(jù)流程的反應(yīng)溶液)，且對(duì)于反應(yīng)條件，進(jìn)行于98°C變性10s，于55°C退火30s，及于72°C延伸15s的25次的循環(huán)。最終，將一個(gè)循環(huán)(于72°C持續(xù)Imin)力口 入條件。以上條件設(shè)為PCR條件以擴(kuò)增各序列至具有幾乎相當(dāng)?shù)牧?，及在后續(xù)使用。SEQ ID N0:5 :5’ -GAGGGCAGCGATAGC-3’SEQ ID N0:6 :5’ -GTGCTGATGAACATACTATCT-3’實(shí)施例3通過(guò)利用莖區(qū)中分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)(雙鏈體)_形成能力作為指標(biāo)展示，各種序列的豐度比改變。為此目的，將互補(bǔ)于各序列(標(biāo)準(zhǔn)膽酸適體序列，具有2bp或3bp缺失的序列)的莖區(qū)的5’-生物素化的寡序列(SEQ ID NO: 7，8和9)在SIGMA Genosys Inc中合成為寡聚體。在 TTK 緩沖劑(IOOmM Tris-HCl (pH8. 0),0. l%Tween20, IM KCl)中制備具有 50 μ M的終濃度的各生物素化的寡DNA。將自Bangs Laboratories, Inc.生產(chǎn)的固定了鏈霉親和素的珠(Img)用TTK緩沖劑洗滌兩次。接下來(lái)，去除緩沖劑，并將具有50 μ M或25 μ I的濃度的各種生物素化的寡DNA加入不同管。然后，使混合物于室溫伴隨攪拌反應(yīng)I小時(shí)。用分光光度計(jì)測(cè)定(在260nm處)反應(yīng)之后上清液的吸光度，及確證，幾乎全部量的輸入的DNA被固定。然后，用磁體收集珠，以去除上清液，并將50 μ I的0. 15Ν NaOH加入去除非-特異性吸附的DNA。將珠用TT緩沖劑(250mM Tris-HCl (pH8. 0),0. l%Tween20)充分洗滌。那之后，將珠懸浮于TTE緩沖劑(250mM Tris-HCl (pH8. 0),0. l%Tween20, 20mMEDTA)，及于80°C溫育lOmin，以去除不穩(wěn)定鏈霉親和素。最終，將珠用核酸分離用緩沖劑(50mM Tris-HCl (pH7. 6),300mM NaCl, 30mM KCl, 5mM MgCl2)洗滌 5 次，并懸浮于新鮮核酸分離用緩沖劑。用分光光度計(jì)測(cè)量(在427nm處)吸光度，并估計(jì)其上固定生物素化的DNA序列的相應(yīng)珠的濃度。SEQ ID N0:7 :5’ -CTGCCCTCGATCAATTG-3’SEQ ID N0:8 :5’ -CTGCCCTCGAAATTG-3’SEQ ID N0:9 :5’ -CTGCCCTCGAATTG-3’實(shí)施例4首先，各稱(chēng)重50 μ g的如在實(shí)施例3中制備的固定了相應(yīng)生物素化的寡DNA的珠。接下來(lái)，用核酸分離用緩沖劑制備對(duì)應(yīng)于各DNA的適體序列至具有IOOnM的終濃度和50 μ I的體積。通過(guò)于96°C處理IOmin變性之后，使混合物于室溫緩慢冷卻。然后，將混合物與50 μ g的以上固定的珠混合，并在具有20°C溫度的溫育器中伴隨攪拌反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)之后立即將珠和上清液分離并通過(guò)使用磁體收集。關(guān)于珠，用核酸分離用緩沖劑洗滌兩次之后，將它們懸浮于新鮮核酸分離用緩沖劑，以于80°C反應(yīng)lOmin。最終，立即分離上清液并通過(guò)使用磁體從珠收集。實(shí)施例5首先，各稱(chēng)重50 μ g的如在實(shí)施例3中制備的固定了相應(yīng)生物素化的寡DNA的珠。接下來(lái)，用IOmM含有膽酸的核酸分離用緩沖劑制備對(duì)應(yīng)于各DNA的適體序列至具有IOOnM的終濃度和50 μ I的體積。通過(guò)于96°C處理IOmin變性之后，使混合物于室溫緩慢冷卻。然后，將混合物與50μ g的以上固定的珠混合，并在具有20°C溫度的溫育器中伴隨攪拌反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)之后立即將珠和上清液分離并通過(guò)使用磁體收集。用核酸分離用緩沖劑洗滌兩次之后，將珠懸浮于新鮮核酸分離用緩沖劑，以于80°C反應(yīng)lOmin。最終，立即分離上清液并通過(guò)使用磁體從珠收集。實(shí)施例6將在實(shí)施例4和5中收集的DNA樣品由Promega Wizard SV Gel和PCR清潔系統(tǒng)(根據(jù)流程)純化，并在實(shí)施例2的PCR條件下擴(kuò)增，除了循環(huán)數(shù)改變?yōu)?0次之外。然后，通過(guò)電泳和EtBr染色檢查擴(kuò)增條帶。由ImageJ (NIH開(kāi)發(fā)的開(kāi)放資源圖像處理軟件)計(jì)算條帶強(qiáng)度。將標(biāo)準(zhǔn)膽酸適體序列的擴(kuò)增條帶強(qiáng)度設(shè)為1，并關(guān)于上清液樣品，與對(duì)應(yīng)固定的珠反應(yīng)之后，將相應(yīng)缺失序列(2bp，3bp)與標(biāo)準(zhǔn)序列比較，以計(jì)算缺失序列的條帶強(qiáng)度(圖4)。結(jié)果展示，在各序列與固定了生物素化的DNA的珠反應(yīng)之后，對(duì)于在實(shí)施例4中收集的上清液樣品觀察到強(qiáng)度減小。尤其是，減小對(duì)于2bp缺失序列大。在各序列與固定了生物素化的DNA的珠反應(yīng)之后，對(duì)于在實(shí)施例5中收集的上清液樣品也以類(lèi)似方式觀察到強(qiáng)度減小。但是，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度減小小于實(shí)施例4。這些結(jié)果伴隨莖長(zhǎng)度和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，如描述于表1，展示莖區(qū)-形成能力在膽酸缺失下依賴(lài)于相比標(biāo)準(zhǔn)序列的長(zhǎng)度的缺失組的長(zhǎng)度而降低(實(shí)施例4)。結(jié)果，與互補(bǔ)鏈在珠上形成分子間雙鏈體的頻度增加。這因此提示，上清DNA濃度降低。在膽酸存在下恢復(fù)上清液中DNA的濃度(擴(kuò)增條帶強(qiáng)度)(實(shí)施例5)。由此，通過(guò)膽酸與缺失組DNA結(jié)合輔助莖區(qū)中分子內(nèi)雙鏈體形成，由此降低在珠上與互補(bǔ)鏈形成分子間雙鏈體的頻度。這因此提示，上清DNA的濃度增加。而且，在缺失組(2bp，3bp)中，在膽酸存在下2bp缺失的強(qiáng)度恢復(fù)更大。關(guān)于在膽酸缺失下穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，如顯示于表l，2bp缺失導(dǎo)致結(jié)構(gòu)具有Obp (全結(jié)構(gòu)的AG=-15. 22kcal/mol)和6bp (-15. 03kcal/mol)的莖長(zhǎng)度，及 3bp 缺失導(dǎo)致結(jié)構(gòu)具有 6bp (全結(jié)構(gòu)的 ΔG=-14. 66kcal/mol)和 7bp (-14. 87kcal/mol)的莖長(zhǎng)度。考慮到此，2bp缺失允許分子內(nèi)莖區(qū)通過(guò)結(jié)合于膽酸而恢復(fù)，從而在膽酸缺失下穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為顯著移位。實(shí)施例7接下來(lái)，設(shè)計(jì)圖I中示意性顯示的核酸候選配體庫(kù)的序列(SEQID NOilO和11)和對(duì)照序列(SEQ ID NO: 12)，且它們作為寡聚體合成。SEQ ID NO: 10通過(guò)隨機(jī)化對(duì)于膽酸的chl-47適體序列(SEQID NO: I)的僅第2莖-環(huán)區(qū)及通過(guò)在隨機(jī)化的序列的兩端添加PCR用引物序列來(lái)構(gòu)建。SEQ、 ID NO: 11通過(guò)隨機(jī)化對(duì)于膽酸的chl-47適體序列(SEQ ID NO: I)的第I和第2莖-環(huán)區(qū)及通過(guò)在隨機(jī)化的序列的兩端添加PCR用引物序列來(lái)構(gòu)建。對(duì)照序列通過(guò)在對(duì)于膽酸的chl-47適體序列的兩端添加PCR用引物序列來(lái)構(gòu)建。作為寡聚體以類(lèi)似方式合成用于SELEX方法的PCR引物序列(SEQ ID NO: 13和14)。設(shè)計(jì)SEQ ID NO: 13,由此擴(kuò)增實(shí)際適體序列鏈，并在5’端生物素化。SEQ ID N0:10 :5’-GTACCAGCTTATTCAATTTCGAGGGCAGCGATAGCTGNNNNNNNNNNNNNNNNNCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3’SEQ ID NO: 11 :5’-GTACCAGCTTATTCAATTTCGAGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3，SEQ ID NO: 12 :5’-GTACCAGCTTATTCAATTTCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3’SEQ ID NO: 13:5’ -gtaccagctt attcaattt-3’SEQ ID NO: 14:5，-ctgatgaaca tactatctc-3’實(shí)施例8將模型靶物質(zhì)，膽酸，固定于96-孔板，其通過(guò)使用下列過(guò)程生產(chǎn)，由此進(jìn)行SELEX方法。首先，向生產(chǎn)自Sumitomo Bakelite Inc.的胺基化的96-孔板(Sumi Ion ELISA板)添加ImM的光交聯(lián)基團(tuán)接頭，生產(chǎn)自Thermo Scientific Inc.的NHS-LC-二氮雜環(huán)丙烯(6-(4, 4’ -疊氮戊酰胺基)己酸琥珀酰亞胺酯)和200 μ I/孔的PBS (磷酸鹽緩沖液)緩沖齊U。然后，使氨基與NHS于室溫在暗條件下伴隨攪拌反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)之后，去除反應(yīng)溶液，并添加200 μ I的IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. O)。接下來(lái)，將混合物于室溫處理5min，以滅活未反應(yīng)的NHS。然后，去除溶液，并將板用PBS良好洗滌3次，以添加200 μ I的O. 5mM含有膽酸的溶液(H20)。用真空干燥器干燥之后，將板直接放置在365nm UV燈(15wX 2)下，以進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)15min。那之后，將板用PBS良好洗滌。最終，將板用水漂洗，并在N2氣體下干燥，以用干燥器中的擋板保存板，直到其使用。此方法允許膽酸無(wú)取向地固定，且不需要將特定官能團(tuán)用于固定。此過(guò)程尤其是對(duì)于小分子進(jìn)行SELEX方法中非常有用的，且二氮雜環(huán)丙烯的卡賓物種具有非常有力的反應(yīng)性，且適合于各種低-分子量化合物的固定。實(shí)施例9用結(jié)合緩沖劑(50mMTris-HCl (pH7. 6),300mM NaCl, 30mMKCl, 5mMMgCl2, 0. 01%Tween20, 0. 1%PEG8000)制備如在實(shí)施例7中生產(chǎn)的具有IOOnM的濃度的核酸候選配體庫(kù)。使候選配體庫(kù)在95°C變性5min,且不攪拌地于室溫放置30min。根據(jù)實(shí)施例3生產(chǎn)固定了生物素化的DNA(SEQ ID NO:8)的珠。接下來(lái)，根據(jù)實(shí)施例4使以上核酸候選配體庫(kù)與固定的珠反應(yīng)。將上述實(shí)施例4的核酸分離用緩沖劑變?yōu)樵诖藢?shí)施例中的結(jié)合緩沖劑。將反應(yīng)溫度變?yōu)?5°C。待在此步驟中獲得的結(jié)合珠的級(jí)分(核酸候選配體庫(kù))用在下列實(shí)施例中。如果需要，此步驟可重復(fù)幾次。實(shí)施例10將在實(shí)施例9中收集的候選配體庫(kù)于95°C變性5min，及不攪拌地于室溫放置30min。接下來(lái)，將100 μ I的候選配體庫(kù)加入在實(shí)施例8中制備的固定了膽酸的板，并伴隨攪拌于25V反應(yīng)I小時(shí)。然后，將板用結(jié)合緩沖劑良好洗滌，并加入100 μ I的5mM含有膽酸的溶液(結(jié)合緩沖劑)，以伴隨攪拌處理板30min。而且，將板于95°C處理5min，然后洗脫結(jié)合于固定的膽酸的核酸候選配體庫(kù)。將洗脫的混合物由Promega Wizard SV Gel和PCR清潔系統(tǒng)(根據(jù)流程)純化，并溶于50 μ I的無(wú)菌水。那之后，通過(guò)使用用于SELEX方法的PCR引物序列(SEQ ID NO: 13和14)進(jìn)行PCR。
使用TAKARA LA Taq(反應(yīng)溶液根據(jù)流程)，而對(duì)于反應(yīng)條件，進(jìn)行于94°C變性30s，于48°C退火30s，及于72°C延伸15s的30次的循環(huán)。在最后，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)(于72°C持續(xù)lmin)。擴(kuò)增的DNA由Wizard SV Gel和PCR清潔系統(tǒng)(根據(jù)流程)純化，及通過(guò)使用生產(chǎn)自Bangs Laboratories, Inc.(根據(jù)流程)的固定了鏈霉親和素的珠收集僅生物素化的核酸候選配體庫(kù)。此步驟定義為一個(gè)循環(huán)，并重復(fù)10個(gè)循環(huán)。實(shí)施例11使用在實(shí)施例3中生產(chǎn)的固定了生物素化的DNA (SEQ ID N0:8)的珠以根據(jù)實(shí)施例5的方式處理在實(shí)施例10中收集的核酸候選配體庫(kù)。在實(shí)施例5的步驟中，將核酸分離用緩沖劑變?yōu)榻Y(jié)合緩沖劑，并將溫度從20°C變?yōu)?5°C。收集此步驟的上清液級(jí)分。此步驟可重復(fù)幾次。接下來(lái)，由Wizard SV Gel和PCR清潔系統(tǒng)(Promega Inc.)(根據(jù)流程)進(jìn)行緩沖劑取代和純化，并在用于SELEX方法的PCR條件下，通過(guò)使用未生物素化的引物序列進(jìn)行PCR。那之后，克隆擴(kuò)增的DNA，并隨機(jī)測(cè)定挑選的克隆的核苷酸序列。獲得如通過(guò)SELEX方法富集的結(jié)合于膽酸的適體的DNA序列群。
實(shí)施例12從得到的結(jié)合于膽酸的適體的DNA序列除去用于SELEX方法的PCR弓丨物序列。作為寡聚體合成得到的序列，并通過(guò)使用SPR和ITC，等評(píng)價(jià)其結(jié)合于膽酸的性質(zhì)。實(shí)施例13從得到的結(jié)合于膽酸的適體的DNA序列除去用于SELEX方法的PCR引物序列。作為寡聚體合成將熒光FAM (激發(fā)495nm，發(fā)射520nm)和熒光ROX (激發(fā)590nm，發(fā)射610nm)連接到得到的序列的兩端的序列。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定添加膽酸之前及之后的FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)。在FAM激發(fā)時(shí)，確證在膽酸存在下ROX的熒光強(qiáng)度增加的現(xiàn)象。實(shí)施例14獲得在膽酸存在或缺失結(jié)合于膽酸的適體的DNA序列的CD譜。然后，測(cè)定在膽酸存在下形成雙鏈體之后的⑶譜變化。實(shí)施例15將結(jié)合于膽酸的適體的DNA序列群與通過(guò)未使用固定了生物素化的DNA (SEQ IDN0:8)的珠進(jìn)行分離步驟的SELEX方法獲得的DNA序列群比較。確證源于根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的序列群的結(jié)合于膽酸的適體在FRET中具有增加的效率和大的CD譜變化。這表明，本發(fā)明賦予與靶物質(zhì)結(jié)合后預(yù)加工的莖區(qū)之間形成分子內(nèi)雙鏈體的結(jié)構(gòu)變化能力，且表明，對(duì)膽酸具有結(jié)合親和力的適體分子可通過(guò)本發(fā)明的篩選方法有效獲得。此外，得到的本發(fā)明的適體分子應(yīng)尤其是具有作為用于熒光感覺(jué)的捕獲分子的效應(yīng)。從前述實(shí)施例鑒定了本發(fā)明的形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體序列。工業(yè)實(shí)用性通過(guò)本篩選方法鑒定的核酸配體致使在與靶物質(zhì)相互作用之后在預(yù)加工的保守的結(jié)構(gòu)域之間形成分子內(nèi)雙鏈體?？蓪⑺鼈冇绕涫怯米骼么私Y(jié)構(gòu)變化的生物傳感器，分子開(kāi)關(guān)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。例如，將熒光報(bào)告子分子導(dǎo)入通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合形成的分子內(nèi)雙鏈體的特定位點(diǎn)致使達(dá)到穩(wěn)定的信號(hào)。此外，復(fù)合物應(yīng)穩(wěn)定化，因?yàn)榉肿觾?nèi)雙鏈體在與靶物質(zhì)結(jié)合之后形成，從而可實(shí)現(xiàn)具有更高結(jié)合親和力的核酸配體。此外，用于導(dǎo)入熒光報(bào)告子分子的位點(diǎn)可還以通過(guò)進(jìn)行靶物質(zhì)與根據(jù)本方法獲得的核酸配體的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析的方式精確地設(shè)計(jì)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，即便靶物質(zhì)改變，仍可類(lèi)似地利用保守的序列。由此，所述方法是獲得核酸配體的系統(tǒng)性方法。所述方法在操作多物質(zhì)的情況中，諸如在允許傳感器陣列及允許在本體系統(tǒng)中檢測(cè)多個(gè)不同種類(lèi)的情況中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。此外，在本發(fā)明的篩選方法中，通過(guò)利用對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力和結(jié)構(gòu)變化能力二者作為指標(biāo)獲得核酸配體，由此,關(guān)注由于再加工失去對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力，由此給配體賦予結(jié)構(gòu)變化能力。 本申請(qǐng)要求2010年2月26日提交的日本專(zhuān)利申請(qǐng)No. 2010-043559，和2011年I 月31日提交的No. 2011-018651的權(quán)利，將它們通過(guò)引用整體并入本文。
權(quán)利要求
1.就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法，所述方法包括 (a)制備核酸配體候選體庫(kù)，所述核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域及用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域； (b)在靶物質(zhì)缺失下使庫(kù)與支持部接觸，其中與包括在核酸配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在支持部的表面，然后通過(guò)利用在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及去除不形成分子間雙鏈體的核酸配體；以及 (C)通過(guò)在靶物質(zhì)存在下使靶物質(zhì)與(b)中獲得的余下形成分子間雙鏈體的核酸配體接觸來(lái)解離分子間雙鏈體，然后分離及收集具有通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合形成的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體， 其中方法包括至少一次(b)及至少一次(C)。
2.權(quán)利要求I的篩選方法，其中(C)包括 收集(b)中獲得的余下形成分子間雙鏈體的核酸配體，使核酸配體與靶物質(zhì)混合，并使混合物與支持部接觸，然后通過(guò)利用不形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及收集具有與靶物質(zhì)結(jié)合后形成的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體。
3.權(quán)利要求I的篩選方法，還在(c)之后包括，(d)從收集的形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體去除靶物質(zhì)。
4.權(quán)利要求I的篩選方法，還在(b)之前包括 使庫(kù)與靶物質(zhì)接觸，從而對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物； 去除不形成復(fù)合物的核酸配體； 自復(fù)合物僅分離及收集具有更高親和性的核酸配體；以及 擴(kuò)增具有更高親和性的核酸配體以產(chǎn)生富集的核酸配體候選體庫(kù)。
5.權(quán)利要求3的篩選方法，還在(d)之后包括 使靶物質(zhì)與形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的去除靶物質(zhì)的核酸配體接觸，(c)中獲得的核酸配體，從而對(duì)靶物質(zhì)具有更高親和性的核酸配體形成核酸配體-靶物質(zhì)復(fù)合物； 去除不形成復(fù)合物的核酸配體； 自復(fù)合物僅分離及收集具有更高親和性的核酸配體；以及 擴(kuò)增核酸配體以富集具有更高親和性的核酸配體。
6.就與靶物質(zhì)結(jié)合后形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體篩選核酸配體候選體庫(kù)的方法，所述方法包括 Ca')制備核酸配體候選體庫(kù)，所述核酸配體包括用于結(jié)合靶物質(zhì)的隨機(jī)序列結(jié)構(gòu)域及用于形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守的序列結(jié)構(gòu)域； (b’ )在靶物質(zhì)存在下使庫(kù)與支持部接觸，其中與包括在核酸配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)互補(bǔ)地結(jié)合的互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域布置在支持部的表面，然后通過(guò)利用在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的現(xiàn)象分離及收集不形成分子間雙鏈體的核酸配體； (c’ )自(b’)中分離的及收集的核酸配體去除靶物質(zhì)；以及(d’)在靶物質(zhì)缺失下使支持部與(c’)中獲得的去除靶物質(zhì)的核酸配體接觸，然后分離及收集在支持部的表面核酸配體和互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域之間形成分子間雙鏈體的核酸配體。
7.鑒定形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸配體的序列的方法，其中所述配體根據(jù)權(quán)利要求I獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供就核酸配體篩選候選體庫(kù)的方法，所述方法包括下列步驟(a)制備核酸配體候選體庫(kù)；(b)在靶物質(zhì)缺失下使庫(kù)與支持部接觸，所述支持部與包括在配體中的保守的序列結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)結(jié)合，然后分離及移出不形成分子間雙鏈體的配體；及(c)通過(guò)在靶物質(zhì)存在下使靶物質(zhì)接觸步驟(b)中獲得的余下形成分子間雙鏈體的配體來(lái)解離分子間雙鏈體，然后分離及收集具有通過(guò)與靶物質(zhì)結(jié)合形成的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的配體，其中方法包括至少一次步驟(b)及至少一次步驟(c)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102791883SQ20118001029
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者伊比井崇向, 畠山哲 申請(qǐng)人:佳能株式會(huì)社