專利名稱：尸胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尸胺的制備方法。特別是，本發(fā)明涉及通過使微生物分泌產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶從而有效制備尸胺的方法。
背景技術(shù)：
聚酰胺(PA)是用作汽車行業(yè)、運(yùn)動(dòng)行業(yè)、生活時(shí)尚行業(yè)中 所使用的一系列特殊塑料的原材料的重要聚合物組，ニ胺是所述聚酰胺的重要原材料単體成分。ニ胺和ニ羧酸縮合形成各種聚合物，此時(shí)，聚合物的特性由ニ胺和ニ羧酸的鏈長(zhǎng)決定。通常，ニ胺以化學(xué)方式經(jīng)過ニ羧酸的中間階段而由衍生自石油的材料來(lái)制備；或者通過氨基酸的化學(xué)脫羧反應(yīng)來(lái)制備(非專利文獻(xiàn)I )?？紤]到石油價(jià)格的高漲，期望快速變化為下述方法通過酶反應(yīng)或微生物培養(yǎng)等生物技術(shù)方法從可再生資源中合成ニ胺。于是，作為可以通過生物技術(shù)方法制備的ニ胺，尸胺受到廣泛關(guān)注。尸胺別名為1，5-戊ニ胺，是可以用作聚酰胺的原材料単體的化合物。另外，尸胺是生物體內(nèi)普遍存在的生物胺，其生物合成體系正逐步被闡明(參考非專利文獻(xiàn)2)，作為其生物合成途徑的一部分，已知對(duì)從賴氨酸開始的尸胺脫羧反應(yīng)進(jìn)行催化的賴氨酸脫羧酶(LDC)。并且作為L(zhǎng)DC基因，已知有衍生自大腸桿菌(Escherichia coli)的LDC基因(參考非專利文獻(xiàn)3)。在傳統(tǒng)的利用生物技術(shù)方法的尸胺制備方法中，大致分為利用以向微生物中導(dǎo)入LDC基因?yàn)榛A(chǔ)、以賴氨酸為底物的酶反應(yīng)的制備方法，或者利用微生物培養(yǎng)的尸胺制備方法。此外，作為利用微生物培養(yǎng)的尸胺制備方法，已知有利用重組大腸桿菌的培養(yǎng)的制備方法(參考專利文獻(xiàn)I);在產(chǎn)賴氨酸的微生物的棒狀桿菌中，進(jìn)ー步提高賴氨酸生產(chǎn)能力的方法(參考專利文獻(xiàn)2);切斷尸胺降解體系的方法(參考專利文獻(xiàn)3);以及切斷賴氨酸輸送體系的方法(專利文獻(xiàn)4)。但是，特別是在利用微生物培養(yǎng)的尸胺制備方法中需要解決的問題較多，例如有這樣的問題在對(duì)向產(chǎn)賴氨酸的微生物的棒狀桿菌中導(dǎo)入了 LDC基因的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物賴氨酸(參考非專利文獻(xiàn)4)。當(dāng)生成副產(chǎn)物賴氨酸時(shí)，盡管可以制得前體，但尸胺的產(chǎn)率沒有提高；另外，為了將尸胺用作聚酰胺的原材料，尸胺的高純度化很重要，但是如果產(chǎn)生副產(chǎn)物賴氨酸，則對(duì)于尸胺精制而言負(fù)擔(dān)會(huì)増加，從而造成經(jīng)濟(jì)上的問題?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2002-223770號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開2004-222569號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :日本特表2009-531042號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn) 4 W02008/092720 號(hào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :須山、金尾，「薬學(xué)雑誌」，1965年，第85卷，p. 513-533非專利文獻(xiàn)2 :セリアホワイ卜テ一バ一(Celia white tabor)、其他I人，「マイク ロ バイオ ロジカルレビユ一ズ(Microbiological Reviews) J, 1985 年，第 49 卷，p. 81-99非專利文獻(xiàn)3 :シユアンメング(Shi-yuanmeng)、其他I人，「ジヤ一ナルオブバクテリオロジ一(Journal of Bacteriology)」，1992年，第174 卷，p. 2659-2669非專利文獻(xiàn)4 :耳塚孝、其他4人、「バイオサイヱンスバイオテクノロジーアンドバイオケミス卜リ一(Bioscience, Biotechnology, and, Biochemistry)」，2007 年，第 71
卷，p. 2130-213
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的課題在于提供ー種利用微生物培養(yǎng)的尸胺制備方法，其中在微生物培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在微生物培養(yǎng)液中不殘留作為尸胺前體的賴氨酸。解決問題的手段本發(fā)明人為了使在微生物培養(yǎng)結(jié)束時(shí)賴氨酸不殘留在培養(yǎng)液中而進(jìn)行了專心的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物，在微生物培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，賴氨酸不會(huì)殘留在培養(yǎng)液中，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明由下列(I)至(6)構(gòu)成。(I) 一種尸胺的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物。(2)上述(I)所述的尸胺制備方法，其特征在干，向用于培養(yǎng)所述微生物的培養(yǎng)基中添加賴氨酸。(3)上述(I)或(2)所述的尸胺制備方法，其特征在于，通過使在賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列的N末端側(cè)添加有分泌信號(hào)肽的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所述微生物向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶。(4)上述(3)所述的尸胺制備方法，其特征在于，所述微生物通過具有基因構(gòu)建體，從而使在賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列的N末端側(cè)添加有分泌信號(hào)肽的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其中所述基因構(gòu)建體在核酸序列的5'到3'方向上包含在該微生物中起作用的啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列、以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列。(5)上述(3)或(4)所述的尸胺制備方法，其特征在于，所述分泌信號(hào)肽為由序列號(hào)13至43中的任一氨基酸序列所表示的肽。(6)上述(I)至(5)中任意一項(xiàng)所述的尸胺制備方法，其特征在于，賴氨酸脫羧酶來(lái)源于大腸桿菌。(7)上述(I)至(6)中任意一項(xiàng)所述的尸胺制備方法，其特征在于，所述微生物為棒狀桿菌或大腸桿菌。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，在利用微生物培養(yǎng)的尸胺制備方法中，由于在微生物培養(yǎng)終止時(shí)在培養(yǎng)液中不殘留賴氨酸，因此與傳統(tǒng)的制備方法相比，尸胺對(duì)糖收率提高，并且在精制用作聚酰胺原材料的尸胺時(shí)的精制エ序中的負(fù)荷也可以降低。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的方法為這樣一種尸胺制備方法，其通過培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物來(lái)進(jìn)行制備。需要指出的是，在本說明書中，賴氨酸脫羧酶被“分泌”到細(xì)胞外是指賴氨酸脫羧酶被運(yùn)送到微生物外(細(xì)胞外)，并且最終賴氨酸脫羧酶完全以游離狀態(tài)存在于培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中的情況。這里提到的分泌不包括僅賴氨酸脫羧酶的一部分存在于細(xì)胞外的情況，也不包括賴氨酸脫羧酶結(jié)合在微生物表層而存在的情況。向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物迄今為止還未知，但是可以通過基因重組技術(shù)，使所期望的微生物向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶。具體而言，通過使在賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列的N末端側(cè)添加有分泌信號(hào)妝的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而能夠向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶。對(duì)本發(fā)明中所用的賴氨酸脫羧酶沒有特別限定，但是優(yōu)選L-賴氨酸脫羧酶。另外，關(guān)于賴氨酸脫羧酶的來(lái)源也沒有特別限制，但是優(yōu)選使用來(lái)源于(例如)耐鹽芽抱桿菌(Bacillus halodurans)、枯草芽抱桿菌(bacillus subtilis)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli ;大腸桿菌)、反會(huì)月形單胞菌(Selenomonas ruminamtium)、霍 亂弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛鏈霉菌(Streptomyces pilosus)、侵蝕艾肯菌(Eikenellacorrodens)、卩遼氨基酸真桿菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia Alvei)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)、或者深海熱球菌(Pyrococcusabyssi)的賴氨酸脫羧酶，更優(yōu)選為來(lái)源于安全性得到確認(rèn)的大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶。這些賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列登記在數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中。分泌信號(hào)肽原本是作為為了使分泌性蛋白質(zhì)向細(xì)胞外分泌而發(fā)揮作用的信號(hào)肽序列被發(fā)現(xiàn)的。已知的是，分泌性蛋白質(zhì)一般在被翻譯為前肽或前肽原之后，形成成熟蛋白質(zhì)，但是此時(shí)，在翻譯為前肽或前肽原之后，伴隨著向細(xì)胞外的分泌，由蛋白酶(一般也稱為信號(hào)肽酶)切斷分泌信號(hào)肽(“pre部分”)，變?yōu)槌墒祀幕螂脑?，肽原被蛋白酶進(jìn)一步切斷其pro部分而變?yōu)槌墒祀模缓蠓置诘郊?xì)胞外。而且，已知的是，分泌信號(hào)肽具有下述功能其不僅僅使分泌性蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，還通過使非分泌性蛋白質(zhì)和分泌信號(hào)肽融合，從而使非分泌性蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，本發(fā)明中，通過使分泌信號(hào)肽與賴氨酸脫羧酶融合，能夠有效地使賴氨酸脫羧酶分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明所使用的分泌信號(hào)肽可以來(lái)源于不同的微生物，也可以是所使用的微生物的分泌信號(hào)肽，但是優(yōu)選來(lái)源于所使用的微生物的分泌性蛋白質(zhì)。此外，可用于本發(fā)明目的的分泌信號(hào)肽也可以部分含有作為其來(lái)源的天然成熟蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列。作為分泌信號(hào)肽的具體例子，可以列舉來(lái)源于大腸桿菌的TorA (三甲胺N-氧化物還原酶)、SufI(Suppressor of ftsl ;ftsl 抑制劑)，來(lái)源于枯草芽抱桿菌(Bacillus Subtilis)的 PhoD(磷酸酯酶)、LipA(脂肪酶),來(lái)源于球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)的異麥芽糖葡聚糖酶(MD)等分泌信號(hào)肽(分別參照序列號(hào)13至17);專利3711658號(hào)公報(bào)所記載的分泌信號(hào)肽(參照序列號(hào)18);來(lái)源于Microbiology (2009)，155，p. 741-750中所記載的谷氨酸棒桿菌 R 的分泌信號(hào)肽 CgR0079、CgRO120、CgRO124、CgR0900、CgR0949、CgR1023、CgR1448、CgR2137、 CgR2677、 CgR2926、 CgR0040、 CgR0789、 CgR0865、 CgR1522、 CgR1819、 CgR2213、CgR2386和CgR2535 (分別參照序列號(hào)19至36);日本特開平9-316095號(hào)公報(bào)所記載的分泌信號(hào)妝(參照序列號(hào) 37) ;Applied and Environmental Microbiology, (1995), 61 (4), p.1610-1613所記載的作為枯草桿菌蛋白酶的分泌信號(hào)肽的arpE信號(hào)肽(參照序列號(hào)38)；Applied and Environmental Microbiology, (2003)，69 (I)，p. 358-366 所記載的分泌信號(hào)肽(參照序列號(hào) 39);以及 Trends in Microbiology, (2005)，13 (4)，p. 175-180 所記載的分泌信號(hào)肽(參照序列號(hào)40至43)。需要說明的是，作為上述賴氨酸脫羧酶和分泌信號(hào)肽，在具有其功能的范圍內(nèi)，也包括分別在各氨基酸序列中，發(fā)生I個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失、插入或添加而得到的蛋白質(zhì)。這里，“多個(gè)”通常為I至7個(gè)的程度，優(yōu)選I至5個(gè)，特別優(yōu)選I至2個(gè)。另外，作為上述賴氨酸脫羧酶和分泌信號(hào)肽，在具有其功能的范圍內(nèi)，對(duì)于氨基酸序列的序列一致性，可以是具有通常為85%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上序列一致性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。上述這樣的氨基酸序列的置換、缺失、插入或添加，優(yōu)選保守性置換。作為置換原來(lái)的氨基酸并被視為保守性置換的氨基酸，可以舉出Ala向Ser或Thr的置換，Arg向Gin、His 或 Lys 的置換,Asn 向 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 的置換,Asp 向 AsruGlu 或 Gln 的置換，Cys 向 Ser 或 Ala 的置換，Gln 向 Asn、Glu、Lys> His、Asp 或 Arg 的置換，Glu 向 Asn、Gin、Lys 或 Asp 的置換,Gly 向 Pro 的置換,His 向 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr 的置換，Ile 向 Leu、Met、Val 或 Phe 的置換，Leu 向 lie、Met、Val 或 Phe 的置換，Lys 向 Asn、Glu、Gin、His 或Arg 的置換，Met 向 lie、Leu、Val 或 Phe 的置換，Phe 向 Trp> Tyr> Met、Ile 或 Leu 的置換，Ser向Thr或Ala的置換，Thr向Ser或Ala的置換，Trp向Phe或Tyr的置換，Tyr向His、Phe或Trp的置換，以及Val向Met、Ile或Leu的置換。作為通過基因重組使在微生物中的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列N末端側(cè)添加有分泌信號(hào)肽的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，可以舉出將基因構(gòu)建體導(dǎo)入微生物的方法，其中所述基因構(gòu)建體在核酸序列的5'到3'方向上包含在該微生物中起作用的啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列、以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列。
對(duì)本發(fā)明所使用的啟動(dòng)子序列沒有特別限定，只要是能夠在所使用的微生物體內(nèi)起作用的啟動(dòng)子序列即可，一般都能使用，還可以是來(lái)源于異種的啟動(dòng)子，但是作為優(yōu)選的啟動(dòng)子的例子，可以列舉出各種氨基酸生物合成體系，例如谷氨酸生物合成體系的谷氨酸脫氫酶基因，谷氨酸合成體系的谷氨酸合成酶基因，賴氨酸生物合成體系的天冬氨酸激酶基因，蘇氨酸生物合成體系的高絲氨酸脫氫酶基因，異亮氨酸和纈氨酸生物合成體系的乙酰羥基酸合成酶基因，亮氨酸生物合成體系的2-異丙基蘋果酸合成酶基因，脯氨酸和精氨酸生物合成體系的谷氨酸激酶基因，組氨酸生物合成體系的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成體系的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶基因；肌苷酸和鳥苷酸這樣的核酸生物合成體系，例如磷酸核糖焦磷酸(PRPP)氨基轉(zhuǎn)移酶基因，肌苷酸脫氫酶基因和鳥苷酸合成酶基因的各個(gè)啟動(dòng)子；以及tac啟動(dòng)子等強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的序列登記在數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中。本發(fā)明所使用的編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列只要是能翻譯上述分泌信號(hào)肽的核酸序列即可，并沒有特別的限定，可以參考分泌信號(hào)肽的氨基酸序列的密碼子(標(biāo)準(zhǔn)基因密碼)來(lái)決定(參考* 一卜 > 生化學(xué)第3版東京化學(xué)同人，p. 526),此時(shí),可以利用對(duì)于本發(fā)明所使用的微生物而言常用的密碼子來(lái)重新設(shè)計(jì)核酸序列。具體而言，可以列舉出編碼來(lái)源于大腸桿菌的TorA (三甲胺N-氧化物還原酶)、SufI (Suppressor of ftsl ;ftsl抑制劑)，編碼來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)的PhoD (磷酸酯酶)、LipA (脂肪酶)，編碼來(lái)源于球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)的異麥芽糖葡聚糖酶(IMD)等分泌信號(hào)肽的核酸序列(分別參照序列號(hào)44至48);編碼日本專利3711658號(hào)公報(bào)所記載的分泌信號(hào)肽的核酸序列(參照序列號(hào)49);編碼來(lái)源于Microbiology (2009)，155，p. 741-750所記載的谷氨酸棒桿菌R的分泌信號(hào)肽CgR0079、CgRO120, CgRO124, CgR0900、CgR0949、CgR1023、CgR1448、CgR2137、CgR2677、CgR2926、CgR0040、CgR0789、CgR0865、CgR1522、CgR1819、CgR2213、CgR2386和CgR2535的核酸序列(分別參照序列號(hào)50至67);編碼日本特開平9-316095號(hào)公報(bào)所記載的分泌信號(hào)肽的核酸序列(參照序列號(hào)68);編碼Applied andEnvironmental Microbiology, (1995), 61 (4), p. 1610-1613 所記載的分泌信號(hào)肽的核酸序列(參照序列號(hào) 69);編碼 Applied and Environmental Microbiology, (2003), 69 (I), p. 358-366所記載的分泌信號(hào)肽的核酸序列(參照序列號(hào)70);以及編碼Trends in Microbiology, (2005)，13 (4)，p. 175-180所記載的分泌信號(hào)肽的核酸序列(參照序列號(hào)71至74)。關(guān)于本發(fā)明所使用的編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列，作為具體例子，可以列舉出 編碼來(lái)源于上述生物的賴氨酸脫羧酶的核酸序列，此時(shí)，可以根據(jù)所用微生物的密碼子的使用頻率，來(lái)重新設(shè)計(jì)核酸序列。需要說明的是，編碼來(lái)源于上述生物的賴氨酸脫羧酶的核酸序列登記在數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中。作為上述啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列，在具有其功能的范圍內(nèi)，還包括在各核酸序列中，發(fā)生I個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、插入或添加的核酸序列。這里，“多個(gè)”通常為I至40個(gè)的程度，優(yōu)選I至30個(gè)，更優(yōu)選I至20個(gè)，特別優(yōu)選I至10個(gè)，最優(yōu)選I至5個(gè)。另外，作為上述啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列，在具有其功能的范圍內(nèi)，可以列舉出與所述核酸序列或者其互補(bǔ)鏈的全體或一部分在嚴(yán)格條件下雜交的核酸序列。這里，“在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸”是指將選自原來(lái)的堿基序列中任意至少20個(gè)、優(yōu)選25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)連續(xù)序列中的I個(gè)或多個(gè)核酸序列作為探針，并使用眾所周知的雜交技術(shù)(CurrentProtocols I Molecular Biology edit. Ausbel 等，(1987)Publish. John ffily&SonsSection 6. 3-6. 4)等進(jìn)行雜交的核酸序列。此處作為嚴(yán)格條件，例如在50%甲酰胺的存在下，在雜交溫度為37°C、作為更加嚴(yán)格的條件為42°C、作為進(jìn)一步嚴(yán)格的條件為65°C時(shí)，通過用0. I至2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)洗滌，由此可實(shí)現(xiàn)雜交。另外，作為上述啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列，在具有其功能的范圍內(nèi)，也可以為序列一致性通常在85%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上的序列一致性的核酸序列。這樣的啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列，也可以從本來(lái)的宿主以外取得，還可以通過對(duì)從本來(lái)的宿主所得到的核酸序列進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的體外突變處理、或者部位特異性突變處理而取得。本發(fā)明所使用的基因構(gòu)建體除了包含上述啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列之外，為了使它們起作用，還可以在適當(dāng)?shù)奈恢镁哂惺官嚢彼崦擊让冈谖⑸锛?xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的控制序列(操縱子和終止子等)。對(duì)可以用于所述構(gòu)建體的載體并沒有特別限制，只要是在微生物中能夠起作用的就可以，可以是像質(zhì)粒那樣在染色體外自主擴(kuò)增的載體，也可以是整合到細(xì)菌染色體中的載體。另外，還可以使用人エ轉(zhuǎn)座子等。在使用轉(zhuǎn)座子時(shí)通過同源重組或其自身的轉(zhuǎn)移能力而將目的基因?qū)肴旧w中。需要說明的是，基因構(gòu)建體的構(gòu)建或其確認(rèn)方法可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分子生物學(xué)方法完成，例如可以參考Sambrook等，Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York, DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glovered. 1985) ; F. M. Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (1994)John ffilley&Sons, Inc. , PCR Technology:Principles and Application for DNAAmplication, H. Erlich, ed. , Stockton Press,等。對(duì)上述基因構(gòu)建體向微生物中的導(dǎo)入方法沒有特別限定，例如，可以通過原生質(zhì)體法(Gene, (1985), 39, p. 28ト286)、電穿孔法(Bio/Technology, (1989)，7，1067-1070)等導(dǎo)入。作為本發(fā)明中的向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物，優(yōu)選通過基因重組能夠 導(dǎo)入上述基因構(gòu)建體的微生物，作為具體例子，可以列舉大腸桿菌(大腸埃希氏菌)、枯草桿菌、真菌、酵母、棒狀桿菌等，但是優(yōu)選大腸桿菌或棒狀桿菌，它們是已知能夠有效生產(chǎn)作為尸胺前體的賴氨酸的微生物。作為大腸桿菌的具體例子，可以使用MC1061菌株、HBlOl菌株、JM105菌株、JM109菌株、DH5a菌株和JE5505菌株等。另外，棒狀桿菌為好氧性革蘭氏陽(yáng)性桿菌，傳統(tǒng)上分類為短桿菌屬，但是現(xiàn)在也被包括在統(tǒng)ー為棒狀桿菌屬的細(xì)菌中(Int. J. Syst. Bacteriol.，(1981)41, p. 225)。另外，包括與棒狀桿菌屬非常接近的短桿菌屬細(xì)菌。作為這樣的棒狀桿菌的例子，可以列舉出嗜こ酸こ酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophylum)、醋谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、解燒棒狀桿菌(Corynebacteriumalkanolyticum)、帚石南棒桿菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、 H 合棒桿囷(Corynebacterium Iiliumノ、棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium mellassecola)、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、% 效柄5 桿囷(Corynebacterium efficiensノ、力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium divaricatumノ、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム インマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)、玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)、解糖短桿菌(BrevibacteriumsaccharoIyticum)> 生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、白短桿囷(Brevibacterium album)、フ レビ ノ、クテリウム セリヌム(Brevibacterium cerinum)、嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilumノ。另外，作為各棒狀桿菌的具體菌株，可以舉出嗜こ酰こ酸棒桿菌ATCC13870，醋谷氨酸棒狀桿菌ATCC15806，解烷棒狀桿菌ATCC21511，帚石南棒桿菌ATCC15991，谷氨酸棒桿菌ATCC13020、ATCC13020、ATCC13060,百合花棒桿菌ATCC15990，棲糖蜜棒桿菌ATCC17965，有效棒桿菌AJ12340(保藏編號(hào)FERM BP-1539)，力士棒桿菌ATCC13868，乳發(fā)酵短桿菌 ATCC14020，黃色短桿菌 ATCC13826、ATCC14067、AJ12418 (保藏編號(hào)FERM BP-2205),ブレビバクテリウム インマリオフイラムATCC 14068，乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC 13869，ブレビバクテリウム ロゼウムATCC 13825，解糖短桿菌ATCC 14066，生硫短桿菌ATCC 19240，產(chǎn)氨短桿菌ATCC6871、ATCC6872,白短桿菌ATCC 15111，ブレビバクテリウム セリヌムATCC 15112，嗜氨微桿菌 ATCC 15354。上述棒狀桿菌可以從(例如)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心處購(gòu)買獲得。也就是說，每個(gè)菌株都附帯有對(duì)應(yīng)的登記號(hào)，該登記號(hào)記載在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中，可以參考該登記號(hào)購(gòu)買獲得各菌株。本發(fā)明中，優(yōu)選使用上述棒狀桿菌中的谷氨酸棒桿菌。另外，作為谷氨酸棒桿菌ATCC13869的抗鏈霉素突變株而分離的谷氨酸棒桿菌AJ12036 (保藏編號(hào)FERM BP-734)(昭和59年3月26日首次保藏，獨(dú)立行政法人産業(yè)技術(shù)総合研究所特許生物寄託センター)與其親代菌株(野生株)相比，預(yù)計(jì)在與蛋白質(zhì)分泌相關(guān)的功能基因中存在突變，異種蛋白質(zhì)的分泌生產(chǎn)能力在最佳培養(yǎng)條件下的蓄積量極高，大約為2至3倍，因此優(yōu)選作為分泌賴氨酸脫羧酶的棒狀桿菌(參考W002/081694)。
作為向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的確認(rèn)方法，培養(yǎng)微生物并進(jìn)行離心分離，測(cè)定在使培養(yǎng)上清液和微生物分離而得到的培養(yǎng)上清液中的賴氨酸脫羧酶活性，確認(rèn)其有無(wú)即可。另外，向細(xì)胞外分泌的賴氨酸脫羧酶的量可以由免疫印跡法或ELISA法等利用抗原-抗體反應(yīng)的定量法來(lái)進(jìn)行定量。在培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物時(shí)，可以在培養(yǎng)液中生成并蓄積尸胺。作為培養(yǎng)方法，可以使用分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。在連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行例如日本特開2008-104453號(hào)公報(bào)所記載的連續(xù)培養(yǎng)。作為培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，可以使用含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等普通的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。作為碳源，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉水解產(chǎn)物等糖類，こ醇等醇類，醋酸、乳酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。作為氮源，可以使用氨水，氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨等各種無(wú)機(jī)和有機(jī)銨鹽類，尿素，其它含氮化合物，以及肉類提取物、酵母提取物、玉米漿、大豆水解產(chǎn)物等含氮有機(jī)物。作為無(wú)機(jī)鹽，可以使用磷酸ー氫鉀、磷酸ニ氫鉀、硫酸銨、氯化鈉、硫酸鎂、碳酸鈣等。此外，根據(jù)需要，可以添加生物素、硫胺素、維生素B6等微量營(yíng)養(yǎng)源。這些微量營(yíng)養(yǎng)源也可以用肉類提取物、酵母提取物、玉米漿、酸水解酪素等培養(yǎng)基添加物來(lái)替代。需要說明的是，在本發(fā)明中，向培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中預(yù)先添加賴氨酸也是優(yōu)選的方案之一。若向培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中預(yù)先添加賴氨酸，則培養(yǎng)液中被分泌到細(xì)胞外的賴氨酸脫羧酶就以預(yù)先添加的賴氨酸為基質(zhì)，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槭?，因此能夠提高尸胺的制備效率。向培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中預(yù)先添加賴氨酸時(shí)，作為培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中的賴氨酸的濃度，并沒有特別的限制，但是優(yōu)選不會(huì)對(duì)微生物的増殖造成惡劣影響，且不會(huì)對(duì)賴氨酸脫羧酶造成阻礙的濃度，具體而言優(yōu)選為0. 01至2M。所添加的賴氨酸優(yōu)選L-賴氨酸。另外，所添加的賴氨酸可以為游離體，也可以為賴氨酸鹽，作為賴氨酸鹽，優(yōu)選賴氨酸鹽酸鹽或來(lái)源于下述ニ羧酸的賴氨酸 ニ羧酸鹽。另夕卜，作為賴氨酸 ニ羧酸鹽的優(yōu)選具體例子，可以舉出賴氨酸 己ニ酸鹽、賴氨酸 癸ニ酸鹽、賴氨酸 1，12-十二烷雙酸鹽、賴氨酸 琥珀酸鹽、賴氨酸 間苯二甲酸鹽、賴氨酸 對(duì)苯二甲酸鹽，作為更優(yōu)選的具體例子，可以舉出賴氨酸 己二酸鹽。對(duì)培養(yǎng)條件沒有特別的限制，在振蕩培養(yǎng)、深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度一般為25°C至42°C，優(yōu)選為28°C至38°C。培養(yǎng)時(shí)間通常為I天至6天。培養(yǎng)pH的調(diào)節(jié)優(yōu)選使用氨水、鹽酸或二羧酸，更優(yōu)選使用二羧酸。使用這些中和劑將培養(yǎng)PH調(diào)節(jié)到5至8，優(yōu)選最好控制在pH6. 5至7. 5。此外，對(duì)中和劑的狀態(tài)并沒有限制，以氣體、液體、固體或水溶液形式使用。特別優(yōu)選水溶液。
對(duì)優(yōu)選用作中和劑的二羧酸沒有特別限定，但是優(yōu)選的是，除了上述2個(gè)羧基以夕卜，實(shí)質(zhì)上不存在其它官能團(tuán)的二羧酸。這里所說的官能團(tuán)為在聚酰胺聚合反應(yīng)(作為反應(yīng)條件，例如，反應(yīng)溫度250至270°C，壓力10至20kg/cm2，反應(yīng)時(shí)間I至5小時(shí))時(shí)，與氨基或羧基等反應(yīng)，造成聚合物的分支、或使聚合物的結(jié)晶度下降(結(jié)晶度80%以下)的反應(yīng)基團(tuán)，例如，氨基或羧基就符合該官能團(tuán)，另外，酸性基團(tuán)(磺酸基、磷酸基、酚羥基等)、堿性基團(tuán)(肼基等)、質(zhì)子極性基(羥基等)、具有斷裂性的基團(tuán)(環(huán)氧基、過氧化基等)或者其它反應(yīng)性高的基團(tuán)(異氰酸根基)也符合該官能團(tuán)。另一方面，鹵素取代基、芳香性取代基、醚基、酯基、酰胺基等反應(yīng)性低，不符合這里所說的官能團(tuán)。作為二羧酸，更優(yōu)選的是由下列通式(I)、(2)或(3)所表示的二羧酸。HOOC- (CH2) m-C00H (I)(通式(I)中，m=0至 16)。[化學(xué)式I]
COOH
I
(c_
I (2)
Vj
(CHz)O
I
OXW(通式(2)中，n、o=0至 16)。[化學(xué)式2]
COOH
(CH2)P
(3)
(通式(3)中，p、q=0至 16)。另外，作為ニ羧酸，進(jìn)ー步優(yōu)選己ニ酸、癸ニ酸、1，12-十二烷ニ羧酸、琥珀酸、間苯
ニ甲酸、對(duì)苯ニ甲酸。培養(yǎng)液中的尸胺以尸胺的游離體或尸胺鹽的形式存在。作為收集培養(yǎng)液中的尸胺的方法，首先從培養(yǎng)液中除去微生物。作為分離方法，優(yōu)選使用對(duì)微生物進(jìn)行沉淀除去、離心分離、膜過濾分離等傳統(tǒng)已知的方法。作為從除去了微生物的含有尸胺的培養(yǎng)液中收集尸胺的方法，還可以如日本特開2009-207495號(hào)公報(bào)中所記載的那樣，以尸胺 ニ羧酸鹽的形式結(jié)晶析出并進(jìn)行收集。另夕卜，也可以如日本特開2009-29872號(hào)公報(bào)中所記載的那樣，利用NF膜對(duì)尸胺的游離體進(jìn)行精制并收集。另外，還可以如日本特開2009-28045號(hào)公報(bào)中記載的那樣，利用極性有機(jī)溶劑提取并蒸餾，從而收集尸胺的游離體。
實(shí)施例下面列舉實(shí)施例和對(duì)比例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。另外，除非另有說明，否則實(shí)施例和對(duì)比例中所用的全部培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基以及培養(yǎng)用培養(yǎng)基都進(jìn)行一般的滅菌操作(例如121で、30分鐘的高壓蒸汽滅菌，或0. 45iim過濾器滅菌)，以滅菌后的狀態(tài)使用。(尸胺和賴氨酸濃度的HPLC分析方法)使用柱子CAPCELLPAK C18 (資生堂)流動(dòng)相:0. 1% (w/w)磷酸水溶液:こ月青=4. 5:5. 5檢測(cè)UV360nm樣品預(yù)處理在25 ill分析樣品中添加25 ill的1，4_ 丁ニ胺(0. 03M)作為內(nèi)標(biāo)物，添加150 ill碳酸氫鈉(0. 075M)以及2，4- ニ硝基氟苯(0. 2M)的こ醇溶液加以混合，在37°C下保溫I小吋。將50iU上述反應(yīng)溶液溶解在Imlこ腈中，然后以10，OOOrpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行5分鐘離心，取10 U I上清液進(jìn)行HPLC分析。參考例I (能夠生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的制作)為了制作能夠合成作為尸胺前體的賴氨酸的谷氨酸棒桿菌，通過向天冬氨酸激酶中導(dǎo)入有效突變來(lái)制作賴氨酸生產(chǎn)菌。通過Apppl. Microbiol.Biotechnol.，(2002)，58，p. 217-223中記載的方法，制作了谷氨酸棒桿菌AK-1菌株(以下簡(jiǎn)稱AK-I菌株)。此菌株的天冬氨酸激酶能夠解除賴氨酸和蘇氨酸引起的反饋抑制。因此就能夠通過培養(yǎng)來(lái)合成賴氨酸了。接下來(lái)，通過對(duì)AK-I菌株進(jìn)一步進(jìn)行基因重組，制得向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的棒狀桿菌(實(shí)施例1、2)、以及不向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的棒狀桿菌(對(duì)比例I)。實(shí)施例I (向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的谷氨酸棒桿菌的制作)(其I :利用Tat途徑)(I) HOM基因的克隆作為導(dǎo)入賴氨酸脫羧酶基因的基因座，選擇了高絲氨酸脫氫酶。對(duì)對(duì)應(yīng)于HOM基因的從N末端開始的300個(gè)氨基酸區(qū)域的基因進(jìn)行了克隆。參照數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中登記的HOM基因(登記號(hào)BA000036)的堿基序列，合成了寡核苷酸引物(序列號(hào)I和序列號(hào)2)。將來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的、根據(jù)常規(guī)方法配制的基因組DNA溶液作為擴(kuò)增模板，各取0. 2u I裝入0. 2ml的微量離心管中，添加各種試劑各引物20pmol、pH8. 0的Tris鹽酸緩沖液(20mM)、氯化鉀(2. 5mM)、明膠(lOOii g/ml)、各 dNTP (50 y M)、LATaqDNA 聚合酶(2 單位)(寶酒造制)，使總量為50iU。在DNA變性條件為94°C、30秒，引物的退火條件為55°C、30秒，DNA引物的伸長(zhǎng)反應(yīng)條件為72V、3分鐘的各條件下，使用BioRad公司的熱循環(huán)儀，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下面簡(jiǎn)稱為PCR法)。此外，在本實(shí)施例中，除非特別指明，PCR法都在此條件下進(jìn)行。通過該P(yáng)CR法所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有HOM基因的大約0.9kb的DNA片段，并且利用Gene Clean Kit (BI0101公司制)進(jìn)行精制。該片段用限制酶EcoRI和BamHI消化，將所得到的0. 9kb的Ec0RI-BamHI片段利用連接試劑盒ver. I (寶酒造公司制)插入到預(yù)先被EcoRI和BamHI消化過的pHSG298(寶酒造制)的EcoRI/BamHI間隙中，將所得質(zhì)粒命名為pHOMl。(2) LDC分泌表達(dá)盒的制作作為用于使LDC在谷氨酸棒桿菌中組成性表達(dá)的啟動(dòng)子，選擇了卡那霉素抗性基因的啟動(dòng)子；作為分泌信號(hào)，選擇了通過Tat途徑進(jìn)行分泌的大腸桿菌的SufI ;作為L(zhǎng)DC基因，選擇了大腸桿菌的cadA。 首先，進(jìn)行卡那霉素抗性基因的啟動(dòng)子的克隆。參照數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中登記的PHSG299 (登記號(hào)M19415)的堿基序列，合成寡核苷酸引物(序列號(hào)3和序列號(hào)4)。將通過以質(zhì)粒PHSG299為擴(kuò)增模板并以寡核苷酸(序列號(hào)3)、(序列號(hào)4)為引物組的PCR法所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有卡那霉素抗性基因的啟動(dòng)子區(qū)域的0. 3kb的DNA片段,并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制。利用連接試劑盒ver. I將該片段插入到在質(zhì)粒載體pT7blue (Novagen公司制)的EcoRV切斷部位的3'末端添加有T堿基的間隙中，在所得到的質(zhì)粒中，在用限制酶HindIII和SacII進(jìn)行消化時(shí)，將成為3. 2kb的單一片斷的質(zhì)粒命名為PKMP I。接下來(lái)，進(jìn)行LDC基因的克隆。參照數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中登記的LDC基因(登記號(hào)M76411)的堿基序列，合成寡核苷酸引物(序列號(hào)5和序列號(hào)6 )。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以來(lái)源于大腸桿菌(大腸埃希氏菌ATCC10798)的用常規(guī)方法配制的基因組DNA溶液為擴(kuò)增模板、以寡核苷酸(序列號(hào)5、6)為引物組)所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC基因的2. Ikb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit來(lái)進(jìn)行精制。利用連接試劑盒ver. I將所得片段插入到在質(zhì)粒載體pT7blue的EcoRV切斷部位的3'末端添加有T堿基的間隙中，在所得到的質(zhì)粒中，在用HindIII和NcoI進(jìn)行消化時(shí)，將成為4. Okb的單一片斷的質(zhì)粒命名為pCADA。最后，合成了寡核苷酸引物(序列號(hào)7)，該引物融合了 LCD基因和作為分泌信號(hào)的與大腸桿菌的SufI的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列。此寡核苷酸引物的3'側(cè)設(shè)計(jì)有與LDC基因的5'側(cè)重復(fù)的區(qū)域。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以pCADA為擴(kuò)增模板、以寡核苷酸(序列號(hào)7、6 )為引物組)所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC基因的2. 2kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit來(lái)進(jìn)行精制(LDC基因片段I)。同時(shí)，合成了寡核苷酸引物(序列號(hào)8)，該引物融合了卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子和作為分泌信號(hào)的與大腸桿菌的SufI的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列。此寡核苷酸引物的5'側(cè)設(shè)計(jì)有與卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子的3'側(cè)重復(fù)的區(qū)域。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以pKMPl為擴(kuò)增模板、以寡核苷酸(序列號(hào)3、序列號(hào)8)為引物組)所得到的產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC基因的0. 4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制(卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子片段I)。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以所得到的LDC基因片段I和卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子片段I作為擴(kuò)增模板、以設(shè)計(jì)有限制酶BamHI序列的寡核苷酸引物(序列號(hào)9)和設(shè)計(jì)有限制酶SphI序列的寡核苷酸引物(序列號(hào)10)為引物組)所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC分泌表達(dá)盒的2. 6kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制。該片段用限制酶BamHI和SphI進(jìn)行消化，將所得到的2. 6kb的BamHI-SphI片段利用連接試劑盒ver. I (寶酒造公司制)插入到預(yù)先使用BamHI和SphI消化過的pHOMl的BamHI/SphI間隙中，所得質(zhì)粒命名為pTM65。(4)pTM65向染色體的整合通過電穿孔法[FEMSMicrobiology Letters, 65，p. 299 (I989)]向 AK-1 菌株中導(dǎo)入質(zhì)粒pTM65后,在含有卡那霉素(25 ii g/ml)的LB (胰蛋白胨(10g/l) (Bacto公司制)、酵母提取物(5g/l) (Bacto公司制)、氯化鈉(10g/l))瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選取。從所選取的轉(zhuǎn)化株中以常規(guī)方法配制基因組DNA溶液。以該基因組DNA為模板，以寡核苷酸(序列號(hào)1) (序列號(hào)6)為引物組進(jìn)行PCR，將所得產(chǎn)物用I. 0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，此時(shí)觀察到3. 5kb的單ー的帶。由此能夠確認(rèn)，對(duì)于所選取的轉(zhuǎn)化珠，LDC基因被插入到HOM基因座中。將該轉(zhuǎn)化株命名為谷氨酸棒桿菌AK-l/pTM65 (簡(jiǎn)稱為AK-l/pTM65菌株)。實(shí)施例2 (向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的谷氨酸棒桿菌的制作)(其I :利用Sec途徑)( I) LDC分泌表達(dá)盒的制作下面，作為用于使LDC在谷氨酸棒桿菌中組成性表達(dá)的啟動(dòng)子，選擇了卡那霉素抗性基因的啟動(dòng)子；作為分泌信號(hào)，選擇了通過Sec途徑進(jìn)行分泌的作為枯草桿菌蛋白酶信號(hào)的arpE;作為L(zhǎng)DC基因，選擇了大腸桿菌的cadA。和實(shí)施例I 一祥，合成了寡核苷酸引物(序列號(hào)11)，該引物融合了 LDC基因和作為分泌信號(hào)的與arpE的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列。此寡核苷酸引物的3'側(cè)設(shè)計(jì)有與LDC基因的5'側(cè)重復(fù)的區(qū)域。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以pCADA為擴(kuò)增模板，以寡核苷酸(序列號(hào)11、序列號(hào)6)為引物組)所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC基因的2. 2kb的DNA片段，井利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制(LDC基因片段2)。同時(shí)，合成了寡核苷酸引物(序列號(hào)12)，該引物融合了作為分泌信號(hào)的與arpE的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列和卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子。此寡核苷酸引物的5'側(cè)設(shè)計(jì)有與卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子的3'側(cè)重復(fù)的區(qū)域。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以pKMPl為擴(kuò)增模板、以寡核苷酸(序列號(hào)3、序列號(hào)12)為引物組)所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC基因的0. 4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制(卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子片段2)。將通過PCR法(該P(yáng)CR法以所得到的LDC基因片段2和卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子片段2作為擴(kuò)增模板、以寡核苷酸引物(序列號(hào)9)和(序列號(hào)10)為引物組)所得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC分泌表達(dá)盒的2. 6kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制。將該片段用限制酶BamHI和SphI進(jìn)行消化，將所得到的2. 6kb的BamHI-SphI片段利用連接試劑盒ver. 1(寶酒造公司制)插入到預(yù)先使用BamHI和SphI消化過的pHOMl的BamHI/SphI間隙中，所得質(zhì)粒命名為pTM66。
(2)pTM66向染色體的整合通過電穿孔法[FEMSMicrobiology Letters, 65，p. 299 (1989)]向 AK-1 菌株中導(dǎo)入質(zhì)粒pTM66后,在含有卡那霉素(25 ii g/ml)的LB (胰蛋白胨(10g/l) (Bacto公司制)、酵母提取物(5g/l) (Bacto公司制)、氯化鈉(10g/l))瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選取。從所選取的轉(zhuǎn)化株中以常規(guī)方法配制基因組DNA溶液。以該基因組DNA為模板，以寡核苷酸(序列號(hào)I、序列號(hào)6)為引物組進(jìn)行PCR，將所得產(chǎn)物用I. 0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，此時(shí)觀察到3. 5kb的單一的帶。由此能夠確認(rèn)，對(duì)于所選取的轉(zhuǎn)化株，LDC基因被插入到HOM基因座中。將該轉(zhuǎn)化株命名為谷氨酸棒桿菌AK-l/pTM66 (簡(jiǎn)稱為AK-l/pTM66菌株)。對(duì)比例I (不向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的谷氨酸棒桿菌的制作) 用Hindi 11和NcoI對(duì)pKMP I進(jìn)行消化，將所得產(chǎn)物用I. 2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子區(qū)域的0. 3kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制。將所得到的HindIII-NcoI片段利用連接試劑盒ver. I插入到預(yù)先使用HindIII和NcoI消化過的pCADA的Hindlll/Ncol間隙中，所得質(zhì)粒命名為pTMlOO。接下來(lái)，用SacII對(duì)pTMlOO進(jìn)行消化，將產(chǎn)物用I. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，從凝膠中切割出含有LDC表達(dá)盒的2. 4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit進(jìn)行精制。將所得SacII片段利用連接試劑盒ver. I插入到預(yù)先使用SacII消化過的pHOMl的SacII間隙中，所得質(zhì)粒命名為PTM101。通過電穿孔法[FEMSMicrobiology Letters, 65，p. 299 (1989)]向 AK-1 菌株中導(dǎo)入質(zhì)粒PTMlOl后，在含有卡那霉素(25iig/ml)的LB (胰蛋白胨(10g/l) (Bacto公司制)、酵母提取物(5g/l) (Bacto公司制)、氯化鈉(10g/l))瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選取。從所選取的轉(zhuǎn)化株中以常規(guī)方法配制基因組DNA溶液。以該基因組DNA為模板，以寡核苷酸(序列號(hào)5)(序列號(hào)6)為引物組進(jìn)行PCR，將所得產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，此時(shí)觀察到2. Ikb的單一的帶。由此能夠確認(rèn)，關(guān)于所選擇的轉(zhuǎn)化株，LDC基因被插入到HOM基因座中。將該轉(zhuǎn)化株命名為谷氨酸棒桿菌AK-1/pTMlOl (以下簡(jiǎn)稱為AK-I/pTMlOl 菌株)。實(shí)施例3 (向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶活性的確認(rèn))將AK-l/pTM65 菌株、AK-l/pTM66 菌株和 AK-1/pTMlOl 菌株用 BY 培養(yǎng)基(參考 J. Bacteriol.，159，p. 306-311 (1984))進(jìn)行培養(yǎng)后，通過離心分離，分為微生物和培養(yǎng)上清液。使用常規(guī)方法破碎微生物，配制微生物破碎液。測(cè)定所得培養(yǎng)上清液和微生物破碎液中的賴氨酸脫羧酶活性(參考 Biosci. Biotechnol. Biochem.，71，p. 2130-2135，(2007))。關(guān)于酶活性，將I分鐘內(nèi)Inmol的L-賴氨酸向尸胺的轉(zhuǎn)換作為1U，將結(jié)果以每蛋白質(zhì)重量的比活性示于表I中。[表I]
權(quán)利要求
1.一種尸胺的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物。
2.權(quán)利要求I所述的尸胺的制備方法，其特征在于，向用于培養(yǎng)所述微生物的培養(yǎng)基中添加賴氨酸。
3.權(quán)利要求I或2所述的尸胺的制備方法，其特征在于，通過使在賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列的N末端側(cè)添加有分泌信號(hào)肽的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所述微生物向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶。
4.權(quán)利要求3所述的尸胺的制備方法，其特征在于，所述微生物通過具有基因構(gòu)建體，使得在賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列的N末端側(cè)添加有分泌信號(hào)肽的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其中所述基因構(gòu)建體在核酸序列的5'到3'方向上包含在該微生物中起作用的啟動(dòng)子序列、編碼分泌信號(hào)肽的核酸序列、以及編碼賴氨酸脫羧酶的核酸序列。
5.權(quán)利要求3或4所述的尸胺的制備方法，其特征在于，所述分泌信號(hào)肽為序列號(hào)13至43中的任一氨基酸序列所表示的肽。
6.權(quán)利要求I至5中任意一項(xiàng)所述的尸胺的制備方法，其特征在于，賴氨酸脫羧酶來(lái)源于大腸桿菌。
7.權(quán)利要求I至6中任意一項(xiàng)所述的尸胺的制備方法，其特征在于，所述微生物為棒狀桿菌或大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種尸胺的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)向細(xì)胞外分泌賴氨酸脫羧酶的微生物，該尸胺制備方法能夠抑制副產(chǎn)物賴氨酸的產(chǎn)生，而且與傳統(tǒng)的制備方法相比，尸胺對(duì)糖收率提高，并且可以降低在精制用作聚酰胺原料的尸胺時(shí)的精制工序中的負(fù)荷。
文檔編號(hào)C12P13/00GK102770550SQ201180010538
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者澤井秀樹, 耳塚孝, 須田和美 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社