專利名稱：用于靶向遞送siRNA的組合物的制作方法
用于靶向遞送siRNA的組合物將多核苷酸和其他基本不能穿透細(xì)胞膜的化合物遞送到活細(xì)胞受到細(xì)胞復(fù)雜膜系統(tǒng)的限制。反義、RNAi和基因治療中使用的藥物是相對(duì)高親水性的聚合物，且通常帶較高負(fù)電荷。這些物理特征均阻止其直接擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜?；诖嗽?，多核苷酸遞送的主要障礙是將多核苷酸遞送穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。一種已經(jīng)用于體內(nèi)遞送小核苷酸的方法是將所述核酸與小靶分子或脂質(zhì)或固醇結(jié)合。雖然已在這些偶聯(lián)物中觀察到一些遞送和活性，但這些方法需要的核酸劑量非常大。已開發(fā)大量轉(zhuǎn)染試劑，其能實(shí)現(xiàn)體外將多核苷酸相當(dāng)有效地遞送到細(xì)胞。然而，用這些相同轉(zhuǎn)染試劑體內(nèi)遞送多核苷酸很復(fù)雜且由于體內(nèi)毒性、血清相互作用和弱靶向而變得無效。體外作用良好的轉(zhuǎn)染試劑，陽離子聚合物和脂質(zhì)，通常形成大的靜電顆粒并使細(xì)胞膜不穩(wěn)定。體外轉(zhuǎn)染試劑的正電荷有助于通過電荷之間(靜電)的相互作用與核酸結(jié)合，因此形成核酸/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。正電荷還有益于載劑與細(xì)胞非特異性結(jié)合以及膜融合、去 穩(wěn)定化或破壞。膜的去穩(wěn)定化有利于充分遞送不能滲透細(xì)胞膜的多核苷酸穿過細(xì)胞膜。雖然這些特性有利于核酸體外轉(zhuǎn)移，但它們會(huì)造成體內(nèi)毒性和靶向失效。陽離子電荷與血清組分相互作用，導(dǎo)致多核苷酸轉(zhuǎn)染試劑相互作用的不穩(wěn)定和較低的生物利用率和靶向。體外有效的轉(zhuǎn)染試劑膜活性在體內(nèi)常導(dǎo)致毒性。為了體內(nèi)遞送，載劑(核酸和結(jié)合的遞送劑)應(yīng)較小，直徑低于lOOnm，優(yōu)選低于50nm。低于20nm或低于IOnm的更小復(fù)合物會(huì)更有用。大于IOOnm的遞送載劑體內(nèi)很少能穿過除了血管細(xì)胞之外的細(xì)胞。靜電相互作用形成的復(fù)合物在暴露于生理鹽濃度或血清組分時(shí)傾向于聚集或瓦解。此外，體內(nèi)遞送載劑上的陽離子電荷導(dǎo)致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高的負(fù)電荷還可通過干擾靶向所需的相互作用來抑制體內(nèi)遞送。因此，體內(nèi)分布和靶向需要接近中性的載劑。不經(jīng)過仔細(xì)的調(diào)控，膜的破壞或去穩(wěn)定活性在體內(nèi)使用時(shí)有毒。用核酸遞送平衡載劑毒性體外比體內(nèi)更容易實(shí)現(xiàn)。Rozema等在美國(guó)專利公開20040162260中證明了膜活化多胺可逆調(diào)控膜破壞活性的方式。所述膜活化多胺提供了破壞細(xì)胞膜的方法。PH依賴性可逆調(diào)控提供將活性限制在靶細(xì)胞內(nèi)涵體中的方法，以此限制毒性。其方法依賴于含2-丙酸-3-甲基馬來酸酐的多胺上的胺修飾。
權(quán)利要求
1.一種用于體內(nèi)遞送寡核苷酸到肝臟細(xì)胞的組合物，所述組合物包括 a)共價(jià)連接于至少具有20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)的寡核苷酸；和 b)可逆掩蔽和靶向的兩親性聚合物，所述聚合物包括從含胺單體、含低疏水性基團(tuán)單體和含高疏水性基團(tuán)單體合成的三元共聚物，其中多種半乳糖衍生物和PEG基團(tuán)通過pH不穩(wěn)定的雙取代馬來酸鍵與所述聚合物單獨(dú)連接，且其中所述PH不穩(wěn)定的雙取代馬來酸鍵的切割產(chǎn)生胺基，從而生成膜活化多胺。
2.一種用于體內(nèi)遞送寡核苷酸到肝臟細(xì)胞的組合物，所述組合物包括 a)共價(jià)連接于半乳糖三聚體的寡核苷酸；和 b)可逆掩蔽和靶向的兩親性聚合物，所述聚合物包括從含胺單體、含低疏水性基團(tuán)單體和含高疏水性基團(tuán)單體合成的三元共聚物，其中多種半乳糖衍生物和PEG基團(tuán)通過pH不穩(wěn)定的雙取代馬來酸鍵與所述聚合物單獨(dú)連接，且其中所述PH不穩(wěn)定的雙取代馬來酸鍵的切割產(chǎn)生胺基，從而生成膜活化多胺。
3.用于體內(nèi)遞送RNA干擾多核苷酸到肝臟細(xì)胞的偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括
4.一種生產(chǎn)RNA寡核苷酸遞送組合物的方法，所述方法包括 a)形成膜活化多胺； b)形成包括含半乳糖衍生物的電荷中性雙取代馬來酸酐的第一掩蔽劑； c)形成包括含聚乙二醇的電荷中性雙取代馬來酸酐的第二掩蔽劑； d)可逆抑制膜活化多胺的膜活性，其中所述抑制由修飾所述多胺上50%或更多的胺組成，所述修飾通過將所述多胺與所述第一和第二掩蔽劑反應(yīng)，從而使多種半乳糖衍生物和多種聚乙二醇通過生理pH不穩(wěn)定的雙取代馬來酸連接膜活性多胺而實(shí)現(xiàn)，和 e)連接RNA干擾多核苷酸與半乳糖三聚體或具有至少20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)； f)在適合體內(nèi)給予的溶液中提供所述RNA干擾多核苷酸和可逆抑制的膜活化多胺。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述RNA干擾多核苷酸選自下組DNA、RNA、dsRNA、RNA 干擾多核苷酸、siRNA、和 miRNA。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述肝臟細(xì)胞由肝細(xì)胞組成。
7.如權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述膜活化聚合物含兩種或更多不同單體。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述膜活化聚合物由含胺單體、低疏水性基團(tuán)單體和高疏水性基團(tuán)單體組成。
9.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述可逆掩蔽的膜活化多胺溶于水。
10.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述膜活化多胺是隨機(jī)共聚物。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述隨機(jī)共聚物選自聚乙烯醚和聚丙稀Ife酷。
12.如權(quán)利要求1、2或8中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述含胺單體、低烷基單體和高烷基單體以4-8個(gè)含胺單體3-5個(gè)低疏水性基團(tuán)單體1個(gè)高疏水性基團(tuán)單體的比例存在。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述低疏水性基團(tuán)由丁基組成且所述聞疏水性基團(tuán)由十八燒基或十~■燒基組成。
14.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述掩蔽劑可逆連接所述多胺上至少70%的胺。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述掩蔽劑可逆連接所述多胺上至少80%的胺。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述可逆修飾聚合物在pH8時(shí)具有+30—30mV的ζ電勢(shì)。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述可逆修飾聚合在物ρΗ8時(shí)具有+20—20mV 的 ζ 電勢(shì)。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述可逆修飾聚合物在ρΗ8時(shí)具有+IO-IOmV 的 ζ 電勢(shì)。
19.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述可逆修飾聚合物在pH8時(shí)具有0—30mV的ζ電勢(shì)。
20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述可逆修飾聚合物在ρΗ8時(shí)具有O—20mV的ζ電勢(shì)。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述可逆修飾聚合物在ρΗ8時(shí)具有O-IOmV的ζ電勢(shì)。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中提供。
23.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，L2是馬來酸連接。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，L2是雙取代馬來酸連接。
25.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，N通過生理不穩(wěn)定連接L1連接Α。
26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其特征在于，L1是垂直于L2的生理不穩(wěn)定共價(jià)連接。
27.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，A包括具有20或更多碳原子的疏水基團(tuán)。
28.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，A包括半乳糖三聚體。
29.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述連接所述聚合物的半乳糖衍生物與PEG的比例為1:05. -2。
30.如權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述半乳糖衍生物由N-乙?；肴樘前方M成。
31.如權(quán)利要求2-30中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述半乳糖三聚體由N-乙?；肴樘前啡垠w組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及體內(nèi)靶向遞送RNA干擾(RNAi)多核苷酸到肝細(xì)胞的組合物。靶向的RNAi多核苷酸與共靶向的遞送聚合物一起給予。遞送聚合物提供膜滲透功能以將RNAi多核苷酸從細(xì)胞外移到細(xì)胞內(nèi)?？赡嫘揎椞峁?duì)所述遞送聚合物的生理響應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102869774SQ201180010758
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者P·海德威格, T·霍夫曼, E·A·基塔斯, D·L·劉易斯, P·莫爾, D·B·羅澤瑪, W·瑟爾, L·C·瓦利斯, D·H·維基菲爾德 申請(qǐng)人:箭頭研究公司