專利名稱：肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)中的人類染色體4的單核苷酸多形性 ...的制作方法
肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(I NPP4b-基因)中的人類染色體4的單核苷酸多形性用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷本發(fā)明涉應(yīng)用人類4號染色體上肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)在堿基位143470133 (rsl3102150)上堿基的單核苷酸多形性(SNP)，來診斷或者預(yù)診斷多發(fā)硬化癥，或者檢測患多發(fā)硬化癥的風(fēng)險。導(dǎo)致神經(jīng)組織退化的疾病包括青年和老年中多種不同的紊亂。此類疾病導(dǎo)致大腦中和/或脊髓中功能活性神經(jīng)元的減少。神經(jīng)元的壞死會有不同的原因?qū)е碌鞍踪|(zhì)或蛋白質(zhì)片段的沉積，新陳代謝出問題，中毒，炎癥，血流不暢或者頭部受傷。例如在中風(fēng)的時候，所有這些因素引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步大量流失。在其它情況中，它們引起特殊神經(jīng)兀組和官能系統(tǒng)的損傷，例如在帕金森癥(PD)中或者在肌委縮側(cè)索硬化癥(ALS)中。然而各個病癥的臨床特征或模式經(jīng)常很難加以區(qū)分。這給明確診斷所需要的檢查 帶來了困難。另外，不同疾病的進(jìn)程也差異很大。因此，對于一些罕見的病癥經(jīng)常在尸檢時才第一次能夠準(zhǔn)確確定疾病。在年輕人群中，多發(fā)硬化癥(MS)很大程度上代表了神經(jīng)退行性疾病。多發(fā)硬化癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(ZNS)的一種慢性炎癥自身免疫系統(tǒng)疾病。該疾病特征在于神經(jīng)髓鞘的損壞，所述髓鞘包圍神經(jīng)細(xì)胞的軸突。在多發(fā)硬化癥(MS)的早期階段，患者通常可以完全從癥狀中恢復(fù)。然而保留了結(jié)構(gòu)性損傷，并且臨床損傷的可能性隨著每一次復(fù)發(fā)而提高。損傷大多局限在腦白質(zhì)的病灶區(qū)域。結(jié)構(gòu)性改變引起不同的臨床病癥，例如視覺障礙，行走問題，共濟(jì)失調(diào)，感覺異常，肌無力和輕癱，以及語言和協(xié)調(diào)障礙，且還伴有神經(jīng)病學(xué)癥狀。多發(fā)硬化癥(MS)的原因始終還是未知的。疾病通常在20到30歲之間的年輕成年人中已經(jīng)開始，其中女性明顯更多。多發(fā)硬化癥(MS)為自身免疫疾病，他在組織上的特征在于外周炎癥細(xì)胞的浸潤，其中大多涉及到T和B淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞位于局部受損點上的白質(zhì)中，它們在那里與髓鞘相互作用。由于髓鞘的損壞，軸突遭到暴露。在健康狀態(tài)下，動作電位通過在郎飛氏節(jié)上的跳躍性傳導(dǎo)進(jìn)行傳遞。該節(jié)是在軸突上的兩個少突膠質(zhì)細(xì)胞之間完全沒有或者僅具有少量的髓鞘而形成的。損壞的軸突隔離不僅破壞跳躍性傳導(dǎo)而且還因為離子濃度的改變導(dǎo)致代謝問題。對于多發(fā)硬化癥(MS)的疾病原因僅僅存在一些推測，即遺傳因素或者環(huán)境影響也許能夠在疾病的進(jìn)程中起到一定作用。生物因素的參入同樣被討論過。尤其是用于多發(fā)硬化癥(MS)的基因指示劑是值得期待的，因為以此方式可能有明確的診斷。至今的學(xué)說表明，患多發(fā)硬化癥(MS)發(fā)病率的提高與人類白細(xì)胞抗原(HLA)DR2的存有相關(guān)性。HLA-DR2是HLA部分中用于多發(fā)硬化癥(MS)明確的基因指示劑之一。除了 HLA-DR2-單體，其他人還調(diào)整了 HLA部分中的用于多發(fā)硬化癥(MS)的敏感性位點，例如HLA-DR3。然而遺傳學(xué)研究表明，其它遺傳因素對用于多發(fā)硬化癥(MS)的敏感性也有影響。因此致力于尋找其它基因指示劑。本發(fā)明的目標(biāo)在于，找到更多與多發(fā)硬化癥相關(guān)的基因指示劑。在人類范圍中，該任務(wù)將通過在肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)中人類4號染色體的堿基位143470133 (rsl3102150)上堿基的單核苷酸多形性來完成，其用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷，或者用于確定患多發(fā)硬化癥的風(fēng)險，并為此找到應(yīng)用領(lǐng)域。尋找參與多基因疾病例如多發(fā)硬化癥(MS)的基因是非常復(fù)雜和大規(guī)模的。使用不同遺傳作圖組合，其中，首先使用動物模型。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是用于多發(fā)硬化癥(MS)的動物模型。以此方法能夠從小鼠到較高級的靈長類動物的不同種物種中引起疾病。動物模型與人類疾病具有較高的一致性，例如伴隨復(fù)發(fā)和康復(fù)階段的急、慢性疾病，像中樞神經(jīng)系統(tǒng)(ZNS)的白質(zhì)中的脫髓鞘。在小鼠實驗中能夠以兩種不同的方式引起自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，也就是說，借助活性的或者適應(yīng)性的免疫?；钚砸呙缱⑸浒ɡ鐜в兴枨实鞍鬃陨砜乖拿庖呋蛘邘в屑顾鑴蛸|(zhì)的免疫。適應(yīng)性免疫是給小鼠接種之前免疫過的老鼠淋巴結(jié)細(xì)胞自或者接種激活的抗原特異性T細(xì)胞系。為了分析而使用誘發(fā)電位(EPs)。誘發(fā)電位當(dāng)病人被刺激后在其效應(yīng)器官被記錄到的電位。例如在這里值得一提的是肌肉萎縮。誘發(fā)電位(EPs)表明是否存在損傷。能 夠使用不同的誘發(fā)電位(EPs)用于診斷，例如視覺誘發(fā)電位(VEPs)或運動機能誘發(fā)電位(MEPs)0為了診斷而使用大腦電刺激來引起肢體肌肉中的運動機能誘發(fā)電位(MEPs)。由于髓鞘質(zhì)分離的損傷導(dǎo)致神經(jīng)元傳導(dǎo)的暫時擴散，由此得到變化了的腦皮質(zhì)引發(fā)回應(yīng)。腦皮質(zhì)運動機能誘發(fā)電位(cMEP)提供生理學(xué)狀況的定量數(shù)據(jù)，并且因此尤其適合于功能研究。多發(fā)硬化癥(MS)和自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是綜合疾病，許多位點(基因位點)參與其中，它能夠具有表型作用(數(shù)量性狀位點，QTL)。數(shù)量性狀位點(QTL)是定量的特征位置，也就是說，基因組上的變量點影響確定的特征。當(dāng)多于一個的基因參與到該項疾病中時，這些點的發(fā)現(xiàn)對尋找關(guān)于疾病的基因非常有幫助，。因為特征并非由一個單獨的基因所構(gòu)成，所以每個參與的基因都限制該特征。為了鑒定用于不同特征(特點)的備選基因而使用數(shù)量性狀位點(QTL)作圖。在小鼠實驗中，為了數(shù)量性狀位點(QTL)作圖在受控的環(huán)境條件下而使用近親繁殖株，例如C57BI/6、SJL、FVB 和 C57BL/10. S。為了基因位點的作圖而使用不同的基因標(biāo)記，例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs),高變限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)，小衛(wèi)星，微衛(wèi)星或者單核苷酸多形性(SNPs)0 QTL EAE 31是意義重大的。因為一個單獨的數(shù)量性狀位點(QTL)就能夠包含上百個基因，所以為接下來的研究選擇單個的備選基因是要求很高的。因此為了確定精確的染色體位點，補充的精細(xì)作圖是必要的。為此而使用的是建立同類品系，重組選擇和進(jìn)一步的交叉品系。制造株的第一選項是回交群體的產(chǎn)生。回交株包含F(xiàn)l個體與雙親株之一的配對(參見

圖1B)。交叉代將通過Fl代同胞的配對來制造，這樣得到混合的F2群體(參見圖1B)。不同表型的兩株混合群體的分析是可能的。為了數(shù)量性狀位點作圖和染色體位點作圖而應(yīng)用軟件工具。不同鼠種系之間的差別能夠借助高密度基因標(biāo)記或者通過建立種類分布模型來分析。此外，單核苷酸多形性(SNPs)能夠指明近親繁殖株之間系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系?？赡芡ㄟ^比較數(shù)量性狀位點(QTL)區(qū)域中不同鼠種的單核苷酸多形性(SNPs)來確定哪些片段相同或者擁有不同的起源。根據(jù)單核苷酸多形性(SNPs)能夠?qū)⒅陝澐值絾误w型子群中。單核苷酸多形性(SNPs)有助于將信息與表型數(shù)據(jù)相組合。
另一方法是比較基因組(genomic)。根據(jù)不同種(例如大鼠、小鼠、人類，參加圖2)的遺傳學(xué)比較能夠確定共同的序列片段。另外能夠確定基因位點、高度保守區(qū)或者未編碼DNA的數(shù)量。不同物種間疾病基因位點之內(nèi)的高度保守區(qū)能夠借助比較基因組來確定。這加快了可能疾病基因的分離。單體型分析用于數(shù)量性狀位點(QTL) (EAE31)的精細(xì)作圖，單體型分析使用相互遺傳學(xué)分析和基因表達(dá)譜。在此，肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)被確定為鼠8號染色體上的最佳候選基因(參見圖3)。
Inpp4b (蛋白質(zhì))是不依賴于Mg2+的磷酸酶，它催化磷脂_3，4_雙磷酸鹽的4位置上的磷酸鹽的水解,肌醇-1，3，4-三磷酸鹽的水解和肌醇_3，4-雙磷酸鹽的水解。小鼠蛋白質(zhì)與人類有96%同源性相同，與大鼠有90%的同源性。為了找到序列中的區(qū)，Inpp4b基因作為最佳備選基因序列在兩種鼠類中被測序，即有抵抗能力的種C57BL/10. S和易受感染的種SJL。有抵抗能力的種抵抗EAE誘導(dǎo)，易受感染的種與EAE誘導(dǎo)反應(yīng)。序列差別與已知的多形性比較，多形性導(dǎo)致人類中氨基酸變異。SJL和C57BL/10.S中Inpp4b的編碼序列在pGEM-T-簡易-載體中克隆(promega),并且在cDNA中得到兩個SNP 區(qū)別，它們導(dǎo)致氨基酸(AS)的轉(zhuǎn)移cl434C/A (AS 478S/R)和 cl655A/C (AS 552H/P)。為了弄清是否一個或兩個SNPs通過EAE易感染性決定而制造DNA結(jié)構(gòu)，其各自包含一個突變(或者絲氨酸一精氨酸，或者組胺酸一脯氨酸)或者兩個突變。由原核注射制造出轉(zhuǎn)基因老鼠。EAE的誘導(dǎo)中證實，兩個SNPs都很重要。對于小鼠定位在8號染色體上的Inpp4b基因在人類身上位于4號染色體上。該基因自身是已知的，序列例如在安德森等“克隆cDNA和肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2特征”，J. Biolog. Chem. 1997，272卷，38號，23859-23864頁中描述出。此外，該基因例如編目在ENSEMBL數(shù)據(jù)庫中(染色體4:142，949，186-143，383，906)。已知三種剪切體，即阿爾法、短型阿爾法和貝塔。在短型阿爾法剪切體中缺少外顯子4。所有隨后關(guān)于各個SNPs的陳述與定義或者根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(Ensembl釋放56-2009年9月；智人譯本56. 37a (GRCh37))的編號有關(guān)。Inpp4b基因或者單個堿基關(guān)于染色體4編碼基因鏈的取向讀取。在相關(guān)性研究中檢驗了 MS病人，其中39個SNPs適合作為基因標(biāo)記。從身體樣本中提取DNA，并且在Inpp4b基因范圍內(nèi)辨認(rèn)各自序列。在研究中，總共349名被測試者加入到控制組中，他們并不患有多發(fā)硬化癥MS，其中210名女性，152名男性。在患病病人組中有362人，其中4人具有臨床獨立的并發(fā)癥狀，8人是初級進(jìn)行性的，3人進(jìn)行性復(fù)發(fā)，244人在康復(fù)階段，并且90人是次級進(jìn)行性。SNP標(biāo)簽的選取借助Haploview軟件中的Tagger算法選取39個SNPs標(biāo)簽,這覆蓋了 Inpp4b基因之內(nèi)所有通常的單體型(http://www/broad. -mit. edu/mpg/tagger, www. hapmap. org)。算法基于r2。在SNPs之間使用嚴(yán)格的r2限定值(r2 > O. 8)允許所選取的SNPs標(biāo)簽，它們解決大部分存在的單體型(參見Altshuler D, Brooks LD, Chakravarti A, CollinsFSj Daly MJ & Donnelly P 2005International HapMap consortium a haplotype map ofthe human genome, Nature 437, 1299-1320;Barrett JCj Fry Bj Mailer J & Daly MJ 2005Haploview:analysis and visualization of LD and haplotype maps, Bioinformatics21,263-265)。選取較小等位基因頻率(MAFs, minor allele frequencies)大于 0· 5 的SNPs。SNP基因分型使用QIAamp DNA Blood Mini Kits (Diagen,USA)從外周血白細(xì)胞中提取遺傳學(xué)DNA。所有SNPS的基因分型借助5’-核酸外切酶-檢測(TaqMan assays on demand; AppliedBiosystems, Inc.,ABIFoster City, CA)來實現(xiàn),其中，使用生產(chǎn)者提供使用的引物。探針的突光信號按照制造商說明來檢測(TaqMan Assay for Real-Time PCR, 7500 Real TimePCR System;ABI)。為每一位被測試者確定EDSS，其表明疾病嚴(yán)重程度(Expanded DisabilityStatus Scale)。為了測試疾病易感染性種群以及為了測試EDSS值而應(yīng)用Cochran-Armitage-Trend測試。所有被研究的SNPs的結(jié)果列在表I中?！皉sX XXXXXXX ”的表述是根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記，人類染色體4上的SNP所代表的堿基對列在了第二欄中，P欄給出了所得電勢值。Al欄給出了正常堿基，A2欄是SNPs的堿基。在此rsl31021504:143470133 (編碼基因鏈，正鏈)，rs2059510[4:143459907 (編碼基因鏈，正鏈)和rsl7717651 [4:143453079 (編碼基因鏈，正鏈)具有顯著性，其中尤其rsl3102150是很重要的(2010年I月11日的Ensembl數(shù)據(jù)庫記錄)。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用人類4號染色體上肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)在堿基位143470133 (rsl3102150)上堿基的單核苷酸多形性(SNP)，來診斷或者預(yù)診斷多發(fā)硬化癥，或者檢測患多發(fā)硬化癥的風(fēng)險。。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單核苷酸多形性，其特征在于，所述多形性是通過腺嘌呤在堿基位143470133 (rsl3102150)更換掉堿基胞嘧啶。
3.單體型，其包括在肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因中人類染色體4的堿基位 143470133 (rsl3102150)、堿基位 143459907 (rs2059510)和堿基位 143453079(rsl7717651)上堿基的單核苷酸多形性(SNPs)，用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷，或者用于確定患多發(fā)硬化癥的風(fēng)險。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單體型，其特征在于，所述多形性包括堿基胞嘧啶通過腺嘌呤在堿基位143470133 (rsl3102150)上的更換，堿基胸腺嘧啶通過胞嘧啶在堿基位143459907 (rs2059510)上的更換和堿基胞嘧啶通過腺嘌呤在堿基位143453079(rsl7717651)上的更換。
5.用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷，或者用于確定被測試者患多發(fā)硬化癥風(fēng)險的方法，其特征在于，至少分析在肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因中人類染色體4的堿基位143470133 (rsl3102150)上的堿基，其中，對于在那里其他堿基取代胞嘧啶而存在的情況，將被測試者診斷為多發(fā)硬化癥(MS)，或者將被測試者歸于高患病風(fēng)險。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷，或者用于確定被測試者患多發(fā)硬化癥風(fēng)險的方法，其特征在于，對于以下情況，即腺嘌呤在肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因中人類染色體4的堿基位143470133(rsl3102150)上取代胞嘧啶而存在，那么將被測試者診斷為多發(fā)硬化癥(MS)，或者將被測試者歸于高患病風(fēng)險。
7.用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷，或者用于確定被測試者患多發(fā)硬化癥風(fēng)險的方法，其特征在于，至少分析肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)中人類染色體4的堿基位143470133 (rsl3102150)、堿基位143459907 (rs2059510)和堿基位143453079 (rsl7717651)上的堿基，其中對于如下情況，即其他堿基在堿基位143470133上代替胞嘧啶，和另一個堿基在堿基位143459907上代替胸腺嘧啶，和另一個堿基在堿基位143453079上代替胞嘧啶，那么將被測試者診斷為多發(fā)硬化癥(MS)，或者將被測試者歸于高患病風(fēng)險。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于多發(fā)硬化癥的診斷或者預(yù)診斷，或者用于確定被測試者患多發(fā)硬化癥風(fēng)險的方法，其特征在于，即腺嘌呤在堿基位143470133上代替胞嘧啶，和胞嘧啶在堿基位143459907上代替胸腺嘧啶，和腺嘌呤在堿基位143453079上代替胞嘧啶，那么將被測試者診斷為多發(fā)硬化癥(MS)，或者將被測試者歸于高患病風(fēng)險。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任意一項所述的方法，其特征在于，提取被測試者的身體材料，優(yōu)選細(xì)胞和/或組織材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任意一項所述的方法，其特征在于，提取被測試者的血樣。
11.根據(jù)權(quán)利要求65-10中任意一項所述的方法,其特征在于,從身體材料,優(yōu)選的為細(xì)胞和/或組織材料中，優(yōu)選的從血樣中分離獲得的待研究的DNA，并在隨后進(jìn)行測序鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉應(yīng)用人類4號染色體上肌醇聚磷酸鹽-4-磷酸酶-類型2-基因(INPP4b-基因)在堿基位143470133(rs13102150)上堿基的單核苷酸多形性(SNP)，來診斷或者預(yù)診斷多發(fā)硬化癥，或者檢測患多發(fā)硬化癥的風(fēng)險。
文檔編號C12Q1/68GK102947466SQ201180010607
公開日2013年2月27日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者薩利赫·易撲拉欣 申請人:免疫基因股份公司